Abstrak

kromatografi afinitas adalah cara yang nyaman untuk memurnikan protein, sebagai tingkat kemurnian
yang tinggi dapat dicapai dalam satu langkah. Penggunaan oftags telah memberikan kontribusi untuk popularitas
ofthis teknik. Namun, penambahan tag mungkin tidak diinginkan atau mungkin untuk produksi biofarmasi. Ada
sehingga kebutuhan untuk disesuaikan ligan afinitas buatan. Kami telah mengembangkan penggunaan extremophilic
archaea protein sebagai perancah untuk menghasilkan protein afinitas (Affitins). Di sini, kami menjelajahi potensi
Affitins sebagai ligan untuk merancang kolom afinitas. Affitins khusus untuk imunoglobulin manusia G (hIgG),
PulD bakteri protein, dan telur ayam lisozim yang bergerak pada matriks agarosa. Kolom yang diperoleh fungsional
dan sangat selektif untuk sasaran kognitif mereka, bahkan di hadapan protein eksogen sebagai ditemukan dalam
media kultur sel, ascites dan lysates bakteri, yang menghasilkan tingkat kemurnian yang tinggi (~95%) dan
pemulihan (~100%) dalam satu langkah. Anti-hIgG Affitin kolom menahan siklus berulang pemurnian dan
perawatan pembersihan-di-tempat dengan 0,25 M NaOH serta Protein A tidak. Tingginya kadar Affitin produksi di
Escherichia coli memungkinkan untuk menghasilkan kolom afinitas ini dengan biaya rendah. Kami Hasil
memvalidasi Affitins sebagai kelas baru ligan disesuaikan untuk pemurnian kromatografi afinitas berpotensi setiap
protein yang menarik termasuk biofarmasi.

1. Pendahuluan
Dalam pembuatan protein terapeutik, kromatografi afinitas kontribusi signifikan untuk mengurangi biaya
pengolahan sebagai Gelar ofpurity tinggi dapat dicapai dalam satu langkah. Fusi protein untuk tag polipeptida,
seperti tag hexahistidine, secara luas digunakan untuk memfasilitasi pemurnian protein dengan kromatografi afinitas
[1]. Namun, pendekatan ini bermasalah ketika urut modifikasi yang tidak diinginkan dan tidak mungkin.
Dengan demikian, ligan spesifik untuk protein yang menarik dapat membantu untuk pemurnian afinitas.
Misalnya, Concanavalin A dan amilosa memungkinkan pemurnian glikoprotein [2] dan maltosa mengikat protein
[3], masing-masing. Di antara protein terapeutik, monoklonal antibodi yang sangat menarik, karena mereka
menyumbang sekitar setengah dari penjualan di Uni Eropa dan Amerika Serikat pada tahun 2010 [4]. Beberapa
protein permukaan bakteri telah diidentifikasi sebagai reagen afinitas dan biasanya digunakan untuk memurnikan
antibodi atau fragmen mereka. Mengikat kekhususan ofthese protein berbeda antara sumber spesies dan antibodi
subclass. Misalnya, Protein G dan Protein A dari kelompok G Streptococcus dan Staphylococcus aureus, masingmasing, mampu mengikat IgG terutama melalui wilayah Fc mereka [5,6], sementara Protein L dari
Peptostreptococcus magnus mengakui antibodi melalui rantai interaksi cahaya [7]. Protein A sangat mengikat IgG1
manusia, IgG2 dan IgG4 sementara Protein G sangat mengikat semua subclass manusia. Protein A dan G mengikat
kelinci IgG kuat, sedangkan Protein L mengikat
mereka lemah (lihat [8] untuk review.

Jadi, tergantung pada aplikasi, pilihan ligan kritis. Kelemahan utama dari ini pengikat yang ada adalah
bahwa mereka mungkin tidak sesuai dengan kebutuhan spesifik. Untuk protein non-antibodi, masalahnya adalah
bahkan lebih serius, seperti yang sering tidak ada mitra alami dikenal dengan sifat yang cocok untuk digunakan
sebagai reagen afinitas. Oleh karena itu, perlu mengembangkan reagen baru yang cocok untuk kromatografi afinitas
dengan kimia atau evolusi molekuler, dengan spesifisitas dan afinitas untuk protein bunga

