Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Pabrik Sel Mikroba

Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50
https://doi.org/10.1186/s12934-018-0894-y

RISET Akses terbuka

Mengembangkan sistem yang efektif

untuk mengekspresikan protein rekombinan dalam
E. coli melalui perbandingan dan optimalisasi
peptida sinyal: EkspresiPseudomonas fluorescens
Lipase termostabil BJ-10 sebagai studi kasus

Weiqing Zhang, Jing Lu, Shuwen Zhang, Lu Liu, Xiaoyang Pang*dan Jiaping Lv*

Abstrak
Latar belakang:Lipase termostabil dari sumber mikroba telah diekspresikan secara substansial dalamE. coli, bagaimanapun,
enzim ini sering diproduksi dengan aktivitas enzimatik tingkat rendah dan terutama dalam bentuk badan inklusi. Beberapa
penelitian telah melaporkan bahwa produksi sekretori protein rekombinan menggabungkan N-terminus mereka ke peptida
sinyal telah digunakan untuk menyelesaikan masalah. Secara umum, kelayakan pendekatan ini sangat tergantung pada jalur
sekresi peptida sinyal dan jenis protein target yang akan disekresikan. Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan dan
mengoptimalkan peptida sinyal untuk sekresi lipase lipBJ10 termostabil yang efisien dariPseudomonas fluorescensBJ-10.
Sementara itu, studi perbandingan antara metode ini dan sekresi sitoplasma dilakukan dalam mensekresi lipase aktif dan
larut.
Hasil:Ekspresi fusi menggunakan enam peptida sinyal, yaitu PelB dan lima nativeE. colipeptida sinyal, sebagai mitra fusi
menghasilkan lipBJ10 rekombinan yang lebih larut dan fungsional daripada ekspresi non-fusi. LipBJ10 rekombinan, menyatu dengan
enam peptida sinyal yang beragam ini, disekresikan ke dalam periplasma diE. coli. Aktivitas lipase total dalam semua kasus ekspresi
fusi lebih tinggi daripada ekspresi non-fusi. Aktivitas relatif memuncak ketika lipBJ10 menyatu dengan DsbA, menghasilkan nilai 73,3
kali lebih besar daripada protein non-fusi. Ketika DsbA digunakan sebagai mitra fusi, aktivitas tertinggi (265,41 U/ml) dicapai dengan
pembentukan badan inklusi paling sedikit; empat lainnyaE. colipeptida sinyal, sampai batas tertentu, menyebabkan aktivitas rendah
dan badan inklusi tidak larut. Oleh karena itu, DsbA adalah mitra peptida sinyal yang optimal untuk menyatu dengan lipBJ10 untuk
menghasilkan protein yang larut dan fungsional secara efisien.

Kesimpulan:Kami menemukan bahwa sekering peptida sinyal ini, terutama DsbA, dapat secara signifikan mengurangi
pembentukan badan inklusi dan meningkatkan fungsi dan kelarutan lipBJ10 dibandingkan dengan lipBJ10 non-fusi. Hasil kami yang
dilaporkan di sini dapat memberikan referensi untuk ekspresi tingkat tinggi lipase lain sehubungan dengan kemungkinan aplikasi
industri.

Kata kunci:Lipase, Peptida sinyal, Ekspresi fusi,E. coli, DsbA

* Korespondensi: pangxiaoyang@163.com ; kjdairy@126.com Institut

Sains dan Teknologi Pangan Pertanian, Akademi Ilmu Pertanian
Tiongkok (CAAS), Beijing 100193, Tiongkok

© Penulis 2018. Artikel ini didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Internasional Creative Commons Attribution 4.0 (http://
creativecommons.org/licenses/by/4.0/), yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun,
asalkan Anda memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli dan sumbernya, memberikan tautan ke lisensi Creative Commons,
dan menunjukkan jika ada perubahan. Pengabaian Dedikasi Domain Publik Creative Commons (http://creativecommons.org/
publicdomain/zero/1.0/) berlaku untuk data yang disediakan dalam artikel ini, kecuali dinyatakan lain.
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50
Latar belakang
Lipase (triasilgliserol ester hidrolase, EC 3.1.1.3) adalah
hidrolase serin yang dapat mengkatalisis hidrolisis
triasilgliserol rantai panjang untuk membebaskan asam
lemak rantai panjang dan gliserol dalam media berair [1].
Lipase dari berbagai sumber, terutama sumber mikroba,
telah banyak digunakan dalam bidang industri seperti
sintesis organik dan industri deterjen dan susu.2]. Lipase
mikroba termofilik dan termostabil saat ini banyak
diminati karena dapat diproduksi dengan biaya rendah
dan melakukan reaksi kimia pada suhu yang lebih tinggi.
Bioproses yang dilakukan dengan lipase termostabil pada
suhu tinggi memiliki beberapa keuntungan [2]. Namun,
aplikasi lipase mikroba saat ini menghadapi dua masalah
utama: sebagian besar lipase memiliki stabilitas termal
yang buruk, dan hasil lipase oleh strain tipe liar rendah.
Untuk mengatasi masalah ini, teknologi rekayasa gen,
karena kemampuannya untuk mengekspresi protein secara
tinggi, telah diterapkan secara ekstensif pada lipase mikroba
termostabil yang diekspresikan secara berlebihan. Lipase ini
dapat diperoleh dari organisme mesofilik dan termofilik, dan
bahkan psikrofil memiliki beberapa enzim termostabil.3].
Selama beberapa tahun terakhir, banyak lipase mikroba telah
diekspresikan secara berlebihan pada inang homolog atau
heterolog seperti:E. coli, ragi atauBacillus subtilis. Kegiatan
dariGeobacillus thermoleovorans Toshkilipase, yang
diekspresikan secara berlebihan dalamE. coli, kira-kira 4,5 kali
lipat lebih tinggi daripada strain tipe liar [4]. Pfeffer dkk.
melaporkan bahwa lipase termostabil dariCandida antartika
secara fungsional diekspresikan dalam ragi methylotrophic
Pichia pastoris, dan konsentrasi lipase mencapai 0,88 g/l [5].
Meskipun banyak sistem telah berhasil diterapkan pada
ekspresi protein,E. coli sistem ekspresi masih mendominasi
sistem ekspresi bakteri dan tetap menjadi sistem pilihan untuk
penyelidikan laboratorium dan pengembangan awal dalam
kegiatan komersial atau sebagai tolok ukur yang berguna
untuk perbandingan di antara berbagai platform ekspresi [6].
Bakteri enterikE. coliadalah sistem ekspresi prokariotik yang
sangat disukai karena keuntungan berikut: (1) kemudahan
manipulasi genetik, (2) laju pertumbuhan yang cepat, (3)
genetika yang dipahami dengan baik, (4) hasil protein
rekombinan yang tinggi, dan (5 ) media fermentasi murah.
Namun, produksi protein olehE. colimemiliki beberapa
kelemahan, termasuk pemrosesan hilir yang kompleks,
aktivitas biologis yang lemah, dan stabilitas dan kelarutan
produk yang rendah. Selain itu, protein rekombinan terutama
diekspresikan sebagai badan inklusi, yang tidak larut dan tidak
aktif, dan harus dilipat kembali secara in vitro. Para peneliti
telah berusaha untuk mengatasi masalah ini dengan
menggunakan berbagai strategi dan teknologi seperti
optimasi kondisi ekspresi [7], penggunaan
Halaman 2 dari 12
tag fusi [8], dan penggunaan ekspresi periplasmik dan
bahkan ekstraseluler [9].
Salah satu metode umum untuk meningkatkan
kelarutan dan fungsi protein rekombinan dalamE. coli
adalah untuk menggabungkan N-terminus mereka ke
peptida sinyal, yang dapat menyebabkan ekspor protein
heterolog dari sitoplasma ke dalam ruang periplasmik
atau media kultur melalui sistem sekresi tipe II [10]. Sistem
sekresi tipe II yang mensekresi protein ke luar sel
dimediasi oleh translokasi periplasmik, yang merupakan
proses dua langkah yang melibatkan tiga jalur sekretori
(SecB-dependent (Sec), signal recognition particle (SRP),
dan twin-arginine translocation. jalur TAT), tersebar luas di
antara bakteri gram negatif [11]. Teknik genetik ini telah
membantu dalam produksi beberapa protein rekombinan
dengan memungkinkan stabilitas produk gen yang lebih
tinggi, pelipatan yang benar, dan pemrosesan hilir yang
lebih baik. Beberapa sinyal peptida protein membran luar
(dari spesies asli dan spesies lain) yang diangkut melalui
jalur sekresi umum telah digunakan untuk mensekresi
protein rekombinan secara efisien ke dalam periplasma
sel.E. coli[12]. Dengan fusi N-terminus dari peptida sinyal
DsbA, hormon pertumbuhan manusia disekresikan ke
dalam periplasmaE. coli, mencapai tingkat 12 g/ml [13].
Mukherjee dkk. menunjukkan bahwaE. colisel mampu
mensekresi 90% dari fragmen antibodi rantai tunggal
rekombinan (scFv menyatu dengan urutan sinyal PelB) ke
dalam supernatan kultur, dan konsentrasi scFv
ekstraseluler mencapai maksimum 160 mg/l [14].
Meskipun keberhasilan penggunaan peptida sinyal asal
prokariotik dan eukariotik untuk tujuan ini [15], kehadiran
peptida sinyal tidak selalu memastikan sekresi protein
rekombinan yang efisien ke dalam ruang periplasma [16]
dan pembentukan protein fungsional yang larut yang
terlipat dengan benar [17]. Dengan demikian, pemilihan
urutan sinyal yang optimal penting untuk sekresi protein
rekombinan yang efisien.
Lipase eksogen yang sebagian besar diproduksi oleh bakteri
psychrotrophic (terutamaPseudomonas fluorescens) ditemukan
tumbuh dalam susu mentah selama penyimpanan berpendingin
(2-4 °C) mempertahankan 20-30% dari aktivitas aslinya, bahkan di
bawah suhu yang sangat tinggi (UHT, 135 °C) selama 3-5 detik [18
]. PsikotropikaPseudomonas fluorescens BJ-10 sebelumnya
diisolasi di laboratorium kami dari susu mentah [19]. lipase yang
dihasilkan olehP. fluorescensBJ-10 yang diisolasi dari susu mentah
masih aktif setelah perlakuan termal normal dan bahkan setelah
UHT. Karakteristik unik dari protein ini, lipBJ10, membuatnya
menjadi biokatalis potensial dalam proses biokimia. LipBJ10
diekspresikan secara berlebihan dalamEscherichia coliuntuk
mengeksplorasi karakteristik fisik dan kimianya dan kemungkinan
aplikasi industrinya. Untuk membuat rekombinan yang efisien
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50 Halaman 3 dari 12

