JENIS-JENIS AFFINITY PURIFICATION

Untuk menentukan metode affinity purification yang akan digunakan untuk memurnikan protein target serta mendapatkan hasil akhir pemurnian yang sesuai dengan keinginan kita, ada beberapa hal yang harus menjadi pertimbangan. Hal-hal tersebut diantaranya menentukan prioritas dari hasil pemurnian yang diinginkan (misalnya, tingkat kemurnian tinggi atau yield tinggi), batasan-batasan teknis, dan kondisi buffer. Berikut ini akan dijelaskan beberapa sistem affinity purification yang paling umum digunakan. 1. Antibody Purification Beberapa metode pemurnian antibodi melibatkan teknik affinity purification. Produksi antibodi skala lab pada umumnya melibatkan volume serum yang relative kecil, cairan asites, atau kultur supernatan. Antibodi harus dipurifikasi sebagian ataupun keseluruhannya, tergantung pada bagaimana antibodi tersebut akan digunakan untuk berbagai metode pengujian dan deteksi. Tiga tingkat spesifikasi permurnian diantaranya: Pengendapan dengan ammonium sulfat [(NH4)2.SO4], teknik

sederhana ini memberikan pemurnian mentah immunoglobulin total dari serum protein lainnya. Affinity purification dengan protein A, G, A/G, atau L yang dilumpuhkan (immobilized). Protein-protein tersebut mengikat

sebagian besar spesies dan sub-sub kelas IgG, jenis immunoglobulin paling melimpah yang dihasilkan oleh mamalia dalam responnya terhadap imunogen. Resin dan alat purifikasi siap pakai yang

dilengkapi dengan protein ini tersedia dalam berbagai macam ukuran dan format. Affinity purification dengan antigen yang dilumpuhkan. Antigen terpurifikasi yang dilumpuhkan secara kovalen (misalnya, peptide atay hapten digunakan sebagai imunogen untuk meginduksi produksi dari host) terhadap dukungan afinitas memungkinkan antibodi spesifik untuk dimurnikan dari sampel minyak mentah.

Antibodybinding Protein Protein A

Spin Column N/A

Drip Column 1mL

Kit (spin/drip) 1mL drip

FPLC Cartridge N/A

Bulk Resin

Spin Plate N/A Yes

5mL, 25mL 1mL, Protein A High- 0.2mL, 0.2mL, 1mL N/A 1mL, 5mL 5mL, Capacity 1mL, 5mL spin 25mL 2mL, 0.2mL, 0.2mL, 1mL Protein G N/A 1mL, 5mL 10mL, 1mL, 5mL spin 25mL 0.2mL, 0.2mL, 1mL 3mL, Protein A/G N/A 1mL, 5mL 1mL, 5mL spin 15mL 0.2mL, 0.2mL, 1mL 2mL, Protein L N/A 1mL, 5mL 1mL, 5mL spin 10mL Tabel 1. Format yang Tersedia Untuk Imobilisasi Antibody-Binding Protein dengan Resin Agarose.(Sumber: http://piercenet.com)

Yes N/A N/A

Gambar 1. Hasil Purifikasi Antibodi dengan Spin Column. (Sumber: http://piercenet.com) 2. Antigen Purification Dengan Antibodi Antibodi spesifik memang sering digunakan dalam pengujian untuk mendeteksi antigen yang sesua, akan tetapi ia juga dapat dipakai untuk memurnikan antigen. Akan tetapi, karena antibodi spesifik harganya mahal untuk dipergunakan secara komersial, metode pendekatan ini jarang digunakan dalam skala besar. Sebaliknya, pernggunaannya sangat sering dijumpai pada skala yang sangat kecil, misalnya dalam uji imunopresipitasi. Namun jika tersedia antibodi yang diperlukan, ia dapat diamobilisasi secara kovalen dengan beaded agarose atau affinity support lainnya..

Reaksi antigen-antibodi dapat diketahui dengan menggunakan metode Dot Blot. Dot Blot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis, dan mengidentifikasi protein. Teknik ini menyerupai Western Blot namun perbedaannya adalah protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan tetapi ditandai dengan template sirkuler secara langsung pada substrat kertas. Konsentrasi protein dalam preparasi mentah atau kasar (misalnya kultur supernatan) dapat diperkirakan secara semikuantitatif dengan menggunakan teknik ini jika dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi untuk protein tersebut. Beberapa langkah yang harus dikerjakan dalam proses Dot Blot adalah menyiapkan membran, dan menandainya dengan grid menggunakan pensil untuk mengindikasikan daerah yang akan di blot. Sampel yang akan diuji diteteskan pada membran nitroselulosa pada bagian tengah kisi (grid) yang telah digambar pada membran tersebut dan dibiarkan kering. Situs yang tidak spesifik kemudian diblok dengan merendam membran dalam Bovine Serum Albumin (BSA) dan diinkubasi dalam antibodi primer selama 30 menit suhu ruang. Langkah berikutnya adalah pencucian dengan PBS-T selama kurang lebih 3 kali masing-masing 5 menit dan dinkubasi pada antibodi sekunder yang terkonjugasi dengan HRP. Pencucian dilakukan kembali setelah proses tersebut selesai dan dipaparkan pada film X-ray pada ruang gelap. (Nature Publishing Group, 2009).