Gambar 1. Urutan dari empat Affitins dipelajari dan skema untuk kopling mereka untuk amina-reaktif agarosa. (A)
Sac7 * 6, dan H4 memiliki kekhususan untuk bakteri protein PulD-N fragmen dan ayam HEWL, masing-masing,
sementara D1Sso7d dan D1Sso7d-DM memiliki kekhususan untuk Higgs. Residu umum untuk D1Sso7d dan
D1Sso7d-DM Affitins ditunjukkan oleh sebuah titik. (B) Sepuluh miligram setiap Affitin yang digabungkan dalam
PBS melalui amina mereka untuk matriks agarose N-Hydroxysuccinimide-diaktifkan untuk mempersiapkan kolom
afinitas. The Affitin dalam skema adalah model struktur D1Sso7d digambarkan sebagai pita hijau, dengan residu
diganti selama generasi situs mengikat IgG disorot dengan warna biru [28]. (Untuk interpretasi referensi untuk
warna dalam legenda angka ini, pembaca disebut versi web artikel ini.)
Desain berbasis struktur kimia dan mimetics peptidic telah digunakan untuk mendapatkan ligan buatan
untuk target seperti antibodi (lihat [9,10] diulas), insulin [11], dan plasminogen aktivator [12]. Meskipun beberapa
kemajuan telah dibuat dalam baru-baru ini tahun [13,14], memperoleh ligan dengan selektivitas yang didefinisikan
dengan baik adalah tidak mudah untuk dicapai. Pendekatan lain adalah untuk mengembangkan reagen afinitas dari
protein, disebut protein perancah alternatif, dengan desain protein kombinatorial. Misalnya, ini digunakan untuk
mengkonversi domain dari Protein A IgG-mengikat menjadi pengikat IgA [15] dan untuk mengisolasi pengikat Fc
dari dirancang ankyrin perpustakaan protein ulangi [16]. Banyak protein perancah alternatif telah diusulkan (Lihat
Ref. [17] dan [18] diulas), tetapi hanya sedikit dari mereka yang benar-benar dapat digunakan untuk aplikasiaplikasi, seperti kromatografi afinitas.

Idealnya, cocok untuk pemurnian afinitas, reagen afinitas harus (i) sangat spesifik untuk target yang akan
dimurnikan, (ii) menunjukkan biaya produksi yang efektif dan (iii) memiliki stabilitas termal dan kimia yang tinggi,
karena ini sering dikaitkan dengan siklus hidup kolom panjang. Untuk digunakan dalam sekali pakai kolom pakai,
juga penting bahwa reagen setidaknya tahan terhadap kondisi yang digunakan untuk elusi dari target. Selain itu,
untuk memastikan usabilitas aman dari kolom, afinitas reagen harus tahan terhadap pH basa ekstrim digunakan
untuk membersihkan-di-tempat (CIP) prosedur, yang merupakan bagian dari praktek manufaktur yang baik (GMP),
dan untuk meminimalkan produk kontaminasi oleh fragmen ligan pencucian.
Kami sebelumnya telah dijelaskan penggunaan kecil (7 kDa) hyperthermophilic archaea dan protein
Sac7d acidophilic dan yang homolog sebagai perancah untuk desain disesuaikan afinitas protein buatan (Affitins)
[19,20]. Menggunakan teknik kombinasi, kita memiliki dihasilkan Affitins dengan konstanta disosiasi di nanomolar
dan rentang subnanomolar, dan dengan spesifisitas untuk target mereka, seperti protein PulD bakteri [19,21,22],
lisozim telur ayam [20,23-26] dan IgG manusia [27,28]. Baru-baru ini, kami divalidasi dasar struktural dari dua
mode mereka mengikat dengan memecahkan struktur tiga Affitins di kompleks dengan target serumpun mereka
[25]. Affitins adalah kimia dan termal stabil (dari pH 0 sampai dengan 12, menuju deterjen dan agen chaotropic, dan
sampai 90 C). Kami telah menunjukkan bahwa adalah mungkin untuk lebih meningkatkan ofAffitins stabilitas
terhadap kondisi basa, hingga setidaknya pH 13, melalui grafting / strategi mutasi [28]. Selain itu, kami melaporkan
bahwa Affitins yang dioverproduksi di E. coli dengan hasil dari beberapa lusin untuk beberapa ratus miligram per
liter budaya. Dengan demikian, Affitins menunjukkan semua yang diinginkan properti untuk digunakan sebagai
reagen dalam kromatografi afinitas.
Di sini, untuk pertama kalinya, kami menyajikan penggunaan Affitins, kovalen bergerak dalam kolom,
sebagai reagen mampu selektif menangkap tiga protein yang tidak terkait dari campuran protein heterogen: IgG
manusia, protein PulD bakteri dan telur ayam lisozim putih (HEWL). Selain itu, untuk memperoleh wawasan
potensi proses pemurnian menggunakan Affitins, kita membandingkan beberapa anti-IgG Affitins dan Protein A
kolom untuk menilai ketahanan terhadap berulang CIP prosedur menggunakan natrium hidroksida. Hasil penelitian
kami menunjukkan potensi besar dari Affitins sebagai ligan dirancang untuk afinitas yang kuat kolom kromatografi.