sistem ekspresi yang menguntungkan untuk mencapai
ekspresi periplasmik dan pembentukan lipBJ10 yang larut
dan fungsional, kami membangun enam strain yang
membawa plasmid ekspresi fusi yang berbeda. Dalam
laporan ini, kami membandingkan kinerja enam galur ini
untuk menentukan urutan sinyal yang optimal. Selain itu,
plasmid ekspresi non-fusi, yang tidak memiliki urutan
sinyal dari plasmid ekspresi fusi, dibangun untuk menguji
dan memverifikasi apakah jumlah protein terlarut dan
fungsional yang lebih besar diproduksi oleh periplasmik
daripada ekspresi sitoplasma.
Hasil
Lokasi rekombinan lipBJ10
Sebagian besar protein heterolog ditujukan untuk ekspresi
periplasmik diE. colidisintesis dengan urutan sinyal terminal
amino, panjang 20-30 asam amino, yang terdiri dari inti
hidrofobik diikuti oleh situs pembelahan proteolitik. Secara
umum, kelayakan ekspresi fusi sangat tergantung pada
peptida sinyal, jalur sekretori dan jenis protein target yang
akan disekresikan. Peptida sinyal PelB yang populer
mengarahkan protein rekombinan target keE. coliperiplasma
melalui jalur SEC. Meskipun jalur yang bergantung pada SEC
telah dipelajari secara lebih rinci dan sebagian besar strategi
produksi protein rekombinan sekretori menggunakan sistem
ini, seringkali tidak mungkin untuk menjamin bahwa semua
protein rekombinan akan ditranslokasikan oleh jalur
penargetan tunggal [20]. Lebih lanjut, tidak ada peptida sinyal
universal untuk protein rekombinan yang diberikan untuk
menjamin keberhasilan sekresinya. Dengan demikian,
pemilihan peptida sinyal yang optimal untuk sekresi yang
efisien harus
diteliti secara individual untuk setiap protein rekombinan
baru. Akibatnya, lima penduduk asli yang berbedaE. coli
peptida sinyal dan peptida sinyal PelB dari tiga jalur sekretori
(Tabel2) dipilih untuk menargetkan lipBJ10 ke periplasma.
Untuk menentukan apakah ekspresi protein yang menyatu
dengan setiap peptida sinyal dapat memfasilitasi sekresi
lipBJ10 rekombinan ke dalam ruang periplasma, lokasi lipBJ10
yang dihasilkan diperiksa dengan 12% SDS-PAGE. Seperti yang
ditunjukkan pada Gambar.1, pita protein ~ 64,6-kDa, ukuran
yang diharapkan dari lipBJ10, tidak ada dalam supernatan sel
utuh yang tidak diinduksi sonicated. Namun, pita ini diamati
pada fraksi periplasma dari semua sel yang membawa
plasmid rekombinan pET-SigPFL01 ke pET-SigPFL06. Induksi
ekspresi lipBJ10 (S(-)-PFL) rekombinan pada galur kontrol
(membawa pET-SigPFL00), yang dapat dideteksi dengan
regangan Coomassie, diamati hanya pada fraksi IB dan bukan
pada supernatan dari keseluruhan yang diinduksi sonicated
sel atau dalam fraksi periplasma (Gbr.1). Hasilnya
menunjukkan bahwa lipBJ10 disekresikan ke periplasma di
semua galur BL21 (DE3) yang menampung plasmid
rekombinan di mana proteinnya menyatu dengan peptida
sinyal, tetapi lipBJ10 yang diekspresikan tanpa sinyal sebagian
besar tetap dalam bentuk IB yang tidak larut.
Analisis ekspresi lipBJ10
Tingkat ekspresi lipBJ10 dalam strain ekspresi non-fusi dan
fusi (Tabel2) dibandingkan dengan PCR waktu nyata
kuantitatif. Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati
antara strain non-fusi dan fusi dalam tingkat ekspresi
relatif lipBJ10 (Gbr. 3d).2), menunjukkan bahwa ekspresi
fusi dengan enam peptida sinyal ini tidak

Gambar 1Analisis SDS-PAGE sampel lipBJ10 protein rekombinan dari BL21 (DE3) yang mengandung plasmid rekombinan berbeda dari pET-SigPFL00 hingga pET-
SigPFL06 yang diinduksi dengan 0,2 mM IPTG selama 40 jam pada 20 °C. 10 g protein total dimuat pada gel SDS-PAGE 12%. Jalur: M, standar massa molekul; 1, S(-)-
bibirBJ10; 2, DsbA-bibirBJ10; 3, FhuD-bibirBJ10; 4, MdoD-bibirBJ10; 5, OmpA-bibirBJ10; 6, YcdO-bibirBJ10; 7, PelB-bibirBJ10;sebuah, fraksi supernatan sonicated sel utuh
yang tidak diinduksi;b, fraksi supernatan sonicated sel utuh yang diinduksi;c, fraksi periplasma;d, Badan inklusi. Panah menunjukkan posisi lipBJ10 dalam gel
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50 Halaman 4 dari 12

mengubah level ekspresi lipBJ10 dibandingkan dengan

ekspresi nonfusion dalam kondisi yang sama. Untuk
ekspresi fusi, analisis PCR real-time kuantitatif
mengungkapkan tingkat transkripsi lipBJ10 yang sama
antara enam rekombinan yang berbeda iniE. colistrain
(dari BL21-01 ke BL21-06) (Gbr.2).

Efek pada kelarutan lipBJ10

Gambar 2.Tingkat ekspresi relatif lipBJ10 dalam strain rekombinan
yang berbeda (dari BL21-00 hingga BL21-06). Data dinormalisasi ke
gen rumah tanggaE. coli16 detik. Hasil ditampilkan sebagai rasio
ekspresi relatif dibandingkan dengan ekspresi dalam strain ekspresi
non-fusi (rekombinanE. coliBL21-00). Hasilnya berarti±satu standar
deviasi untuk tiga ulangan dan perbedaan antara strain yang berbeda
secara statistik signifikan pada aPnilai 0,05
Untuk mempelajari apakah ekspresi lipBJ10 yang menyatu
dengan peptida sinyal akan meningkatkan kelarutan lipBJ10,
BL21-00 dan strain rekombinan lainnya dibuat dan dianalisis
(Tabel2) di bawah kondisi fermentasi dan metode pengolahan
yang sama. Analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa konten IB
dari galur BL21-01 dan BL21-02, ketika sel-sel diinduksi oleh 0,
2 mM IPTG, secara signifikan lebih sedikit daripada BL21-00
dan galur ekspresi fusi lainnya (Gbr. 3d).3sebuah). Angka3c
menunjukkan bahwa jumlah badan inklusi, ketika lipBJ10
menyatu dengan PelB dan DsbA, masing-masing hanya 20,8
dan 6,1% dari yang dihasilkan oleh ekspresi nonfusi. Namun,
beberapa fusi signallipBJ10, seperti yang terbentuk dengan
peptida sinyal dari OmpA ke YcdO, tidak secara signifikan
menurunkan