Gambar 2. Interaksi Antigen dan Antibodi (Sumber: http://piercenet.com) 3. Immunoprecipitation dan Co-immunoprecipitation

Teknik imunopresipitasi merupakan salah satu cara yang masih banyak dipakai untuk menganalisis atau mengukur kadar antigen atau antibodi dalam skala kecil. Antibodi yang direaksikan dengan antigen spesifik. Membentuk kompleks yang tidak larut (presipitat) yang dapat dianalisis dengan berbagai cara. Reaksi presipitasi dapat dilangsungkan dalam media cair maupun media semisolid (gel). Dalam menerapkan teknik ini perlu dipertimbangkan beberapa keterbatasan. Hal yang paling menentukan adalah spesifisitas antiserum atau antibodi yang digunakan, dan larutan standard yang stabil dengan kadar yang pasti. Di samping itu reaksi imunopresipitasi dipengaruhi oleh berbagai faktor, di antaranya afinitas antibodi. Afinitas antibodi menentukan deritjat stabilitas kompleks antigen-antibodi pada tempat pengikatan (antigen binding site). Kompleks antigen-antibodi yang terbentuk cenderung berdisosiasi bila antibodi mempunyai afinitas yang lemah, sebaliknya makin tinggi aviditas antibodi makin stabil kompleks yang terbentuk: Selain itu masih ada faktorfaktor lain yang b'erpengaruhmisalnya suhu, pH dan molaritas larutan yang dipakai, dan yang tidak boleh diabaikan adalah perbandingan antara konsentrasi antigen dengan antibodi dalam reaksi. Co-Immunopresipitasi (Co-IP) melibatkan percobaan untuk

menangkap dan mendeteksi, tidak hanya antigen yang diinginkan, tetapi juga setiap protein dalam mileu dari lisat seluler yang berinteraksi (terikat) dengan antigen. Dalam format tradisional dengan Protein A atau Protein G, skema pemurnian melibatkan tidak kurang dari tiga level interaksi afinitas.

Gambar 4. Hasil IP dengan Beberapa Jenis Antibodi Anti-c-Myc Amobilik. (Sumber: http://piercenet.com) 4. Pull-Down Assays Seperti Co-imunopresipitasi, uji pull-down adalah pendekatan afinitas yang sering digunakan untuk mempelajari interaksi protein-protein Namun. Berbeda dari IP atau Co-IP, metode ini tidak melibatkan antibodi spesifik dari protein target yang sedang dipelajari. Persyaratan minimal untuk uji pull-down adalah ketersediaan protein yang sudah termurnikan dan ditandai dengan tag (umpan) yang digunakan untuk menarik ke bawah (pull-down) protein-binding partner-nya (mangsa). Protein umpan diciptakan melalui cloning dan ekspresi protein fusi atau sebagai modifikasi kovalen, misalnya penambahan tag biotin. Protein umpan yang ber-tag (misalnya, biotinylated) dapat diamobilisasi pada tag-specific affinity support (misalnya streptavidin). Protein umpan terlumpuhkan kemudian diinkubasi dengan larutan protein yang dapat mengekspresikan protein mangsa yang terikat dengan protein umpan. Kompleks protein-protein umpan dan mangsa ini kemudian dapat diidentifikasi. Alternatif lainnya, support teraktivasi dapat digunakan untuk melumpuhkan langsung hamper seluruh molekul umpan.

Gambar 5. Contoh Interaksi Bait-Prey Protein (Sumber: http://piercenet.com)

5. Fusion Tag Protein Purification Ketika protein terekspresikan secara rekombinan, asam amino tambahan, domain fungsional, maupun seluruh protein sering ditambahkan untuk membantu dalam pemurnian dan manipulasi. Penambahan-penambaan terhadap protein rekombinan ini dikenal sebagai fusion tag, dan ditambahkan ke DNA yang mengkode urutan protein asli. Salah satu fusion tag yang paling umum adalah short string dari enam sampai Sembilan residu histidin (dikenal sebagai tag 6His atau tag PolyHis), yang akan mengikat ion logam seperti nikel atau kobalt. Fusion tag lainnya adalah Glutathione S Transferase (GST), yan mengikat erat glutation tereduksi. Fusion tag lainnya meliputi HA, Myc, FLAG* (Sigma-Aldrich Co.), MBP, SUMO, dan Protein A. Sifat-sifat fusion tag memungkinkan protein tag untuk dimanipulasi dengan mudah di laboratorium. Paling signifikan, tag-ligan yang