2. Material and method

2.1 material
Affitins Sac7 * 6, H4, D1Sso7d dan D1Sso7d-DM diungkapkan di strain E. coli DH5 Iq dan dimurnikan
seperti yang dijelaskan sebelumnya [19,25,28]. IgG yang digunakan dalam penelitian ini dibeli dari Fluka: hIgG
(Yaitu IgG kolam renang dari serum manusia mengandung hIgG1, hIgG2, hIgG3, dan hIgG4); dan dari SigmaAldrich: hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4, kolam IgG dari mouse, tikus, domba, kambing, kelinci, dan babi. The PulDN protein diungkapkan dalam BL21 (DE3) E. regangan coli berubah dengan pCHAP3702 plasmid dan dimurnikan
seperti yang dijelaskan sebelumnya [29]. HEWL dibeli dari Sigma-Aldrich. Mouse asites mengandung hIgG1 (400 g
/ ml) diperoleh dari "de ProduksiProtines recombinantes et d'anticorps "platform (Institut Pasteur, Paris).
2.2 Imobilisasi dari Affitins pada matriks agarosa
Affitins dimurnikan monomer yang didialisis semalam melawan 130 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM
Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4 (PBS) dan dihitung spektrofotometri pada 280 nm menggunakan koefisien
kepunahan 15.220 M-1 cm-1 (anti-IgG Affitins D1Sso7d dan D1Sso7d-DM), 3840 M-1 cm-1 (anti-PulD Affitin
Sac7 * 6) dan 13.940 M-1 cm-1 (anti-HEWL Affitin H4). Semua langkah berikut prosedur kopling kolom yang
melibatkan dilakukan dengan menggunakan jarum suntik. Salah satu mililiter Affitin (10 mg / ml) adalah
disuntikkan ke 1 ml HiTrap N-Hydroxysuccinimide (NHS) -activated HP kolom (GE Healthcare) sebelumnya
memerah dengan 6 ml es dingin 1 mM HCl. Imobilisasi terjadi pada suhu kamar selama 30 menit. Kemudian, kolom
dicuci dengan 3 ml PBS. Ini 3 ml fraksi mengandung Affitins yang tidak bergerak, dicampur dengan kelompok NHS
dilepaskan selama reaksi coupling. NHS menunjukkan kuat serapan pada 280 nm pada pH di atas 6. Untuk
memperkirakan jumlah bergerak Affitins, 1 ml dari fraksi ini diasamkan dengan 1 ml dari 2 M glisin HCl pH 2
kuantifikasi sebelum pada 280 nm menggunakan disebutkan di atas koefisien kepunahan. Untuk menonaktifkan
setiap kelompok aktif yang tersisa, kolom dicuci dan diseimbangkan dengan 6 ml buffer A (0,5 M etanolamin, 0,5 M
NaCl, pH 8,3), maka dengan 6 ml buffer B (0,1 M asetat, 0,5 M NaCl, pH 4), 6 ml buffer A (Selama 30 menit pada
suhu kamar), 6 ml buffer B, 6 ml buffer A dan 6 ml buffer B. Setelah imbang akhir dengan 6 ml PBS, yang Kolom
siap untuk digunakan
2.3 Persiapan sampel yang heterogen yang mengandung Higgs

Sampel heterogen disusun sebagai berikut. Dulbecco Modifikasi Eagle Medium (DMEM) + 10% serum janin anak
sapi (FCS) (DMEM / FCS) telah dibubuhi Higgs untuk konsentrasi akhir 125 g / ml. E. coli ekstrak kasar dibuat dari
DH5 Iq regangan (5X terkonsentrasi dari budaya awal) juga dibubuhi Higgs untuk konsentrasi akhir 125 g / ml

2.4 Persiapan E. coli yang larut dalam ekstrak kasar yang mengandung PulD-N
Bakteri dari budaya satu-liter BL21 (DE3) E. coli strain yang telah menghasilkan PulD-N (lihat Bagian
2.1) dipanen dengan sentrifugasi dan resuspended dalam 30 ml PBS. Sel dianalisis dengan Avestin Emulsiflex
homogenizer dan sel debris dibuang di langkah sentrifugasi. supernatan ini digunakan untuk studi kromatografi
afinitas.
2.5 Persiapan sampel yang heterogen yang mengandung HEW
DMEM / FCS itu dibubuhi HEWL untuk konsentrasi akhir 125 g / ml dan digunakan untuk studi
kromatografi afinitas
2.6 kromatografi afinitas
Semua pemurnian dilakukan pada laju alir 1 ml / menit menggunakan baik sebagai KTApurifier 10
sistem (untuk PulD-N) atau biologis Bio-Rad DuoFlow 10 sistem (untuk HEWL dan IgG) dan kolom afinitas dibuat
seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2.2 dengan PBS sebagai running buffer. Untuk perbandingan dengan Protein A
sistem pemurnian, 1 ml HiTrap Protein A HP kolom (GE Healthcare) juga digunakan.
Sekitar 125 g setiap IgG murni digunakan untuk mempelajari selektivitas kolom anti-IgG Affitin.
Kekhasan D1Sso7d dan kolom D1Sso7d-DM diuji dengan memuat sampel heterogen yang mengandung 125 g IgG
(Bagian 2.3). Satu mililiter setengah larut E. coli ekstrak kasar yang mengandung PulD-N (Bagian 2.4) adalah
disuntikkan ke kolom Sac7*6 bergerak. Sebuah heterogen sampel yang mengandung 125 g HEWL (Bagian 2.5)
disuntikkan ke H4 amobil kolom.
protein non-spesifik hanyut dengan PBS dan elusi dilakukan dengan langkah pH asam menggunakan
glisin 100 mM penyangga (pH 2,5, 150 mM NaCl). Kemurnian protein dielusi itu diperiksa dengan memuat pecahan
ke sebuah gel SDS. Gel diwarnai dengan PageBlue solusi protein pewarnaan (Thermo Scientific), dipindai dengan
GelDoc EZ Imager (Bio-Rad), dan dianalisis dengan Image Lab (Bio-Rad) dan software ImageJ.
2.7 Kinetika deaktivasi Affitins dan kolom Protein A dengan natrium hidroksida
Hambatan dari kolom afinitas untuk pembersihan-di-tempat (CIP) Prosedur pada pH basa dievaluasi
dengan 25 siklus afinitas pemurnian hIgG, termasuk elutions pada pH 2,5 dan perawatan 15 menit dengan 0,25 M
NaOH (15 menit pada laju alir 1 ml / menit). Untuk masing-masing berjalan, 1 ml dari 22 mg / ml hIgG di PBS telah
dimuat pada kolom afinitas. Kuantitas hIgG dielusi ditentukan untuk masing-masing siklus dengan mengukur
densitas optik di 280 nm.
3.