Gambar 3Analisis SDS-PAGE sampel badan inklusi dari strain BL21 (DE3) berbeda yang diinduksi dengan IPTG selama 40 jam pada 20 °C. Jalur: M, standar massa
molekul; 1, BL21 (DE3) (tanpa plasmid); 2, BL21-NULL; 3, BL21-00; 4, BL21-01; 5, BL21-02; 6, BL21-03; 7, BL21-04; 8, BL21-05; 9, BL21-06.10 g protein total dimuat pada
gel SDS-PAGE 12%.sebuahKesembilan strain ini diinduksi dengan 0,2 mM IPTG selama 40 jam pada 20 °C.bKesembilan strain ini diinduksi dengan 1,0 mM IPTG selama
40 jam pada 20 °C.cKuantifikasi pita protein badan inklusi dalamsebuahdengan skala abu-abu.dKuantifikasi pita protein badan inklusi dalambdengan skala abu-abu.
Nilai skala abu-abu pita protein badan inklusi dari ekspresi non-fusi (yaitu, S-) ditetapkan ke 1
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50 Halaman 5 dari 12

pembentukan IB. Ketika lipBJ10 menyatu dengan empat sinyal
lainnya, pembentukan IB berkurang kurang dari 50% (Gbr. 4b).3c).
Hasil IB dengan demikian dapat sangat bervariasi berdasarkan
peptida sinyal beragam dari fusi.
Penelitian juga menunjukkan bahwa intensitas induksi
berdampak pada sekresi protein rekombinan. Kapan
E. colidiinduksi dengan IPTG konsentrasi tinggi, protein
rekombinan terutama ditemukan sebagai IB yang tidak
larut dan terletak di sitoplasma, yang tidak kondusif untuk
pembentukan protein heterolog fungsional yang larut.
Kami mempelajari apakah konsentrasi tinggi IPTG akan
mempengaruhi hasil IB. Angka3b menunjukkan bahwa
pada konsentrasi tinggi IPTG, ekspresi protein non-fusi
dan fusi membentuk sejumlah besar IB. Menariknya, kami
menemukan bahwa fusi lipBJ10 dengan PelB OmpA dan
Ycdo, di bawah induksi 1 mM IPTG, menghasilkan lebih
banyak IB daripada ekspresi non-fusi (Gbr. 4b).3d).
Menginduksi ekspresi dengan IPTG konsentrasi rendah,
dibandingkan dengan konsentrasi tinggi, secara signifikan
menurunkan hasil IB.
Analisis morfometrik, menggunakan Hitachi H-7650B TEM,
dilakukan untuk memeriksa lebih lanjut keuntungan dari
ekspresi fusi dalam mengurangi pembentukan IB dan
mensekresi lipBJ10 ke dalam periplasma. Sembilan galur BL21
(DE3) yang berbeda (BL21 (DE3) tanpa plasmid dan delapan
galur yang ditransformasikan dengan plasmid yang berbeda,
Tabel2) dibandingkan, dan strain BL21 (DE3) dan BL21-NULL
digunakan sebagai kelompok kontrol dalam kondisi yang
sama.
Mikrograf elektron transmisi mengungkapkan keberadaan
dan jumlah IB dalam sel. Gambar TEM dari Gambar.4c dengan
jelas menunjukkan bahwa sebagian besar sitoplasma
ditempati oleh IB yang baru terbentuk, yang muncul sebagai
entitas padat elektron. Bentuk-bentuk ini hampir tidak diamati
pada Gambar.4d, e, berbeda dengan gambar grup kontrol
(Gbr.4a, b). Angka4c juga menunjukkan bahwa IB sitoplasma
(panah putih) cenderung bermigrasi ke kutub. Pengamatan ini
konsisten dengan karya Rokney [21]. Menariknya,
dibandingkan dengan Gambar.4c, gambar TEM dari Gambar.4
f, saya dengan jelas menunjukkan bahwa sebagian besar IB
(panah hitam) cenderung merata di sekitar bagian dalam sel