terkarakterisasi dengan baik ini memungkinkan purifikasi afinitas langkah tunggal dari molekul ber-tag menggunakan ligan versi amobil yang sesuai. Antibodi-antibodi terhadap fusion tag juga banyak tersedia untuk digunakan dalam deteksi downstream dan metode uji, mengurangi kebutuhan untuk memperoleh maupun mengembangkan penyelidikan untuk setiap protein rekombinan yang spesifik. 6. Avidin-Biotin Systems Biotin (juga dikenal sebagai vitamin H), adalah molekul kecil (MW 244.3) yang hadir dalam jumlah kecil di semua sel hidup. Sisi rantai molekul biotin yang memiliki asam valerat dapat diderivatisasi untuk menggabungkan berbagai kelompok reaktif yang sering digunakan untuk menempelkan biotin ke molekul lainnya. Setelah biotin melekat pada molekul, molekul tersebut dapat dipurifikasi afinitas karena beberapa protein, yaitu avidin dan streptavidin, diketahui mengikat kuat dan khusus untuk kelompok biotin. Protein avidin dan streptavidin tersedia baik dalam bentuk asli maupun rekombinan yang terpurifikasi. Bersama-sama, biotin dan varian avidin membuat sistem afinitas yang sangat kuat untuk adaptasi terhadap berbagai jenis aplikasi penelitian. Streotavidin agaore resin (support streptavidin amobil) memungkinkan purifikasi atau imobilisasi sekunder dari protein berlabel biotin.

Gambar 6. Interaksi Avidin dan Biotin (Sumber: http://piercenet.com) 7. Class Enrichment and Isolation Sebagai tambahan affinity support dan ligan yang memungkinkan pemurnan target yang sangat spesifik (misalnya, antigen tertentu atau tag hasil rekayasa), beberapa jenis ligan mengaktifkan pengayaan umum atau isolasi molekul biologis kelas tertentu. Protein A dan protein G (seperti yang sudah dijelaskan di atas) dapat dianggap sebagai contoh dari jenis sistem afinitas ini, karena mereka mengikat immunoglobulin umum. Biasanya, kelompok properti kimia atau kelompok fungsional yang dimiliki bersama oleh semua anggota target yang ditetapkan molekul dapat menjadi dasar untuk pengayaan atau skema isolasi jika ligan afinitas yang sesuai dapat diidentifikasi. Modifikasi pasca-translasi (PTM) adalah contoh dari kelompok fungsional molekul yang mendefinisikan atau justru sama sekali tidak terkait. Baik itu fosforilasi, glikosilasi ataupun ubiquitination, PTM memiliki sifat kimia yang hanya sedikit dapat dibedakan dari keompok kimia lainnya oleh sebagian besar ligan kimia. Jadi setiap sistem afinitas hanya dapat memperkaya kelas senyawa targetnya. 8. Contaminant Removal Dalam beberapa kasus, tujuan purifikasi afinitas adalah untuk menghapus kelompok tertentu yang tidak diinginkan dari sampel komponen, daripada untuk memurnikan sebuah molekul target. Dalam hal ini, satusatunya perbedaan antara penghapusan kontaminan dan purifikasi afinitas tradisional adalah bahwa ia membutuhkan penjagaan aliran melalui sampel sehingga molekul terikat bisa dibuang. Dalam scenario seperti itu, penting bahwa binding buffer harus cocok untuk proses recovery sampel.

Penghapusan senyawa dengan berat molekul kecil dari protein atau sampel makromolekul lainnya secara umum biasanya dilakukan dengan gel filtration dibandingkan kromatografi afinitas. Namun, saat kontaminan tidak dapat dibedakan dengan ukuran dan ligan afinitas diketahui dapat secara spesifik berikatan dengan kontaminan dalam sampel tersebut, purifikasi afinitas sangat berguna. Penghapusan kontaminan oleh afinitas biasanya dilakukan pada akhir prosedur. Misalnya, deterjen yang diperlukan untuk lisis sel dan solubilisasi protein dapat mengganggu proses aplikasi downstream dan pengujian. Beberapa resin detergent-binding tersedia untuk memproses sampel dalam situasi ini. Skenario lain dimana kita menginginkan untuk menghapus komponen spesifik untuk analisis sampel proteomik serum. Seringkali, fokus analisis adalah protein yang jauh lebih berlimpah dalam sampel serum atau plasma daripada albumin dan IgG. Resin afinitas, berdasarkan antibodi anti-albumin dan anti-IgG spesifik atau berdasarkan ligan lain (Cibacron pewarna untuk mengikat albumin dan Protein A/G untuk mengikat IgG), sangat berguna dalam kasus ini.