LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM

DETEKSI MOLEKULER
(SPSBT-6203)

Disusun oleh :

Nama : Pancasari Wijiutami

NIM : 17/419981/PMU/09192
Kelompok : 1
Dosen Pengampu: Dr. Ir. Donny Widianto.
Dr. Widodo, SP., M.Sc.
Dr. Yekti Asih Purwestri, M.Si.

PROGRAM STUDI MAGISTER BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA
UNIVERSITAS GAJAH MADA
YOGYAKARTA
2018
 LAPORAN PRAKTIKUM
DETEKSI MOLEKULER
(SPSBT-6203)

ACARA II
(ISOLASI DNA PLASMID BAKTERI DAN ISOLASI PROTEIN) :
TRANSFORMASI PLASMID “A52 colon 1 PET 286”, ISOLASI DNA
PLASMID, ELEKTROFORESIS PLASMID, ISOLASI PROTEIN,
RUNNING, PROTEIN SDS-PAGE, DAN PENENTUAN KURVA BAKU

Dosen Pengampu:
Dr. Ir. Donny Widianto.
Dr. Widodo, SP., M.Sc.
Dr. Yekti Asih Purwestri, M.Si.

Disusun Oleh :
Pancasari Wijiutami
17/419981/PMU/09192

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
JUNI 2018
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Proses perpindahan gen dari satu organisme ke organisme lain, merupakan
kajian utama dalam bidang rekayasa genteika. Proses perpindahan gen memiliki
potensi yang tinggi dalam menghasilkan perbaikan genetik dengan
memperkenalkan gen asing ke dalam spesies yang tidak hanya memiliki hubungan
kekerabatan, tetapi juga bisa pada lintas kingdom. Lebih lanjut perpindahan
genetik antar organisme juga dapat dijadikan metode untuk menghasilkan produk
barang/jasa yang dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan kesejahteraan manusia,
seperti produksi biofarma, benih hibrida, dan berbagai jenis industrial.
Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara
autinom dan bisa ditemukan pada sel hidup. Sebagian besar plasmid memiliki
struktur sirkuler, namun ada juga plasmid linear yang dapat ditemukan pada
mikroorganisme tertentu. Plasmid ditemukan dalam bentuk DNA utas ganda yang
sebagian besar tersusun menjadi superkoil atau kumparan terpilin. Struktur
superkoil terjadi karena enzim topoisomerase membuat sebagian DNA utas ganda
lepas (tidak terikat) selama replikasi plasmid belangsung. Struktur superkoil akan
menyebabkan DNA plasmid berada dalam konformasi yang disebut lingkaran
tertutup kovalen atau covalently closed circular (ccc), namun apabila kedua utas
DNA terlepas maka akan plasmid akan kembali dalam keadaan normal (tidak
terpilin) dan konformasi tersebut disebut sebagai open circuler (oc) (Walid,
2014). 
Plasmid kerap dimanfaatkan sebagai vektor untuk kloning DNA, pada bidang
rekayasa genetika. Mekanisme transfer gen menggunakan vektor termasuk dalam
metode transfer gen secara tidak langsung, karena memerlukan perantaraan
organisme asing untuk memindahkan materi genetik dari satu organisme ke
organisme lain. Metode transformasi genetik tidak langsung diperkenalkan
melalui plasmid. Sebagai vektor yang ideal, DNA plasmid memiliki ori (origin of
replication) sebagai titik awal replikasi untuk perbanyakannya di dalam sel inang,
multiple cloning sites (MCS) sebagai tempat penyisipan segmen DNA atau gen
yang akan diklon atau diekspresikan, dan gen penanda seleksi, misalnya gen
resistensi antibiotik yang berguna untuk seleksi klon (Goldman and Green, 2009).
Proses Transformasi ditunjukkan pada Gambar 1 berikut:

Gambar 1. Proses Transformasi Pada Plasmid Bakteri (Budiyanto, 2012)

Beberapa karakter plasmid yang menjadi acuan dasar pemilihannya menjadi

vektor kloning, di antaranya adalah plasmid mempunyai ukuran molekul yang
kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi, plasmid
berbentuk sirkuler sehingga lebih stabil selama diisolasi secara kimia, plasmid
mempunyai titik ori (origin of replication), sehingga dapat memperbanyak diri
(bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi, plasmid juga mempunyai jumlah
kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah
banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi, dan plasmid mempunyai
penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih
memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et
al., 1994). Pada Gambar 1 ditunjukkan komponen-komponen dari vektor plasmid.