Gambar 4Perbandingan Mikroskop Elektron Transmisi Sel yang berbeda. Strain yang berbeda, kecuali BL21 (DE3), dibudidayakan dalam media LB yang
mengandung Amp (100 mg/ml) dan ditumbuhkan pada suhu 37 °C sampai nilai OD600mencapai 0,8, dan kemudian diinduksi dengan 0,2 mM IPTG selama 40 jam
pada 20 °C. BL21 (DE3) dibudidayakan dalam media LB tanpa Amp. Batang = 500nm.sebuahBL21 (DE3) (tanpa plasmid).bBL21-NULL (dengan pET-22b(+) kosong).c
BL21-00 (dengan pET-SigPFL00).dBL21-01 (DE3) (dengan pET-SigPFL01).eBL21-02 (DE3) (dengan pET-SigPFL02).fBL21-03 (DE3) (dengan pET-SigPFL03).g BL21-04 (DE3)
(dengan pET-SigPFL04).hBL21-05 (DE3) (dengan pET-SigPFL05).sayaBL21-06 (dengan pET-SigPFL06). Panah putih: badan inklusi sitoplasma; Panah hitam: badan
inklusi periplasma
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50
daripada di kutub sel. Beberapa IB diamati pada Gambar.4
c, d. Fenomena ini menunjukkan bahwa ekspresi fusi PelB
dan DsbA menyebabkan kelarutan yang cukup.
Efek pada aktivitas lipBJ10
BL21 (DE3)E. colistrain membawa plasmid rekombinan
yang berbeda (Tabel2) diinkubasi dalam kondisi yang
sama, dan galur BL21-00 berfungsi sebagai kelompok
kontrol. Untuk mempelajari efek peptida sinyal ini pada
aktivitas lipBJ10 rekombinan, supernatan dari preparat
sitoplasma dan sel utuh yang disonikasi disiapkan untuk
mengukur aktivitas lipase. Aktivitas lipase dalam preparat
sel utuh dari semua konstruksi ekspresi fusi lebih tinggi
daripada ekspresi non-fusi (S(-)-lipBJ10); aktivitas lipase
memuncak ketika lipBJ10 menyatu dengan DsbA, menjadi
73,3 kali lebih besar dari pada non-fusi (Gbr. 4b).5). In the
control group, the enzyme activity in the cytoplasmic
fraction was equal to that in the whole-cell preparation.
Lipase activities of the fusions in the whole-cell
preparations were significantly higher than those of the
fusions in the cytoplasm preparations, and the difference
peaked in the DsbA fusion, which was 11.3 times higher
(Fig. 5). The results indicate that signallipBJ10 fusions are
translocated to the periplasm and functionally folded, in
contrast to the case when lipBJ10 is expressed without a
signal peptide.
Peptida sinyal optimal untuk ekspresi periplasma yang
dapat diinduksi dari lipBJ10 . fungsional
Efek peptida sinyal yang berbeda bervariasi tergantung pada jenis
protein yang akan diangkut. Strain yang membawa plasmid
ekspresi fusi yang berbeda (yaitu, pET-SigPFL01 ke pET-SigPFL06)
semuanya ditumbuhkan pada suhu 37 ° C sampai
Gambar 5Perbandingan aktivitas lipase preparasi protein sitoplasma
dan preparasi sel utuh. Strain yang berbeda (dari BL21-00 hingga
BL21-06) ditumbuhkan pada suhu 37 °C hingga nilai OD600
mencapai 0,8, dan kemudian diinduksi dengan 0,2 mM IPTG selama 40 jam pada 20 ° C
Halaman 6 dari 12
Fig. 6 Effect of different signal peptide on the lipase activity of
periplasmic protein preparation. The different strains (from BL21-01 to
BL21-06) were grown at 37 °C until the value of OD600reached 0.8, and
then induced with 0.2 mM IPTG for 40 h at 20 °C
nilai OD600 mencapai 0,8, ketika mereka diinduksi dengan 0,2
mM IPTG dan dikultur selama 40 jam pada 20 °C. Aktivitas
lipase protein dalam fraksi periplasma diukur seperti yang
dijelaskan dalam bahan dan metode. Strain yang membawa
DsbA dan PelB lebih efektif daripada empat peptida sinyal
lainnya dalam mensekresi lipBJ10 ke dalam ruang periplasma.
Ketika menyatu dengan PelB, aktivitas lipBJ10 di bagian ruang
periplasmik mencapai 46,99 U/ml (Gbr. 2).6). Namun, aktivitas
lipBJ10 yang menyatu dengan DsbA, yang mencapai 265,41 U /
ml, adalah 5 kali lebih besar daripada fusi PelB (Gbr. 4b).6).
Selain itu, aktivitas relatif hanya 17,7, 3,7, 3,4, 5,9 dan 8,1%
dari aktivitas fusi DsbA ketika lipBJ10 digabungkan ke PelB,
FhuD, MdoD, OmpA dan YcdO, masing-masing (Gbr. 2b).6).
Data menunjukkan bahwa peptida sinyal DsbA adalah peptida
sinyal optimal untuk ekspresi lipBJ10 fungsional yang dapat
diinduksi dan pengangkutannya ke periplasma.
Pengaruh suhu pada aktivitas dan termostabilitas
lipBJ10
Suhu di mana aktivitas lipBJ10 optimal diamati pada 45 ° C,
dan aktivitas enzim juga relatif tinggi pada kisaran suhu
dari 60 hingga 90 ° C (Gbr. 1b).7sebuah). Pada suhu tinggi
60 °C, aktivitas relatif (sekitar 84,5%) enzim ini mirip
dengan aktivitas enzim maksimum, dan mempertahankan
lebih dari 70% aktivitas maksimumnya ketika suhu 90 °C.
Profil stabilitas termal lipBJ10 ditunjukkan pada Gambar.7
b. Aktivitas enzim berubah sangat sedikit ketika
menghabiskan lebih banyak waktu pada suhu 45 °C,
karena aktivitas residunya lebih besar dari 92%. lipBJ10
mempertahankan lebih dari 81, 61, dan 54% aktivitas
residunya setelah inkubasi 90 menit pada 60, 70, dan 80
°C, masing-masing. Meskipun lipBJ10 menunjukkan
aktivitas yang relatif lebih rendah ketika
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50
sebuah
b baliknya) dan akhirnya menyaring sampel untuk
Gambar 7Pengaruh suhu pada aktivitas lipase (sebuah) dan stabilitas (b
). Aktivitas lipase tertinggi diatur ke 100%
suhu di atas 60 ° C, lipBJ10 stabil, dan lebih dari 50%
aktivitas aslinya dipertahankan pada 90 menit.
Diskusi
MeskipunE. colimenjadi salah satu inang yang paling sering
digunakan dalam produksi tingkat tinggi protein heterolog
untuk penelitian atau tujuan komersial, banyak masalah
produksi ada dalam sistem ini. Secara khusus, ketika protein
diekspresikan dalam IB, mereka menunjukkan ketidaklarutan
dan aktivitas rendah; protein yang aktif secara biologis dapat
diperoleh kembali dari IB, tetapi hanya melalui proses
denaturasi dan pelipatan ulang yang rumit dan mahal. Selain
itu, beberapa protein mengandung ikatan disulfida kompleks
dan karenanya memerlukan modifikasi pasca-translasi agar
aktif. Salah satu pendekatan untuk menyelesaikan masalah ini
adalah memiliki protein rekombinan yang disekresikan ke
ruang periplasma dengan menggabungkan urutan sinyal
yang sesuai ke N-terminus dari gen protein target [20].
Namun, apakah metode ini lebih efektif dalam mensekresi
lipase terlarut dan aktif, dibandingkan dengan sekresi
sitoplasma, belum dilaporkan. Oleh karena itu, ada kebutuhan
untuk membandingkan, menganalisis, dan mengilustrasikan
manfaat metode ini untuk mengekspresikan protein
rekombinan yang dapat larut dan berfungsi. Di sisi lain,
efisiensi sekresi protein bervariasi tergantung pada strain
inang, urutan sinyal, dan jenis protein yang akan disekresikan.
20]. Berbagai urutan sinyal dari protein bakteri ditranslokasi
melalui jalur sekresi yang berbeda—Sec (terdiri dari subunit
protein pengikat maltosa, MalE; subunit pektat liase, PelB;
subunit alkaline phosphatase, PhoA; dan protein membran
luar, OmpA), SRP (periplasmic protein sensorik, TorT; subunit
dari
Halaman 7 dari 12
kompleks amplop sel Tol-Pal, TolB; dan disulfida
oksidoreduktase, DsbA), dan jalur TAT (penisilin asilase,
Pac dan subunit trimetilaminaN-oksida reduktase I,
TorA). Secara umum, urutan sinyal jalur sekresi
memainkan peran penting dalam menentukan
pemrosesan protein dalamE. coli. Sementara itu, perlu
untuk menentukan efek peptida sinyal yang berbeda
pada protein tertentu (serta kompatibilitas timbal
menemukan urutan sinyal yang optimal.
Beberapa sekuens sinyal, termasuk yang berasal dari PelB,
OmpA, SpA, PhoA, LamB, dan DsbA, telah digunakan untuk
memproduksi protein rekombinan secara efisien dan
mensekresikannya ke periplasma diE. colidalam studi lain [20].
Meskipun banyak contoh yang berhasil, teknologi ini masih
belum dapat diterapkan pada beberapa protein, seperti
human granulocyte-colony stimulating factor (hGCSF) [16].
Dalam penelitian ini, semua protein fusi signal-lipBJ10, yaitu
PelB-lipBJ10, DsbA-lipBJ10, FhuD-lipBJ10, MdoD-lipBJ10,
OmpAlipBJ10 dan YcdO-lipBJ10, ditemukan mengekspor
lipasenya ke dalam fraksi periplasma. Studi saat ini
mengungkapkan bahwa menggabungkan lipBJ10 dengan
tujuh peptida sinyal ini menghasilkan ekspresi dan sekresi
lipBJ10 ke dalam ruang periplasmaE. colisel.
Agregasi protein rekombinan dapat dikurangi dengan menggabungkan protein
target ke mitra fusi yang sangat larut, seperti tag afinitas atau peptida sinyal.8,22].
Studi kami menunjukkan bahwa lipBJ10 rekombinan yang tidak menyatu hampir
semata-mata ada sebagai IB. Sebaliknya, ketika lipBJ10 menyatu dengan enam
peptida sinyal yang berbeda ini, bagian dari lipase disekresikan ke dalam
periplasma dan ditemukan dalam bentuk larut. Namun, jumlah bagian lipase ini
bervariasi menurut jenis peptida sinyal. Ketika lipBJ10 diekspresikan dengan enam
peptida sinyal ini, jumlah badan inklusi adalah 9,1-93,9% lebih sedikit daripada
yang dihasilkan oleh ekspresi non-fusi. Setelah induksi, meskipun empat fusi sinyal-
lipBJ10 selain PelB dan DsbA masih menghasilkan beberapa IB; aktivitas preparasi
sel utuh sonicated yang mengandung protein fusi lebih tinggi 6,0-, 8,8-, 5,6- dan 7,9
kali lipat dibandingkan aktivitas dari sel-sel dengan protein non-fusi. Hasilnya
menunjukkan bahwa dibandingkan dengan ekspresi protein non-fusi, ekspresi
protein yang menyatu dengan keenam peptida sinyal yang berbeda ini
mengurangi produksi IB dan meningkatkan kelarutan lipBJ10. Selain itu,
penurunan kelimpahan IB terkait dengan ekspresi periplasmik, dan kelarutan
protein rekombinan lipBJ10 ditingkatkan sebagai hasil fusinya ke peptida sinyal.
Metode fusi ini, menggunakan enam peptida sinyal ini sebagai mitra fusi, oleh
karena itu lebih baik dalam menghasilkan lipBJ10 rekombinan yang larut dan
fungsional daripada ekspresi non-fusi. dan kelarutan protein rekombinan lipBJ10
ditingkatkan sebagai hasil fusinya ke peptida sinyal. Metode fusi ini, menggunakan
enam peptida sinyal ini sebagai mitra fusi, oleh karena itu lebih baik dalam
menghasilkan lipBJ10 rekombinan yang larut dan fungsional daripada ekspresi
non-fusi. dan kelarutan protein rekombinan lipBJ10 ditingkatkan sebagai hasil
fusinya ke peptida sinyal. Metode fusi ini, menggunakan enam peptida sinyal ini
sebagai mitra fusi, oleh karena itu lebih baik dalam menghasilkan lipBJ10
rekombinan yang larut dan fungsional daripada ekspresi non-fusi.
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50
Meskipun banyak fusi protein dengan peptida sinyal sangat
larut dan produksinya efisien, peptida sinyal tidak sama
efektifnya sebagai peningkat kelarutan untuk meningkatkan
kelarutan protein rekombinan in vivo. Dari semua enam
konstruksi fusi, konten IB paling sedikit terbentuk dengan
jelas dari fusi DsbA-lipBJ10 lipBJ10 (Gbr. 3d).3sebuah). Gambar
TEM pada Gambar.3e menunjukkan bahwa ada beberapa IB di
dalam sel dengan protein fusi ini, sementara berbagai tingkat
pembentukan IB ditunjukkan dengan jelas dalam gambar TEM