Hasil

Sebelumnya, kami merancang dan ditandai beberapa Affitins khusus untuk IgG manusia [27,28], protein
bakteri PulD-N [19,21,22] dan ayam HEWL [20,23,25] (Gambar. 1 A). Ketiga protein terkait dan dengan demikian
mewakili sistem yang berbeda yang menarik untuk menguji dengan berbagai Affitins untuk aplikasi kromatografi
afinitas.
kromatografi afinitas menggunakan anti-IgG Affitins
Affitins khusus untuk wilayah Fc dari hIgG1 manusia, 2 dan 4 [27] dipelajari untuk menyelidiki apakah
mereka dapat digunakan untuk afinitas kromatografi. Sistem ini sangat penting karena memungkinkan perbandingan
dengan Protein A, standar emas untuk IgG memurnikan
3.1

3.1.1 Imobilisasi D1Sso7d anti-IgG Affitin

Untuk mengevaluasi apakah kegiatan ofD1Sso7d dilestarikan sekali amobil pada kolom, Affitin ini
terkait dengan manik-manik agarosa melalui N-hidroksi-succinimide amina kopling kimia (Gambar. 1 B). Itu hasil
reaksi adalah 83% (8,3 dari 10 mg yang bergerak). Kolom ini kemudian digunakan untuk menangkap hIgG1
dimurnikan. Setelah mencuci, langkah elusi dilakukan dengan buffer glisin pada pH 2,5. Menurut kromatogram
(A280) hIgG1 ditangkap oleh kolom dan dielusi sebagai puncak yang tajam dengan penyangga asam

Gambar 2. Studi kemampuan kolom afinitas siap dengan D1Sso7d Affitin untuk menangkap IgG murni. Seratus dua
puluh lima mikrogram IgG murni yang dimuat untuk setiap percobaan kromatografi. Setelah dicuci dengan berjalan
buffer, elusi dilakukan dengan buffer glisin pada pH 2,5. Garis putus-putus menunjukkan awal elusi langkah dengan
glisin penyangga. Absorbansi pada 280 nm diukur untuk memantau kromatografi. FT: fraksi aliran-melalui; EL:
fraksi elusi.
3.1.2 IgG selektivitas kolom afinitas D1Sso7d
Sukses mengikat / pemulihan hIgG1 murni menggunakan Affitin Kolom mendorong kami untuk
menyelidiki apakah selektivitas diamati dalam larutan dengan ELISA [27] bisa dikonfirmasi dengan percobaan
pemurnian afinitas. Dengan tujuan ini, berbagai IgG dimurnikan dari manusia (isotipe 1-4), kambing, kelinci, tikus,
tikus, domba dan babi yang dimuat secara terpisah ke kolom D1Sso7d. Kromatogram ditunjukkan pada Gambar. 2
menunjukkan bahwa hIgG1, hIgG2, hIgG3 dan hIgG4 sepenuhnya ditangkap oleh kolom afinitas sementara hanya
sekitar 50% dan 10% dari IgG dari tikus dan domba, masing-masing, terjebak. Sebaliknya, IgG dari kambing, tikus,
kelinci dan babi tidak ditangkap oleh kolom. Ini Hasil menegaskan sebagian besar pengamatan sebelumnya oleh
ELISA [28] tentang kekhususan protein D1Sso7d, kecuali untuk hIgG3 dan IgG dari tikus dan domba yang tidak
diakui oleh Affitin ini menurut ELISA. Hasil ini menunjukkan bahwa D1Sso7d memiliki lemah afinitas untuk IgG
ini, yang hanya dapat dideteksi bila ada ofligands kepadatan tinggi dan efek rebinding, seperti yang terjadi pada
afinitas kolom.
3.1.3 IgG pemurnian dari minyak mentah E. coli lisat
Sebuah prasyarat untuk aplikasi kromatografi afinitas adalah spesifisitas reagen afinitas. Untuk menguji selektivitas
D1Sso7d kolom afinitas, sampel pertama disiapkan dengan fraksi larut dari ekstrak kasar E. coli dibubuhi hIgG
murni.
semacam ini sampel sangat heterogen, mengingat jumlah protein yang berbeda ditemukan di E. coli, dan dengan
demikian merupakan tantangan untuk selektivitas. Gambar 3 menunjukkan kromatogram yang diperoleh untuk
pemurnian sampel ini, dengan puncak aliran-melalui besar, diikuti oleh pulang cepat dari absorbansi diukur pada
280 nm untuk tingkat dasar, dan akhirnya puncak yang tajam saat buffer glisin dijalankan melalui kolom. Dua
sampel kontrol, yang mengandung baik fraksi larut dari E. coli ekstrak kasar atau murni hIgG hanya, dimuat secara