Gambar 2. Vektor Plasmid pBR322 (Promega, 2018)

 Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang heterogen. Ketika
berada di luar sel, protein menjadi tidak stabil. Untuk mempertahankan fungsi,
setiap jenis protein membutuhkan kondisi tertentu ketika diekstrasi dari normal
biological milieu. Beberapa teknik analisis protein membutuhkan prosedur isolasi,
yaitu memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memisahkan protein
dengan sifat tertentu dari protein yang lain atau tidak diinginkan dalam analisis.
Suatu teknik isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat fisik,
kimiawi dan kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan
aktivitasnya tidak berubah (Fachtiyah dkk, 2011).
Kadar protein diukur menggunakan metode bradford dengan protein kit CBB.
Kurva standar didapat dari pembacaan BS bertingkat. Pembacaan absorbansi
dilakukan pada panjang gelombang 595 nm, karena campuran berabgai jenis
protein tersebut memiliki serapan pada panjang gelombang 595 nm. Peneraan
kadar protein suatu senyawa tertentu yang terdiri dari campuran berbagai jenis
protein dapat dibuat berdsarakan kurva standar kalibrasi untuk suatu protein atau
campuran protein target (Fitri, 2010). Hasil pembacaan absorbansi sampel
kemudian diplot terhadap kurva standar untuk mengetahuo kadar protein total
dalam sampel.

B. Tujuan
Pelaksanaan praktikum ini, bertujuan sebagai berikut:
1. Mengisolasi DNA plasmid bakteri,
2. Melakukan visualisasi hasil isolasi plasmid dengan elektroforesis,
3. Melakukan transformasi plasmid,
4. Isolasi protein bakteri
5. Melakukan visualisasi dengan SDS-PAGE dan penentuan kurva baku
protein
 II. METODOLOGI

A. ALAT
1. Transformasi Plasmid
Alat yang digunakan berupa tabung eppendorf, sentrifuge, waterbath,
inkubator, dan shaker. Plating hasil transformasi alat yang digunakan adalah
Laminar Air Flow (LAF), drygalski spatel, bunsen, dan inkubator pada suhu 37oC.

2. Isolasi DNA Plasmid

Alat yang digunakan di dalam praktikum ini antara lain: shaker inkubator,
vortex, sentrifuge, lemari pendingin, mikropipet 2-20 μl, mikropipet 20-200 μl,
mikropipet 100-1000 μl, dan tip mikropipet.

3. Elektroforesis Plasmid
Alat yang digunakan pada elektroforesis plasmid antara lain: satu set alat
elektroforesis gel horizontal dan power supply, tabung erlenmeyer, neraca
analitik, microwave, UV transluminator, mikropipet 2-20 µL, mikropipet 20-200
µL, mikropipet 100-1000 µL tip mikropipet, dan parafilm.

4. Isolasi Protein
Alat yang digunakan pada isolasi protein antara lain: Sentrifuge, mikropipet 2-
20 µL, mikropipet 20-200 µL, mikropipet 100-1000 µL tip mikropipet, ependorf,
dan Sonikator.

5. Running Protein SDS-PAGE

Alat yang digunakan dalam proses running protein SDS-PAGE antara lain
satu set alat elektroforesis gel horizontal dan power supply.

6. Penentuan Kurva Baku

Alat yang digunakan dalam pembuatan kurva baku antara lain tabung
ependorf, tabung epis, mikropipet, tip pipet, vorteks, dan spectrophotometer.
B. BAHAN
1. Transformasi Plasmid
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kultur bakteri E. coli BL
21, agar lauria bertani (LB) padat, DNA plasmid, ampicilin, cloramphenicol,
ddH2O, buffer H, vektor; E. coli DHα; insert gene; enzim restriksi, larutan
transformasi berupa 0,1 M MOP pH 6,5, 0,05 M CaCl2, dan 0,01 M RbCl, es batu,
dan Tris EDTA.