sel dengan protein fusi lainnya (Gbr. 2b).4). Selain itu, gambar
TEM dari Gambar.4f–i menunjukkan bahwa sebagian besar
entitas padat elektron (panah hitam) cenderung terdistribusi
secara merata di sekitar bagian dalam sel daripada di kutub.
Rokney dkk. melaporkan bahwa sebagian besar IB diangkut ke
kutub melalui proses spesifik dan bergantung pada energi diE.
coli[21]. Kemungkinan penyebab perubahan ini adalah bahwa
peptida sinyal yang menyatu dengan protein target
rekombinan mengubah proses. Sebaliknya, Jean-Michel Betton
et al. melaporkan bahwa protein matang membentuk IB di
periplasma [17]. Dalam karya ini, kami berspekulasi bahwa
protein lipBJ10 menyatu dengan peptida sinyal selain dari
DsbA sebagian ada dalam bentuk IB yang tidak larut; aktivitas
lipase dari fraksi periplasma akibatnya lebih tinggi ketika
lipBJ10 menyatu dengan DsbA. Dengan demikian, temuan
kami menunjukkan bahwa DsbA adalah peptida sinyal optimal
untuk meningkatkan kelarutan lipBJ10.
Meskipun lipBJ10 disekresikan ke dalam ruang
periplasmik (Gbr.1), aktivitas enzim sangat bervariasi di
antara protein fusi yang berbeda. Aktivitas fusi DsbA-
lipBJ10 dalam fraksi periplasmik adalah 5 kali lebih tinggi
daripada fusi PelB yang sesuai (Gbr. 4b).6). Hasil ini
mungkin terkait dengan jalur sekretori PelB (Sec) dan DsbA
(SRP) yang berbeda. Ekspor protein melalui jalur Sec
terjadi pasca-translasi, sedangkan ekspor melalui jalur SRP
adalah ko-translasi.23]. Agar ekspor yang bergantung
pada Sec terjadi, polipeptida matang harus dipertahankan
dalam konformasi yang tidak dilipat atau mungkin
sebagian dilipat sebelum dimasukkan ke dalam pori
SecYEG. Penyisipan ini dilakukan dengan interaksi dengan
pendamping SecB atau, dalam beberapa kasus, dengan
tindakan DnaK [24]. Sebaliknya, pelipatan prematur di
sitoplasma tidak menjadi masalah untuk protein yang
diekspor dengan cara yang bergantung pada SRP, karena
sintesis protein dihentikan sampai ribosom bersentuhan
dengan pori sekresi.20]. Jalur SRP memiliki keuntungan
dalam sekresi polipeptida yang rentan terhadap agregasi
di sitoplasma, yang merupakan masalah dengan protein
yang diekspor melalui jalur Sec pasca-translasi.
Karakteristik peptida sinyal juga secara signifikan
mempengaruhi kelarutan dan aktivitas protein
rekombinan. DsbA, protein periplasma larut yang
mengandung situs aktif CPHG yang tertanam dalam a
Halaman 8 dari 12
lipatan mirip thioredoxin, menggunakan Cys30 yang sangat
reaktif untuk mempromosikan transfer disulfida dalam
protein substrat dengan pembentukan spesies disulfida
campuran [25]. Sangat penting untuk fungsi dan stabilitas
protein heterolog untuk meningkatkan pembentukan ikatan
disulfida struktural, karena mereka kondusif untuk pelipatan
oksidatif dan aktivitas dan stabilitas banyak protein yang
diekspor dari sitoplasma. Namun,E. colisitosol adalah
lingkungan yang agak mereduksi, dan ikatan disulfida dengan
demikian biasanya tidak terbentuk di sana. DsbA adalah
pengantar utama ikatan disulfida dan memiliki potensi redoks
tertinggi kedua di antara protein terkait TRX yang diketahui
dalam periplasmaE. coli[26]. Berdasarkan karakteristik ini,
DsbA banyak digunakan dalam konstruksi plasmid ekspresi
komersial.27] untuk mengaktifkan sekresi periplasma atau
ekstraseluler [28]. Dalam karya ini, aktivitas tertinggi lipBJ10
dicapai sebagai hasil dari fusi ke peptida sinyal DsbA. Hasil ini
menunjukkan bahwa lipBJ10 mengandung sejumlah besar
ikatan disulfida dan bahwa DsbA mengkatalisis pembentukan
ikatan disulfida yang benar, yang diperlukan agar protein
berfungsi dalam periplasma. Oleh karena itu DsbA adalah
peptida sinyal yang efisien secara optimal untuk menyatu
dengan lipBJ10 untuk mengekspresikan protein lipBJ10 yang
larut dan fungsional.
Selain itu, pembentukan IB dalam sistem ekspresi
rekombinan adalah hasil dari keseimbangan yang tidak
seimbang antara agregasi dan solubilisasi protein in vivo.
12]. Sebagian besar protein lipBJ10 yang baru terbentuk,
yang diproduksi dengan cepat karena konsentrasi IPTG
yang tinggi (yaitu, 1 mM), dialokasikan ke IB dalam
penyeimbangan agregasi dan solubilisasi. Hasil ini
menunjukkan bahwa tekanan IPTG konsentrasi tinggi tidak
kondusif untuk ekspresi protein rekombinan terlarut.
Selanjutnya, IPTG dapat menjadi racun bagi sel pada
konsentrasi tinggi.29]. Dengan demikian, tekanan IPTG
konsentrasi tinggi tidak kondusif untuk ekspresi protein
rekombinan terlarut tetapi mungkin juga mempengaruhi
sekresi protein ke dalam periplasma. Selain itu, ekspresi
fusi lipBJ10 dengan enam peptida sinyal ini tidak secara
signifikan mengurangi pembentukan badan inklusi
dibandingkan dengan ekspresi non-fusi di bawah induksi
konsentrasi tinggi IPTG (1 mM). Sebaliknya, jumlah badan
inklusi meningkat masing-masing 39,0, 27,6 dan 161,4%
sebagai akibat dari ekspresi fusi dengan PelB, OmpA dan
YcdO. Alasan yang mungkin adalah bahwa sinyal-lipBJ10
diekspresikan pada kecepatan tinggi yang tidak kondusif
untuk pelipatan protein dan bahwa ekspresi fusi dengan
peptida sinyal, yang meningkatkan berat molekul protein
rekombinan, menyebabkan perubahan dalam kinetika
pelipatan.
Suhu aktivitas optimum lipBJ10 rekombinan
diamati menjadi 45 °C dan mirip dengan
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50
bahwa lipase dariPseudomonas fluorescensMTCC 2421 (40
°C) [30] danPseudomonas fluorescensJCM5963 (55 °C) [31].
Meskipun suhu optimum di bawah 60 °C, lebih dari 70%
aktivitas enzim maksimum dipertahankan dalam kisaran
suhu tinggi 60-90 °C. Di sisi lain, lipBJ10 stabil setelah
diinkubasi pada suhu 60 ° C selama 90 menit, dengan
aktivitas residu lebih besar dari 81% (Gbr. 4b).7b). Chung
dkk. melaporkan bahwa waktu yang dibutuhkan untuk
90% inaktivasi lipase termostabil (nilai D) adalah 4 jam
pada 95 °C dan bahwa peningkatan suhu yang diperlukan
untuk mengurangi nilai D sebesar 90% (ZDnilai) adalah 76
°C [32]. Dalam penelitian kami, nilai D lipBJ10 adalah 72,5
jam pada 60 ° C (data tidak ditampilkan). Hasil ini
menunjukkan bahwa lipBJ10 rekombinan dapat digunakan
dalam proses biokatalitik suhu tinggi, yang dapat
mengatasi kelemahan tertentu yang timbul dari
persyaratan bahan yang lebih ketat, inaktivasi pasca reaksi
yang lebih sulit, dan pembatasan dalam kasus substrat
atau produk yang labil.2].
Kesimpulan
Kesimpulannya, kami berhasil membangun dan
mengoptimalkan sistem ekspresi lipase tahan panas dari
Pseudomonas fluorescensBJ-10 dalam pekerjaan ini. Peptida
sinyal DsbA ditentukan untuk menjadi pasangan peptida
sinyal yang optimal untuk menghasilkan lipBJ10 yang larut,
fungsional, dan termostabil, yang memiliki prospek yang baik
untuk aplikasi industri. Lebih penting lagi, karya ini menyoroti
manfaat ekspresi periplasma dibandingkan dengan ekspresi
sitoplasma. Sementara itu, penelitian kami menggambarkan
pentingnya penyaringan peptida sinyal untuk menentukan
mana yang optimal dalam ekspresi fungsional protein target
pada tingkat tinggi.
Metode
Strain, plasmid, dan enzim
ItuP. fluorescensStrain BJ-10 (CGMCC No.13279) yang
digunakan dalam penelitian ini adalah strain psychrophilic
yang diisolasi dari susu mentah.E. colistrain DH5α
(TIANGEN Biotech (Beijing) Co., Ltd.) dan BL21 (DE3)
(TIANGEN Biotech (Beijing) Co., Ltd.) digunakan sebagai
host kloning dan ekspresi berlebih. Plasmid pET-22b(+)
dibeli dari Novagen (Madison, WI) dan digunakan sebagai
vektor ekspresi. DNA polimerase dan enzim restriksi Xho
SAYA,ramah lingkunganRI, danNdeSaya dibeli dari NEB
(New England Biolabs). Primer oligonukleotida dan peptida
sinyal yang digunakan dalam penelitian ini disintesis oleh
BGI (Beijing, China) Co., Ltd.
Konstruksi vektor ekspresi lipase
Pseudomonas fluorescensBJ-10 ditumbuhkan dalam kaldu
nutrisi (10 g/l pepton, 5 g/l NaCl, 3 g/l ekstrak ragi, dan
Halaman 9 dari 12
Tabel 1 Oligonukleotida yang digunakan dalam percobaan
Oligonukleotida Urutan (5–3)
PFL-22b (hulu)sebuah CCGCATATGGGTGTCTACGACTACAAA
AACC
PFL-22b (hilir)sebuah CCGCTCGAGGGTAATCACAAACGCCTCCG
PFL-SP-22b (hulu)b CCGGAATCCATGGGTGTCTACGACTA
PFL-SP-22b (hilir)b CCGCTCGAGGGTAATCACAAACGCCT
pET-PFL (hulu)c GGGGAATTGTGAGCGGATAAC
pET-PFL (hilir)c TGGCAGCAGCCAACTCAG
16s-referensi (hulu)d AATCATCATGCCCCTTATGACC
16s-referensi (hilir)d GTGCAGCCTACAATCCGAAC
Target PFL (hulu)e GGTGGAAGTCCTGGGCAAAAT
Target PFL (hilir)e CGCCGATGGAATCAACAA
sebuahPrimer PFL-22b digunakan untuk mengamplifikasi sekuens panjang penuh gen lipase lipBJ10,
denganNdesaya danXhoSaya membatasi situs (digarisbawahi), masing-masing
bUntuk fusi dengan enam peptida sinyal yang berbeda, primer PFL-SP-22b digunakan untuk
mengamplifikasi sekuen panjang penuh gen lipase lipBJ10, denganramah lingkunganRI danXhoSaya
membatasi situs (digarisbawahi), masing-masing
cPrimer pET-PFL digunakan untuk memverifikasi urutan plasmid rekombinan
dReferensi 16s primer digunakan untuk memperkuatE. coliurutan 16 detik
ePrimer PFL-target dirancang untuk lipBJ10
1 g/l glukosa, pH 7,0) pada 28 °C dan 200 rpm selama 24
jam. DNA genom, diisolasi dengan menggunakan Kit DNA
Bakteri TIANamp (TIANGEN Biotech (Beijing) Co., Ltd.),
digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi reaksi
berantai polimerase (PCR) dari sekuens lipBJ10 (GenBank
Accession No. KY939609). Urutan panjang penuh gen
lipase lipBJ10 diamplifikasi dengan menggunakan primer
PFL-22b (Tabel1). Produk PCR, mengkodekan lipBJ10
matang, dan plasmid pET-22b(+) keduanya dicerna dengan
enzim restriksiNdesaya danXhoI, dan kemudian fragmen
diikat dengan ligase T4 (TIANGEN Biotech (Beijing) Co.,
Ltd.) pada 16 °C semalaman. Plasmid yang dihasilkan,
tanpa peptida sinyal, diberi nama pET-SigPFL00.
Untuk konstruksi vektor dengan peptida sinyal yang berbeda,
plasmid rekombinan baru bernama pET-SigPFL disiapkan sebagai
berikut. Gen lipBJ10 diamplifikasi menggunakan primer yang
disintesis PFL-SP-22b (Tabel1) untuk menghasilkan fragmen
sekitar 1848-bp dengan terminalramah lingkunganRI dan XhoSaya
membatasi situs. Produk DNA hasil sintesa PCR diklon menjadi
pET-22b(+) yang telah dicerna oleh enzim restriksiramah
lingkunganRI danXhoI. Plasmid rekombinan yang dihasilkan, pET-
SigPFL, diubah menjadi
E. colisel DH5α. Rekombinan dipilih pada pelat agar LB
pada 37 °C (1% (b/v) NaCl, 1% (b/v) tripton, 0,5% (b/v)
ekstrak ragi, dan 2% (b/v) agar, pH 7,0) mengandung 100
g/ml ampisilin. Rekombinan positif diinokulasi dan dikultur
dalam media cair LB (1% (b/v) NaCl, 1% (b/v) tryptone, dan
0,5% (b/v) ekstrak ragi, dan pH 7,0) yang mengandung 100
g/ml ampisilin pada 37 ° C selama 12 jam, dan plasmid
pET-SigPFL diisolasi dan kemudian diverifikasi urutannya
menggunakan primer pET-PFL (Tabel1).
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50 Halaman 10 dari 12