independen ke dalam kolom. Tidak ada puncak dapat diamati pada kromatogram (data tidak ditampilkan) untuk E.
coli hanya mengontrol sampel ketika penyangga glisin dijalankan melalui kolom, yang menunjukkan bahwa kolom
tidak bisa menangkap terdeteksi jumlah E. coli protein. Sebaliknya, puncak diamati pada kromatogram (data tidak
ditampilkan) setelah berjalan glisin penyangga untuk kontrol sampel dengan hanya hIgG murni. Analisis SDS-PAGE
dari fraksi dielusi dari tiga kali kromatografi (Gambar. 4A) menunjukkan dua band yang sesuai dengan rantai berat
dan ringan dari IgG (50 dan 25 kDa, masing-masing), sehingga mengkonfirmasikan bahwa kolom adalah mampu
menangkap hIgG selektif dari campuran protein E. Coli.

Gambar 3. kromatogram khas diamati untuk pemurnian afinitas hIgG dari sampel dibubuhi protein eksogen (di sini
E. coli protein). Kondisi untuk kromatografi yang sama seperti pada Gambar. 2. FT: fraksi aliran-melalui; EL: elusi
pecahan.

Gambar 4. Studi selektivitas D1Sso7d dan kolom Protein A. Analisis SDS-PAGE (di bawah kondisi mengurangi)
pemurnian afinitas Higgs dari sampel dibubuhi protein eksogen atau dari ascites; (A) menggunakan kolom
D1Sso7d: E. coli ekstrak kasar (1: disuntik, 2: mengalir melalui, 3: elusi), E. coli ekstrak kasar + hIgG (4:
disuntikkan, 5: aliran melalui, 6: elusi), hIgG murni (7: disuntikkan, 8: mengalir melalui, 9: elusi), (M) spidol
Protein: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20 kDa dari atas ke bawah ; (B) sama seperti di (A), tetapi dengan E. coli
ekstrak kasar diganti dengan DMEM / FCS; (C) yang sama seperti dalam (B), tetapi menggunakan Protein kolom A;
(D) analisis fraksi dikumpulkan dari pemurnian afinitas hIgG1 diproduksi di asites tikus menggunakan D1Sso7d dan
Protein A kolom (1: disuntik, 2: mengalir melalui, 3: mencuci, 4: elusi). "H" dan "L" menunjukkan migrasi band
yang sesuai rantai berat dan ringan, masing-masing
3.1.4 IgG pemurnian dari media kultur sel mamalia
Antibodi sering dihasilkan dari kultur sel hibridoma. Itu media yang digunakan untuk budaya ini
dilengkapi dengan 10% FCS, yang bisa mengganggu pemurnian afinitas. Untuk mengeksplorasi lebih lanjut sebuah
kemungkinan penggunaan kolom afinitas kami dalam pemurnian supernatan budaya antibodi, murni hIgG dicampur
dengan DMEM / FCS. Dua kontrol sampel disusun dengan baik DMEM / FCS atau hIgG hanya. Menggunakan
mengurangi SDS-PAGE, fraksi terelusi sesuai mengalir-melalui dan langkah elusi (Gambar. 4B) dianalisis. Menurut
analisis ini, Higgs dielusi yang semurni hIgG yang mana digunakan untuk mempersiapkan sampel berduri,
menunjukkan bahwa D1Sso7d yang Kolom mampu membedakan hIgG dari protein eksogen beragam, bahkan
mereka dari FCS. Sebagai perbandingan, sampel yang sama yang dimuat ke Protein A kolom. Seperti yang terlihat
dari analisis SDS-PAGE dari fraksi terelusi untuk DMEM / FCS + hIgG sampel pemurnian (Gambar. 4C), tingkat
kemurnian meraih hIgG dengan D1Sso7d Kolom baik dibandingkan dengan yang dari Protein A sistem pemurnian.
3.1.5 IgG pemurnian dari ascite
Akhirnya, asites mengandung hIgG1 juga dimuat ke D1Sso7d kolom dan isi protein dari fraksi terelusi
yang dibandingkan dengan yang diperoleh dari sampel yang sama dimurnikan pada Protein A kolom. Menurut
analisis SDS-PAGE (Gambar. 4D), kedua kolom dilakukan sama untuk memulihkan hIgG1 antibodi di tingkat tinggi
kemurnian lebih dari 95%, lanjut mengkonfirmasikan tinggi selektivitas D1Sso7d
3.1.6 Kekokohan kolom anti-IgG Affitin untuk membersihkan-di-tempat Prosedur
Untuk dapat digunakan kembali, kolom kromatografi harus dibersihkan dan diregenerasi dengan
prosedur (CIP) membersihkan-di-tempat. Hal ini sering terdiri dari mengekspos kolom untuk NaOH dalam
konsentrasi mulai dari 0,1 hingga 1 M antara siklus pemurnian. Untuk mengevaluasi bagaimana Kolom D1Sso7d
tahan kondisi yang keras, itu mengalami 25 siklus pemurnian hIgG, termasuk elusi pada pH 2,5 dan 15 menit
pengobatan dengan 0,25 M NaOH pada setiap siklus. Protein Sebuah kolom komersial digunakan secara paralel
untuk perbandingan. Menurut plot persentase kapasitas mengikat IgG kolom vs siklus pemurnian (Gbr. 5), tingkat
yang berbeda dari degradasi diamati. Setelah pajanan kumulatif terhadap NaOH selama sekitar 6 jam 15 menit,
aktivitas bergerak D1Sso7d masih tinggi (74% dari kapasitas awal kolom), tetapi lebih rendah dari itu Protein kolom
A (93%).
Kami baru-baru ini menunjukkan bahwa D1Sso7d dapat distabilkan menuju kondisi basa oleh mutasi
ganda [28]. yang sesuai mutan (D1Sso7d-DM) dilestarikan profil spesifisitas yang sama untuk IgG seperti yang
D1Sso7d. Dalam karya ini, kita pertama kali dipelajari selektivitas kolom D1Sso7d-DM seperti yang dijelaskan
untuk D1Sso7d (lihat Bagian 3.1.3) dengan E. coli sampel ekstrak kasar dibubuhi Higgs. Menurut analisis SDSPAGE ofeluted fraksi (Gbr. 6), sama dengan kolom D1Sso7d, tidak ada protein dari E. coli yang terikat ke D1Sso7dDM kolom (Gambar. 4A). Hal ini menunjukkan bahwa kekhususan D1Sso7d tidak diubah oleh mutasi ganda,
bahkan setelah amobil pada matriks.