2. Isolasi DNA Plasmid

Bahan yang digunakan antara lain: medium pertumbuhan bakteri (medium
LB), lysing solution I yang terdiri dari: 3,6 gram glukosa 2 M, 1.46 gram EDTA
0,5 M, 1.58 gram Tris 1 M, dan ditambahkan akuades hingga 10 ml, lysing
solution II yang terdiri dari: NaOH 200 mM = 0.8 ml NaOH + 4.2 ml akuades,
SDS 1% = 0.1 gram SDS + akuades hingga volume total 5 ml, lysing solution III
yang terdiri dari: kalium asetat 5 M (pH 4,8) = 4.91 gram, asam asetat glasial 6
ml, dan penambahan akuades hingga 10 ml, fenol dan chloroform ditambahkan
dengan perbandingan sampel: fenol: chloroform = 2:1:1,3 M Na asetat, etanol
absolut, etanol 70%, dan buffer TE, dengan komposisi buffer TE: 10 mM tris pH
8 + 1 mM EDTA pH 8 + Medium TSB 30 g/l.

3. Elektroforesis Plasmid
Bahan yang diperlukan pada tahapan ini antara lain: 100 mL larutan TBE
1x, 0,8 gram agarose, 20 µL pewarna cyber SYBR safe, 7 µL marker 1kb, dan
100kb, 1 µL loading dye.

4. Isolasi Protein
Bahan yang diperlukan untuk isolasi protein, antara lain: 10 mL kultur bakteri,
1,5 mL PBS dan es batu.

5. Running Protein SDS-PAGE

Bahan yang digunakan dalam proses running protein SDS-PAGE adalah
sebagai berikut: Stock Reagent: 30% polyacrylamide, 1.5 M Tris Ph 6.8, 1.5 M
Tris Ph 8.8, 10% SDS, 10% APS, temed, buffer running, destaining, staining, 5x
sample buffer. Komposisi SDS-PAGE: Resolving Gel (12% SDS-PAGE): 30%
polyacrylamide, 1.5 M Tris ph 8.8, 10% SDS, aquabidest steril. Stacking Gel
(5%): 30% polyacrylamide, 1.5 M Tris ph 6.8, 10% SDS, aquabidest.
Pencentakan Gel: 1 pasang eletroforesis (2 kaca) Gel bawah (Resolving Gel): 10
ml sds-page 12% ditambah 10 µl Temed dan 100 µl APS 10%. Gel atas (Stacking
Gel): 5 ml Stacking Gel 5% ditambah 5 µl Temed dan 50 µl APS 10%.

6. Penentuan Kurva Baku

Bahan yang digunakan dalam pembuatan kurva baku adalah larutan stok BSA,
dH2O, dan Bio-rad protein assay.

C. CARA KERJA
Praktikum Deteksi Molekuler dengan acara “Isolasi DNA Plasmid Bakteri dan
Isolasi Protein” dilaksanakan di Laboratorium Rekayasa Genetika, Program Studi
Magister Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana, Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta. Praktikum dibagi menjadi beberapa kegiatan yang pertama
Transformasi Plasmid “A52 colon 1 PET 286”. Kedua Isolasi DNA Plasmid.
Kemudian dilanjutkan dengan Elektroforesis Plasmid. Setelah itu dilakukan
Isolasi protein yang dilanjutkan dengan running protein SDS-PAGE dan
penentuan kurva baku.