Tabel 2 Urutan nukleotida peptida sinyal yang digunakan dalam penelitian ini dan jalur sekretori diduga yang mereka ikuti

Nama regangan Nama plasmid Diduga Sinyal Urutan nukleotida peptida sinyal Rekombinan
sekresi peptida nama lipBJ10
jalan nama

BL21-NULL pET-22b(+) - - - -
BL2-00 pET-SigPFL00 - - - S(-)-bibirBJ10

BL21-01 pET-SigPFL01 DETIK PelB ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCC PelB-bibirBJ10

CAGCCGGCGATGGCC
BL21-02 pET-SigPFL02 SRP DsbA ATGAAAAAAATTTGGCTGGCGCTGGCGGGCTGGTGCTGGCGTTTAGCGCT DsbA-lipBJ10
AGCGCC
BL21-03 pET-SigPFL03 TAT+Detik FhuD ATGAGCGGCCTGCCGCTGATTAGCCGCCGCCGCCTGCTGACCGCGATGGCG FhuD-bibirBJ10
CTGAGCCCCGCTGCTGTGGCAGATGAACACCGCGCATGCC
BL21-04 pET-SigPFL04 TAT+Detik MdoD ATGGATCGCCGCCGCTTTATTAAAGGCAGCATGGCGATGGCGGCGGTGTGC MdoD-bibirBJ10
GGCACCAGCGGCATTGCTAGCCTGTTTAGCCAGGCGGCGTTTGCC
BL21-05 pET-SigPFL05 DETIK ompa ATGAAAAAAACCGCGATTGCGATTGCGGTGGCGCTGGCGGGCTTTGCG OmpA-bibirBJ10
ACCGTGGCGCAGGCC
BL21-06 pET-SigPFL06 TAT+Detik YcdO ATGACCATTAACTTTCGCCGCAACGCGCTGCAGCTGAGCGTGGCGGCGCTG YcdO-bibirBJ10
TTTAGCAGCGCGTTTATGGCGAACGCC