Gambar 5. Perbandingan kapasitas kolom setelah diulang pemurnian / siklus CIP. pemurnian kromatografi afinitas
dijalankan seperti pada Gambar. 1 menggunakan hIgG dan kolom siap dengan D1Sso7d dan D1Sso7d-DM sebagai
ligan. Sebuah 15 menit langkah dengan 0,25 M NaOH digunakan sebagai agen pembersih antara masing-masing
berjalan. Protein A komersial digunakan di bawah kondisi yang sama untuk perbandingan.

Gambar 6. Studi selektivitas kolom D1Sso7d-DM. Analisis SDS-PAGE (di bawah mengurangi kondisi) dari
pemurnian afinitas Higgs murni, larut dalam E. coli mentah ekstrak dan hIgG1 dibubuhi larut E. coli ekstrak kasar
(1, 3, 5: mengalir melalui, 2, 4, 6: elusi). Lane M sesuai dengan penanda protein: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20
kDa dari atas ke bawah.

Gambar 7. Studi tersebut yang spesifisitas ofanti-PulD dan anti-HEWL kolom afinitas. (A) Profil Elusi (garis
hitam) diamati untuk pemurnian afinitas PulD-N dari larut fraksi E. coli lisat. Setelah dicuci dengan berjalan buffer,
elusi dilakukan dengan glisin penyangga pH 2,5 (garis biru). Absorbansi pada 280 nm diukur untuk memantau
kromatografi. FT: aliran melalui fraksi; EL: fraksi elusi. Dalam inset: Analisis SDS-PAGE dari pemurnian afinitas
PulD-N. Lane 1: sampel disuntikkan, 10: mengalir melalui, 2 dan 9: murni PulD-N sebagai kontrol, 3-8: elusi fraksi
1-6, yang ditunjukkan dengan garis merah di kromatogram. (B) analisis serupa dilakukan dengan kolom anti-HEWL
untuk pemurnian afinitas HEWL dari media DMEM / FCS. Dalam inset: analisis SDS-PAGE dari pemurnian
afinitas: DMEM / FCS (2: disuntikkan, 3: mengalir melalui, 4: elusi); DMEM / FCS + HEWL (5: disuntikkan, 6:
mengalir melalui, 7: elusi); HEWL (8: disuntikkan, 9: mengalir melalui, 10: elusi). Lane 1: penanda protein (250,
150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15, 10 kDa dari atas ke bawah). fraksi elusi, yang ditandai dengan garis merah di
kromatogram, dikumpulkan untuk analisis SDS-PAGE. (Untuk interpretasi referensi untuk warna dalam legenda
angka ini, pembaca
disebut versi web artikel ini.)
Akhirnya, kolom D1Sso7d-DM telah disampaikan kepada yang sama protokol pemurnian / siklus CIP
digunakan untuk kolom D1Sso7d. Setelah total waktu kontak 6 jam 15 menit dengan 0,25 M NaOH, yang Kolom
D1Sso7d-DM ditemukan lebih tahan terhadap larutan alkali dari kolom D1Sso7d (90% dan 74% ofthe kapasitas
awal kolom, masing-masing), dan sebanding dengan Protein A kolom (Gambar. 5).
3.2 kromatografi afinitas menggunakan anti-PulD-N dan anti-HEWL Affitins
Untuk menyelidiki apakah Affitins bisa lebih umum digunakan untuk kromatografi afinitas, dua non-IgG
terkait Affitin / protein pasangan dipelajari. Kekhususan yang sangat tinggi dari Sac7*6 telah dilaporkan sebelumnya
dengan percobaan blot Barat, menunjukkan bahwa Affitin ini bereaksi hanya dengan panjang penuh PulD protein,
dan PulD-N yang merupakan fragmen larut PulD, minyak mentah E. coli lysates [19]. Anti-HEWL Affitin H4 juga
khusus untuk HEWL [25]. Afinitas kolom disiapkan dengan cara yang sama seperti yang untuk anti-IgG Affitins.
Hasil panen kopling yang 86% untuk H4 (8,6 dari 10 mg yang bergerak) dan 85% untuk Sac7 * 6 (8,5 dari 10 mg
bergerak). Afinitas kromatografi dilakukan untuk setiap target serumpun: PulD-N di E. coli ekstrak kasar dan HEWL
dibubuhi DMEM + 10% FCS. Kromatogram menunjukkan bahwa Sac7 * 6 dan H4 Affitins masih bisa untuk
menangkap PulD-N dan HEWL, masing-masing, setelah imobilisasi (Gambar. 7). Memang, setelah posting-loading
mencuci, sebagian kecil protein adalah dielusi sebagai puncak yang tajam dengan glisin buffer pada pH 2,5. Analisis
SDS-PAGE ofthese pecahan menunjukkan bahwa PulD-N dan HEWL dielusi dengan derajat yang tinggi ofpurity,
lebih dari 95% dan 92%, masing-masing, sesuai dengan Coomassie biru pewarnaan (Gbr. 7). Penelitian ini juga
menunjukkan bahwa kolom tidak memiliki afinitas terdeteksi protein latar belakang dari E. coli ekstrak kasar atau
campuran DMEM / FCS, sebagai terlihat dengan sampel kontrol
Tabel 1.