1. Transformasi Plasmid
Beberapa prosedur transformasi plasmid telah dipersiapkan sebelumnya oleh
teknisi laboran. Pembuatan sel kompeten dibuat dengan menumbuhkan bakteri E.
coli BL 21 dalam medium LB cair selama semalam. Kultur kemudian diambil
sebanyak 200 μl dan dimasukkan dalam medium LB cair sebanyak 5 ml.
Kemudian kultur diinkubasi pada shaker inkubator dengan suhu 370C selama 2-3
jam sampai mencapai OD 600 = ±0,6. Setelah itu diambil kultur sebanyak 1,5 ml
dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, sentrifugasi dengan kecepatan 13000
selama 11 detik. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 250 μl larutan MOP,
CaCl2, dan RbCl, kemudian disentrifugasi selama 5 detik. Supernatan dibuang dan
pelet disuspensikan secara perlahan dengan 400 μl larutan MOP, CaCl 2, dan RbCl,
kemudian diinkubasi dalam es selama 30-60 menit dan disentrifugasi dengan
kecepatan 13000 rpm selama 11 detik.
 Supernatan dibuang dan pelet disuspensikan dengan 150 μl larutan MOP,
CaCl2, dan RbCl. Kemudian ditambahkan 1 μl DNA plasmid dan didiamkan
dalam es selama 30-60 menit. Selanjutnya dilakukan heat shock dengan 420C
selama 2 menit dan didinginkan dalam es selama 1-2 menit. Kemudian
ditambahkan medium LB sebanyak 1 ml dan diinkubasikan pada waterbath 370C
selama 1 jam. Kultur bakteri kemudian dituang pada medium LB sebanyak 100-
150 μl dan diratakan pada plate. Plate kemudian diinkubasikan pada inkubator
370C semalam.

2. Isolasi DNA Plasmid

Isolasi DNA plasmid pertama-tama dilakukan dengan cara menumbuhkan
koloni bakteri dalam 5 ml medium LB yang mengandung antibiotik yang sesuai
dan diinkubasi dalam shaker incubator pada suhu 370C semalam. Kemudian
bakteri diambil sebanyak 1.5 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet ditambahkan 100 µl lysing
solution I dan disuspensikan. Selanjutnya pelet tersebut diinkubasi dalam es
selama 5 menit. Kemudian ditambahkan lysing solution II sebanyak 200 µl dan
disuspensikan. Selanjutnya diinkubasi dalam es selama 5 menit. Sampel yang
telah diinkubasi tersebut kemudian ditambahkan lysing solution III sebanyak 150
µl dan disuspensikan. Kemudian diinkubasi dalam es selama 5 menit dan
disentrifugasi dengan keceatan 13000 rpm selama 5 menit. Supernatan kemudian
diambil dan ditambahkan fenol dengan perbandingan 1:1, kemudian dicampur
dengan shaker selama 15 menit. Selanjutnya sampel disentrifugasi kembali
dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Supernatan diambil dan ditambahkan kloroform isoamil alkohol (CIAA)
dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm
selama 5 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan 1/10 volume 3 M Na asetat.
Kemudian ditambahkan etanol absolut dengan perbandingan 1:1 dan
disuspensikan. Sampel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm
selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan etanol 70%
sebanyak 500 µl dan disimpan dalam freezer pada suhu -200C selama 21 jam
(semalaman). Hari selanjutnya, DNA dikeluarkan dari freezer, kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan
kemudian dibuang dan pelet yang berisi plasmid DNA dikeringkan. Pelet yang
berisi DNA plasmid selanjutnya ditambahkan larutan TE 25 µl.

3. Elektroforesis Plasmid
Untuk mendeteksi DNA plasmid hasil isolasi menggunakan elektroforesis gel
agarose. Langkah pertama dengan membuat gel agarose terlebih dahulu, dengan
cara menimbang 1 gr bubuk agarose untuk selanjutnya dilarutkan dengan 100 mL
TBE (buffer) 1x. Selanjutnya larutan dipanaskan hingga mendidih dalam
microwave. Setelah mendidih dan larut, ditambahkan 7 µL cyber SYBR safe
kemudian gojog hingga larurt. Lebih lanjut larutan dituang ke dalam cetakan
agarose kemudian ditunggu hingga mengeras. Setelah mengeras, gel agarose dan
cetakan dimasukkan ke dalam chamber kemudian ditambahkan buffer TBE ke
dalam chamber hingga gel agarose terendam.
Sampel DNA plasmid hasil sebanyak 10 µL dicampur dengan 1 µL loading
dye hingga tercampur kemudian dimasukkan ke dalam sumuran pada gel agarose.
Sebelumnya telah ditambahkan marker 100kb dan 1kb masing-masing pada sisi
kanan dan kiri agarose, sebanyak 7μL. Sampel kemudian dijalankan pada
apparatus elektroforesis dengan tegangan 100 volt selama 30 menit. Setelah 30
menit, alat gel agarose diambil dari chamber kemudian hasil elektroforesis
diamati dibawah sinar UV.