Plasmid pET-SigPFL kemudian dicerna dengan enzim restriksi Strain BL21 (DE3) juga ditumbuhkan dalam 20 ml media cair
Ndesaya danramah lingkunganRI dan kemudian diikat dengan LB tetapi tanpa ampisilin pada suhu 37 °C dan 200 rpm. Ketika
enam sekuens nukleotida peptida sinyal yang berbeda pada kerapatan optik (OD) pada 600 nm mencapai 1,0–1,2,
16 °C semalaman menggunakan ligase T4. Plasmid yang isopropil-β-D-thiogalactoside (IPTG) ditambahkan ke
dihasilkan, masing-masing dengan peptida sinyal yang konsentrasi akhir 0,2 mM atau 1,0 mM untuk menginduksi
berbeda, diberi nama pET-SigPFL01, pET-SigPFL02, pET- ekspresi lipBJ10, dan suhu diturunkan hingga 20 ° C.
SigPFL03, pET-SigPFL04, pET-SigPFL05 dan pET-SigPFL06 (Tabel
2). Urutan semua plasmid rekombinan diverifikasi Persiapan protein periplasma
menggunakan primer pET-PFL. Setelah 40 jam induksi pada 20 ° C, sel-sel yang dikultur
dipanen dengan sentrifugasi pada 10.000gdan 4°C selama 5
menit. Fraksi periplasma dibuat dengan memodifikasi metode
Kondisi kultur dan induksi ekspresi lipBJ10
yang dijelaskan sebelumnya [36]. Sel-sel yang dipanen
Meskipun banyak protein rekombinan telah berhasil
disuspensikan kembali dalam 1 ml buffer ekstraksi
diproduksi menggunakanE. colisebagai inang, protein
periplasmik dingin I (20% (b/v) sukrosa, 100 mM Tris–HCl, pH
ini sering diproduksi dalam bentuk badan inklusi.
8,0). Campuran diinkubasi dalam es selama 30 menit. Sel-sel
Secara umum, menurunkan suhu budidaya merupakan
dipelet pada 10.000gdan 4°C selama 10 menit. Supernatan,
strategi yang efektif untuk mengatasi pembentukan
yaitu fraksi periplasma, dihilangkan dengan pipet. Fraksi pelet
badan inklusi yang tidak larut dan/atau tidak berfungsi
yang tersisa disuspensikan kembali dalam 1 ml buffer
dalamE. coli. Metode budidaya perubahan suhu telah
ekstraksi periplasmik II (50 mM MgCl2) dan diinkubasi dalam
dilaporkan [33,34]. Seluruh proses fermentasi dibagi
es selama 20 menit. Sel-sel dipelet pada 10.000gdan 4°C
menjadi dua tahap; yaitu, fag pertumbuhan sel dan fag
selama 10 menit. Supernatan, yang merupakan fraksi syok
ekspresi berlebih protein. Strain inang dibudidayakan
osmotik, diperoleh kembali dan digabungkan dengan fraksi
pada suhu pertumbuhan optimum (fase pertumbuhan
periplasma. Campuran tersebut mewakili fraksi periplasma
sel) dan, selanjutnya, suhu budidaya dikurangi untuk
sel.
ekspresi protein (fase produksi protein) [35]. Dalam
studi profase, kami telah menyelidiki pengaruh suhu
Supernatan sitoplasma dan badan inklusi (IBs)
pasca-induksi yang berbeda pada ekspresi efisien
Pelet yang tersisa, tanpa fraksi periplasmanya, disuspensikan
protein target lipBJ10 kami. Hasil penelitian
kembali dalam 3 ml buffer lisis (50 mM Tris-HCl, pH 8,0) dan
menunjukkan bahwa suhu optimum pasca induksi
disonikasi untuk benar-benar mengganggu sel. IB dipelet
adalah 20 °C (data tidak ditampilkan).
dengan sentrifugasi pada 12.000g selama 15 menit, dan
Ketujuh plasmid rekombinan dan plasmid kosong pET-22b(+)
supernatan yang dikumpulkan dilambangkan sebagai
(Tabel2) diubah menjadi BL21 (DE3) yang menghasilkan delapan
supernatan sitoplasma. IB disiapkan sebagai berikut. IB dicuci
galur yang berbeda. Kedelapan galur ini ditumbuhkan dalam 20
dengan 3 ml buffer lisis yang mengandung 2% Triton X-100
ml medium cair LB yang mengandung 100 g/ml ampisilin pada
dan dibuat pelet
suhu 37 °C dan 200 rpm. Kontrol
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50
lagi dengan sentrifugasi pada 12.000gselama 15 menit.
Pelet kemudian disuspensikan kembali dalam 1 ml buffer
denaturasi (50 mM Tris-HCl, 8 M urea, dan 20 mM
-mercaptoethanol, pH 8,0), dan supernatan yang
dikumpulkan dilambangkan sebagai IB terlarut.
Aktivitas lipase
Uji aktivitas lipase dilakukan dengan metode kolorimetri
yang dimodifikasi, menggunakanp-nitrofenil kaprilat
sebagai substrat. Secara singkat, 200 l buffer (50 mM Tris–
HCl, pH 8.0), 20 l larutan substrat (5 mMp-nitrofenil kaprilat
dilarutkan dalam asetonitril), dan 20 l sampel
ditambahkan. Setelah campuran diaduk, diinkubasi pada
suhu 45 °C selama 20 menit dan kemudian diukur
penyerapannya pada 405 nm menggunakan pembaca
Microplate (BIO-RAD Model 680) yang dibeli dari Bio-Rad
Laboratories, Inc. (Hercules, California, AMERIKA SERIKAT).
Satu unit aktivitas lipase (U) didefinisikan sebagai
pelepasan 1 molp-nitrofenol per menit.
Kuantisasi protein dan SDS PAGE
Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan uji asam
bicinchoninic (BCA).37] dengan bovine serum albumin
(BSA) sebagai standar. Elektroforesis gel natrium dodesil
sulfatepoliakrilamida (SDS-PAGE) dilakukan menurut
metode Laemmli (1970) [38] menggunakan pemisahan
poliakrilamida 12% dan gel susun poliakrilamida 5% pada
peralatan mini-gel vertikal (Bio-Rad) pada 120 V selama 1,5
jam. Gel diwarnai dengan Coomassie briliant blue R-250
(Bio-Rad) untuk mendeteksi protein dan dianalisis dengan
menggunakan sistem analisis pencitraan gel
(AlphaEaseFC). Pita protein relatif diukur dengan
pemindaian skala abu-abu dengan perangkat lunak
mandiri sistem.
Analisis PCR real-time kuantitatif
Total RNA diekstraksi dari sel menggunakan RNAprep Pure
Cell/Bacteria Kit (TIANGEN Biotech, Beijing, China) sesuai
dengan protokol pabrikan. Transkripsi terbalik dilakukan
dengan FastQuant RT Kit (TIANGEN Biotech, Beijing, China)
mengikuti instruksi pabrik. PCR real-time kuantitatif
dilakukan menggunakan SuperReal PreMix Plus (SYBR
GREEN) (TIANGEN Biotech, Beijing, China), dan amplifikasi
fluoresensi dilakukan menggunakan Sistem PCR ABI 7500
Fast Real-time (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ).
Primer oligonukleotida yang digunakan untuk analisis PCR
real-time kuantitatif tercantum dalam Tabel1. ItuE. coli 16s
mRNA digunakan sebagai kontrol internal. Kuantitas relatif
ekspresi gen lipBJ10 dihitung menggunakan metode
ambang siklus komparatif (∆∆Ct) [39].
Halaman 11 dari 12
Mikroskop elektron transmisi
Analisis morfometrik dilakukan dengan menggunakan
mikroskop elektron transmisi (TEM) Hitachi H-7650B
(Hitachi, Jepang).40].
Pengaruh suhu pada aktivitas dan termostabilitas
lipBJ10
Pengaruh suhu pada aktivitas lipBJ10 diuji dalam
kisaran 4 hingga 90 °C dalam buffer Tris-HCl (50 mM,
pH 8,0). Aktivitas optimal lipBJ10 ditemukan terjadi
pada pH 8,0 (data tidak ditampilkan). Aktivitas lipase
residual dihitung dengan aktivitas enzim pada suhu
optimum yang diatur ke 100%. Termostabilitas lipBJ10
diselidiki dengan menginkubasi larutan enzim pada
berbagai suhu (45-80 °C) selama 15, 30, 60, dan 90
menit. Aktivitas residu enzim diukur dalam buffer Tris-
HCl (50 mM, pH 8,0) pada 45 °C di bawah prosedur
pengujian standar. Untuk menyelidiki sifat-sifat protein
lipBJ10 yang diekspresikan secara berlebihan olehE. coli
BL21-02, lipase rekombinan yang diekstraksi dari ruang
periplasmik dimurnikan dengan menggunakan
kromatografi afinitas nikel (Ni-NTA) dengan sistem
purifier AKTA untuk memanfaatkan tag histidin [36].
Kontribusi penulis
WQZ merancang dan melakukan eksperimen dan menulis naskah. XYP
merancang kloning dan ekspresi eksperimen dan, bersama dengan JL,
berpartisipasi dalam penyusunan naskah. SWZ dan LL memberikan banyak
bantuan dalam menganalisis data. JPL menyusun ide awal ekspresi fusi dan
memoles naskahnya. Semua penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.
Ucapan Terima Kasih
Tak dapat diterapkan.
Kepentingan bersaing
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki kepentingan yang bersaing.
Ketersediaan data dan bahan
Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini termasuk dalam artikel yang diterbitkan ini.