3.3 kapasitas mengikat protein

kapasitas mengikat dinamis (DBC) dari H4- itu, Sac7 * 6- dan D1Sso7d-DM Affitin-kolom ditentukan
dengan memuat 20 ml sampel yang mengandung 1 mg / ml protein target kognitif (HEWL, PulD dan hIgG, masingmasing). Dari volume bongkar sesuai 10% terobosan, DBCS target serumpun diperkirakan sebagai 10,8, 16,0 dan
10,0 mg per ml kolom packing, masing-masing.
4.

Pembahasan
Tingginya biaya produksi farmasi protein terutama karena langkah-langkah pengolahan hilir ganda, yang
meliputi awal capture dan polishing pemurnian [30]. kromatografi afinitas adalah teknik banyak digunakan untuk
memulihkan molekul obat tersebut dari media kultur dan menawarkan tingkat tinggi kemurnian produk di satu
langkah, sehingga mengurangi biaya produksi. Dalam karya ini, kami melaporkan tiga contoh target yang tidak
terkait yang Affitins memiliki sifat yang cocok untuk aplikasi kromatografi afinitas.
Affitins ditunjukkan untuk menjadi fungsional setelah bergerak melalui kimia amina pada matriks
standar. Kapasitas mengikat dinamis ofthese kolom bertekad untuk setidaknya 10 mg oftarget per mililiter ofbed
resin. kapasitas yang lebih tinggi mungkin dapat dicapai dengan optimasi hati-hati imobilisasi. Misalnya, sistein bisa
ditambahkan ke N- atau C-terminus ofthe Affitin mengaktifkan imobilisasi yang berorientasi untuk memaksimalkan
eksposur mengikat situs untuk target [30]. Selain itu, kami menemukan untuk tiga kekhususan diuji dalam karya ini
bahwa 100% dari target protein 5 mg dimuat ke kolom dielusi (data tidak ditunjukkan), menunjukkan bahwa
pemulihan yang tinggi dapat dicapai dengan sistem ini Kami memilih untuk menantang kekhususan Affitins dengan
sampel yang sangat heterogen meniru yang diperoleh ketika protein Target diproduksi di E. coli, sel mamalia atau
sebagai mengutip cairan. Semua Affitin kolom (yaitu anti-PulD, anti-HEWL dan anti-IgG) ditampilkan kekhususan
yang tepat untuk sasaran serumpun mereka. Selain itu, kami memiliki ditunjukkan dalam karya ini bahwa
kekhususan anti-IgG dari Affitins membandingkan baik dengan yang dari Protein A, ligan standar banyak digunakan
untuk
pemurnian antibodi. Menariknya, profil ofrecognition of D1 Affitins (yaitu D1Sso7d dan D1Sso7d-DM) adalah
berbeda dari Protein G dan A (Tabel 1), mencontohkan bagaimana protein afinitas buatan dapat memperpanjang
panel profil spesifisitas tersedia untuk IgG pemurnian, dan untuk protein pada umumnya. Affitins diperoleh dari
kombinasi perpustakaan oleh seleksi terhadap target yang ditetapkan [19]. Untuk mendapatkan D1 oleh seleksi,
kami menggunakan campuran Fc dari empat subclass IgG, sehingga memungkinkan derajat kebebasan untuk sistem
untuk
mengikat pada setiap sub kelas IgG. Sampai saat ini, sebagian besar manusia disetujui (- terwujud) antibodi terapi
adalah IgG1 dan, pada tingkat lebih rendah, IgG2 dan IgG4 isotipe [31], yang diakui baik oleh D1 Affitins.
Meskipun D1 Affitins memiliki afinitas yang lemah untuk hIgG3 menurut ELISA, pada kenyataannya mereka
mampu menangkap hIgG3 pada imobilisasi di kolom. Dengan demikian D1 Affitins cocok untuk produksi besar
jumlah antibodi terapi setiap subclass. Terimakasih untuk fleksibilitas dari sistem Affitin, kami mengantisipasi
bahwa dengan menggunakan ketat proses seleksi, misalnya dengan hanya satu jenis IgG sebagai target atau dengan
persaingan dengan IgG yang tidak diinginkan, maka akan mungkin untuk mengembangkan ligan afinitas buatan
dengan spesifisitas yang ditetapkan untuk setiap khususnya IgG atau derivatnya.
Mengingat keragaman target yang reagen afinitas yang dibutuhkan dan yang tidak ada ligan alami yang
tersedia untuk desain kolom afinitas, penting untuk mengembangkan reagen afinitas disesuaikan. Untuk saat ini,
kami telah diisolasi Affitins melawan selusin target protein. Penokohan beberapa dari mereka (anti-PulD, -IgG,
-CelD, Dan -HEWL) telah diterbitkan [19,25,27]. Karenanya, kami percaya bahwa sistem Affitin cukup fleksibel
untuk memberikan reagen untuk kromatografi afinitas target protein non-antibodi.