4. Isolasi Protein
Isolasi protein, diawali dengan menyiapkan 10 mL kultur bakteri untuk
selanjutnya dilakukan sentrifugasi 3000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC.
Pellet selanjutnya diresuspensi dengan 1 mL PBS, kemudian ditambahkan PBS
hingga mencapai volume 10 mL. Kemudian dilakukan sentrifugasi kembali
dengan kecepatan 3000 rpm selama selama 20 menit pada suhu 4oC. Cuci
sebanyak dua kali (seperti metode pada sebelumnya). Pellet diresuspensi 0,5 mL
PBS, kemudian sonifikasi sebanyak 5 kali selam 30 detik (dalam es), kemudian
dipindahkan dalam ependorf. Untul selanjutnya kembali disentrifugasi dengan
kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Kemudian supernatan dipindahkan ke
ependorf untuk selanjutnya dilakukan pengukuran protein.
5. Running Protein SDS-PAGE
Running protein dilakukan dengan cara mengatur tegangan alat sebesar 60V
selama 15 menit, kemudian ditingkatkan tegangannya menjadi 100V selama 5
menit, selanjutnya tegangan ditingkatkan kembali menjadi 140V hingga proses
running selesai. Pewarnaan kemudian dilakukan pada hasil running SDS-PAGE
dan di-shake selama satu malam. Larutan staining yang digunakan untuk
mewarnai terdiri dari methanol, asam asetat, air, dan pewarna coomassie brilliant
blue. Setelah itu, dilakukan destaining (terdiri dari methanol, asam asetat dan air)
selama 15 menit, kemudian di-microwave selama 5 menit, dan setelahnya dicuci
dengan air mengalir. Agar pencucian maksimal, hasil running di-microwave
kembali selama 5 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir. Hasil
pewarnaan yang telah dicuci selanjutnya disimpan dalam wadah yang berisi
larutan asam asetat.

6. Penentuan Kurva Baku

Pembuatan kurva baku dilakukan dengan membuat larutan stok BSA dengan
konsentrasi 1 mg/ml. Enam tabung ependorf disiapkan dan masing-masing tabung
diisi dengan dH2O sebanyak 799, 798, 796, 792, 784, 768 µl. Masing-masing
tabung tersebut diberi tanda dan ditambah dengan 1, 2, 4, 8, 16, dan 32 µl larutan
protein. Larutan blangko disiapkan pada satu tabung epis yang berisi 800 µl
dH2O. Bio-rad protein assay sebanyak 200 µl ditambahkan pada masing-masing
tabung kemudian di vorteks pelan.
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
1. Transformasi Plasmid
Transformasi merupakan salah satu kemampuan bakteri untuk mengambil
DNA asing ke dalam sel. Kemampuan ini dimanfaatkan oleh peneliti untuk
memperbanyak suatu gen. Gen yang telah diinsersikan ke dalam plasmid
dimasukkan ke dalam bakteri dengan metode trnsformasi (Brown, 2010). Pada
praktikum ini transformasi plasmid digunakan sel kompeten dimana sel tersebut
merupakan sel bakteri yang telah mengalami suatu perlakuan fisik sehingga dapat
memperoleh kemampuan untuk mengambil DNA asing (Brown, 2010).
Salah satu metode sederhana untuk membuat sel menjadi kompeten dengan
cara merendam sel bakteri ke dalam larutan garam dalam kondisi dingin. Larutan
garam ini dapat mengikat DNA dan komponen lipopolisakarida dari dinding sel
bakteri yang bermuatan negatif, sehingga DNA terikat dengan dinding sel bakteri.
Transformasi dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu heatshock atau kejutan
panas, elektroporasi (Casali dan Preston, 2003), dan coldshock atau kejutan dingin
(Ng, 2009). Metode kejutan panas merupakan metode transformasi yang paling
mudah dilakukan dibandingkan metode lainnya. Metode ini menggunakan prinsip
kejutan suhu, yaitu 42oC, selama 90 detik (Hanahan dkk., 1983) atau 120 detik
sehingga dinding sel bakteri terbuka dan plasmid dapat masuk dalam sel
(Sambrook dan Russel, 2001). Proses transformasi kejutan panas yang terjadi
pada sel bakteri dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Proses Transformasi Heatshock pada Sel Bakteri