Persetujuan untuk publikasi Tak
dapat diterapkan.
Persetujuan etika dan persetujuan untuk berpartisipasi Tak
dapat diterapkan.
Pendanaan
Penelitian ini didukung secara finansial oleh National Natural Science Foundation
of China (Hibah No. 31371808 & 31471603).
Catatan Penerbit
Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta
yang diterbitkan dan afiliasi institusional.
Diterima: 19 September 2017 Diterima: 17 Maret 2018
Zhangdkk. Fakta Sel Mikrob (2018) 17:50
Referensi
1. Schmid RD, Verger R. Lipase: enzim antarmuka dengan aplikasi yang menarik.
Angew Chem Int Ed. 2010;37:1608–33.
2. Hasan F, Shah AA, Hameed A. Aplikasi industri lipase mikroba. Teknologi
Mikroba Enzim. 2006;39:235–51.
3. Demirjian DC, MorıŚ-Varas F, Cassidy CS. Enzim dari ekstrofil. Curr
Opin Chem Biol. 2001;5:144–51.
4. Abdel-Fattah YR, Gaballa AA. Identifikasi dan ekspresi berlebih dari lipase
termostabil dariGeobacillus thermoleovoransToshki diEscherichia coli.
Mikrobiol Res. 2008;163:13–20.
5. Pfeffer J, Richter S, Nieveler J, Hansen CE, Rhlid RB, Schmid RD, Rusnak M.
Ekspresi lipase A hasil tinggi dariCandida antartikadalam ragi
methylotrophicPichia pastorisserta pemurnian dan karakterisasinya.
Appl Microbiol Biotechnol. 2006;72:931–8.
6. Sistem ekspresi bakteri Chen R. untuk produksi protein rekombinan:
E.coli dan seterusnya. Bioteknologi Adv. 2012;30:1102.
7. Hoffmann F, Heuvel JVD, Zidek N, Rinas U. Meminimalkan pembentukan
tubuh inklusi selama produksi protein rekombinan diEscherichia colipada
skala bench dan pilot plant. Teknologi Mikroba Enzim. 2004;34:235–41.
8. Esposito D, Chatterjee DK. Peningkatan ekspresi protein terlarut
melalui penggunaan tag fusi. Curr Opin Bioteknologi. 2006;17:353–8.
9. Shokri A, Sandén AM, Larsson G. Sel dan desain proses untuk penargetan
protein rekombinan ke dalam media kulturEscherichia coli. Appl Microbiol
Biotechnol. 2003;60:654–64.
10. Jermy A. Sekresi bakteri mengubah roda penggerak dalam sekresi tipe VI. Mikrobiol
Nat Rev. 2009;7:175.
11. Johnson TL, Abendroth J, Hol WGJ, Sandkvist M. Sekresi Tipe II: dari
struktur ke fungsi. Mikrobiol FEMS Lett. 2006;255:175–86.
12. Sørensen HP, Mortensen KK. Strategi genetik canggih untuk ekspresi protein
rekombinan diEscherichia coli. J. Bioteknologi. 2005;115:113–28.
13. Soares CR, Gomide FI, Ueda EK, Bartolini P. Ekspresi periplasmik hormon
pertumbuhan manusia melalui vektor plasmid yang mengandung promotor
lambdaPL: penggunaan HPLC untuk kuantifikasi produk. Protein Eng.
2003;16:1131–8.
14. Mukherjee KJ, Rowe DC, Watkins NA, Summers DK. Studi ekspresi antibodi
rantai tunggal dalam diamEscherichia coli. Mikrobiol Lingkungan Appl.
2004;70:3005–12.
15. Makrides SC. Strategi untuk mencapai ekspresi gen tingkat tinggi di
Escherichia coli. Microbiol Rev. 1996;60:512–38.
16. Chung BH, Sohn MJ, Oh SW, Park US, Poo H, Kim BS, Yu MJ, Lee YI. Kelebihan produksi
faktor perangsang granulosit-koloni manusia yang menyatu dengan peptida sinyal
pelB diEscherichia coli. J Fermentasi Bioeng. 1998;85:443–6.
17. Betton JM, Hofnung M. Melipat protein pengikat maltosa mutan dari
Escherichia coliyang membentuk badan inklusi. J Biol Chem. 1996;271:8046.
18. Deeth HC, FitzGerald CH. Enzim lipolitik dan ketengikan hidrolitik. Adv Dairy
Chem. 2006; 2:481–556.
19. Zhang S, Lv J. Pemurnian dan sifat protease ekstraseluler yang stabil
terhadap panas dariPseudomonas fluorescensBJ-10. J Food Sci Technol.
2014;51:1185–90.
20. Mergulhão FJ, Summers DK, Monteiro GA. Sekresi protein rekombinan di
Escherichia coli. Bioteknologi Adv. 2005;23:177.
21. Rokney A, Shagan M, Kessel M, Smith Y, Rosenshine I, Oppenheim AB.E. coli
mengangkut protein agregat ke kutub dengan proses yang spesifik dan
bergantung pada energi. J Mol Biol. 2009;392:589–601.
22. Hannig G, Makrides SC. Strategi untuk mengoptimalkan ekspresi protein
heterolog dalamEscherichia coli. Tren Bioteknologi. 1998;16:54.
23. Georgiou G, Segatori L. Ekspresi preparatif protein yang disekresikan pada
bakteri: laporan status dan prospek masa depan. Curr Opin Bioteknologi.
2005;16:538.
24. Mujacic M, Bader MW, Baneyx F.Escherichia coliHsp31 berfungsi sebagai
holding chaperone yang bekerja sama dengan sistem DnaK-DnaJ-GrpE
dalam pengelolaan protein misfolding dalam kondisi stres berat. Mikrobiol
Mol. 2004;51:849–59.
Halaman 12 dari 12
25. Baneyx F, Mujacic M. Pelipatan dan pelipatan protein rekombinan di
Escherichia coli. Nat Bioteknologi. 2004;22:1399.
26. Ito K, Inaba K. Sistem pembentukan ikatan disulfida (Dsb). Curr Opin
Struct Biol. 2008;18:450–8.
27. Kurokawa YS-K, Yanagi HT-S, Yura TK-S. Plasmid ekspresi DsbA/DsbB/
DsbC/DsbD. Paten AS 6673569; 2004.
28. Sun XW, Wang XH, Yao YB. Co-ekspresi protein Dsb memungkinkan ekspresi larut dari
fragmen variabel rantai tunggal (scFv) terhadap reseptor faktor pertumbuhan
seperti insulin tipe 1 manusia (IGF-1R) diE. coli. Dunia J Mikrobiol Bioteknologi.
2014;30:3221–7.
29. Pan H, Xie Z, Bao W, Zhang J. Optimalisasi kondisi kultur untuk meningkatkan
produksi cis-epoksi suksinat hidrolase diEscherichia colidengan metodologi
permukaan respon. Biochem Eng J. 2008;42:133–8.
30. Chakraborty K, Paulraj R. Pemurnian dan karakterisasi biokimia dari lipase
ekstraseluler dariPseudomonas fluorescensMTCC 2421. J Pertanian Makanan
Kimia. 2009;57:3859.
31. Zhang A, Gao R, Diao N, Xie G, Gao G, Cao S. Kloning, ekspresi dan
karakterisasi lipase toleran pelarut organik dariPseudomonas
fluorescensJCM5963. Enzim J Mol Katalis B. 2009;56:78–84.
32. Chung GH, Lee YP, Yoo OJ, Rhee JS. Ekspresi berlebih dari gen lipase
termostabil dariPseudomonas fluorescensdiEscherichia coli. Appl Microbiol
Biotechnol. 1991;35:237–41.
33. Baedeker M, Schulz GE. Ekspresi berlebih dari gen 2,2 kb yang dirancang
dari fenilalanin amonia-liase eukariotik diEscherichia coli. FEBS Lett.
1999;457:57–60.
34. Hoshino K, Itoh K, Masubuchi A, Adachi M, Asakawa T, Watanabe N, Kosaka T,
Tanaka Y. Kloning, ekspresi, dan karakterisasi aldehida oksidase hati monyet
cynomolgus jantan. Biol Pharm Banteng. 2007;30:1191–8.
35. Semba H, Ichige E, Imanaka T, Atomi H, Aoyagi H. Produksi yang efisien dari
singkong hidroksinitril liase bentuk aktif rekombinan menggunakan Escherichia
coli dalam kultur suhu rendah. Appl Microbiol Biotechnol. 2008;79:563–9.
36. Rouet R, Lowe D, Dudgeon K, Roome B, Schofield P, Langley D, Andrews
J, Whitfeld P, Jermutus L, Kristus D. Ekspresi fragmen antibodi manusia
afinitas tinggi pada bakteri. Protokol Nat. 2012;7:364–73.
37. Walker JM. Uji asam bicinchoninic (BCA) untuk kuantisasi protein.
Metode Mol Biol. 1994;32:5.
38. Laemmeli Inggris. Pembelahan protein struktural selama perakitan
kepala ke bakteriofag T4. Alam. 1970;227:680.
39. Livak KJ, Schmittgen TD. Analisis data ekspresi gen relatif
menggunakan PCR kuantitatif real-time dan metode 2(−ΔΔC(T)).
Metode. 2001;25:402–8.
40. Ono B, Kubota M, Kimiduka H, Kawaminami H, Ueto T, Yokosawa S, Iseda
M, Yamamoto Y, Murakami Y, Yokota S. Produksi protein fusi pembentuk
polimer diEscherichia coliregangan BL21. Biosci Biotechnol Biochem.
2006;70:2813–23.
Kirimkan naskah Anda berikutnya ke BioMed Central dan kami
akan membantu Anda di setiap langkah:
• Kami menerima pertanyaan pra-pengajuan
• Alat pemilih kami membantu Anda menemukan jurnal yang paling relevan
• Kami menyediakan dukungan pelanggan sepanjang waktu
• Pengiriman online yang nyaman
• Tinjauan sejawat yang menyeluruh
• Penyertaan dalam PubMed dan semua layanan pengindeksan utama
• Visibilitas maksimum untuk penelitian Anda
Kirimkan naskah Anda di
www.biomedcentral.com/submit