Hal ini ekonomis penting bahwa kolom afinitas adalah sebagai tahan mungkin untuk pembersihan dan
sanitasi protokol untuk memastikan nya usabilitas. Ini juga merupakan prasyarat untuk pencegahan kontaminasi
produk, sebagai fragmen degradasi ligan afinitas mungkin tidak kompatibel dengan analisis kualitas produk dan /
atau aplikasi terapi [35]. Meskipun populer di industri untuk pemurnian antibodi, Protein A memiliki biaya produksi
yang tinggi dari tentang 6000-9000 D resin / L [32]. Studi kami menunjukkan bahwa antiIgG Affitins, dan
khususnya D1Sso7d-DM, bertahan dalam CIP yang keras kondisi umumnya diterapkan Protein A kolom [33].
Namun, protokol CIP telah baru-baru dioptimalkan untuk memperpanjang umur Protein A kolom. Hari-hari ini,
konsentrasi NaOH di kisaran 25-100 mM biasanya disarankan untuk membersihkan efisien, dan penghapusan
Protein Sebuah fragmen pada langkah berikut ini dijamin [34,35]. Kami percaya konsentrasi NaOH 0,25 M
digunakan untuk menantang sistem kami cukup untuk regenerasi Affitin kolom, dan konsentrasi yang lebih ringan
seperti akan memberikan mereka manfaat diamati untuk sistem Protein A juga. Untuk kasus yang perlu resistensi
kuat untuk CIP alkali, mengingat bahwa struktur kristal Sac7d dan Sso7d perancah yang tersedia, kami
mengantisipasi stabilitas yang dapat lebih ditingkatkan dengan melakukan mutagenesis tambahan
ada kecenderungan meningkat dalam industri terhadap penggunaan perangkat pakai untuk produksi
biofarmasi [36]. Kita telah melaporkan produksi tingkat tinggi beberapa Affitins di E. Coli (Sampai 200 mg / L
budaya dalam labu [19]). Dengan demikian, kami percaya bahwa biaya rendah yang terkait dengan produksi mereka
juga harus membuat mereka sangat menarik untuk pengembangan tunggal menggunakan kolom afinitas
5. Kesimpulan
Dengan pendekatan screening tinggi-throughput, peningkatan jumlah biofarmasi baru telah
diidentifikasi. Namun, alat afinitas yang tersedia untuk produksi skala besar molekul obat protein ini terbatas. Kami
telah mengembangkan teknologi untuk generasi, skrining, dan karakterisasi Affitins cocok untuk melengkapi, atau
bahkan mengganti ligan alami di banyak aplikasi afinitas. Pekerjaan kami disajikan dengan ini menetapkan Affitins
seperti pada reagen permintaan untuk setiap target kepentingan. karya masa depan mungkin meningkatkan sistem
berbasis Affitin untuk mendapatkan lebih tinggi kapasitas mengikat dinamis dengan tingkat aliran kerja yang lebih
tinggi, dan mungkin memungkinkan elutions ringan kompatibel dengan target rapuh. Kita percaya Affitins memiliki
berbagai aplikasi dalam persiapan protein sangat murni, seperti penangkapan protein target, penipisan protein
kontaminan, atau pengayaan lemah protein diwakili untuk penelitian proteomik.