Tranformasi kejutan panas memerlukan persiapan sel yang siap ditransformasi

atau sel kompeten. Sel kompeten dibuat dalam kondisi dingin 4oC, sehingga
terjadi kejutan suhu pada sel kompeten ketika ditempatkan pada suhu 42 oC. Sel
kompeten dibuat dengan cara merendam sel dalam larutan garam klorida, seperti
CaCl2, MnCl2, dan MgCl2, untuk meningkatkan permeabilitas membran sel
sehingga plasmid dapat masuk ke dalam sel (Brown, 2010). Sel kompeten yang
diberikan kejutan panas 42oC tetap hidup karena mengekspresikan protein kejutan
panas, yaitu heat-shock proteins (HSPs). Protein ini akan diekspresikan oleh sel
apabila sel dalam kondisi stress suhu (Arsene dkk., 2000). Secara umum, protein
kejutan panas dapat dikelompokkan menjadi tujuh kelompok berdasarkan
fungsinya, yaitu chaperon molekuler (protein pelipat), organisasi sel, transport dan
detoksifikasi, degradasi protein, metabolism dan regulasi sel (Ritcher dkk., 2010).
Waktu kejutan panas dapat mempengaruhi efisiensi transformasi (Inoue dkk.,
1990). Kejutan panas akan membuka dinding sel bakteri, sehingga plasmid akan
masuk ke dalam sel. Apabila waktu pembukaan dinding sel terlalu pendek,
plasmid tidak dapat masuk seluruhnya ke dalam sel bakteri, sehingga efisiensi
transformasi akan kecil. Sementara itu, apabila waktu pembukaan dinding sel
terlalu lama, struktur dinding sel bakteri akan rusak, sehingga bakteri akan mati
(Brown, 2010). Waktu kejutan panas berkisar antara 30 hingga 240 detik (Froger
dan Hall, 2007). Hasil Transformasi yang diperoleh dari Praktikum ini dapat
dilihat pada Gambar 2 berikut.

Gambar 2. Hasil Transformasi Plasmid

 Pada transformasi dihasilkan koloni berwarna putih (sel rekombinan) hal ini
menunjukkan hasil transformasi dengan baik. Koloni putih disebabkan hen lacZ
pada vektor pGEM yang mengkode enzim β-galactosidase tidak berfungsi karena
mengalami insersi DNA (Asy’ari et al, 2006). Hasil yang ada tidak didapat koloni
biru (sel non rekombinan) koloni ini terjadi karena adanya penguraian X-gal
menjadi galaktosa dan 5- bromo-4- kloroindigo (berwarna biru). Penguraian X-gal
ini diinduksi oleh adanya isopropiltio-β-D-galaktosida (IPTG) dan dikatalisis oleh
enzim β-galaktosidase yang dihasilkan oleh gen lacZ yang tidak mengalami
insersi DNA (Jones, 1998).

2. Isolasi DNA Plasmid dan Elektroforesis Agarose

DNA plasmid diisolasi dnegan metode lisis alkali sedangkan pemurnian DNA
plamid dilakukan dengan dua cara, yaitu ekstraksi fenol:kloroform-isoamil
alkohol. Identikfikasi secara kualitatif dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa
dimana hasil yang didapatkan dapat dilihat pada Gambar 3 berikut. Hasil
visualisasi elektroforesis hasil isolasi plasmid menunjukkan adanya pita yang
terbentuk pada gel elektroforesis pada bagian atas agar yang menandakan bahwa
DNA yang berhasil diisolasi berukuran besar dan menghasilkan smear dibagian
bahwa agar sementara marker DNA yang digunakan terpisah dengan sangat baik
dan menunjukkan ladder fragmen DNA dengan ukuran-ukuran tertentu.

Gambar 3. Hasil Identifikasi Secara Kuakitatif Menggunakan Elektroforesis Agarose

 Isolasi DNA plasmid dengan metode lisis alkali meliputi proses resuspensi sel,
lisis sel, dan netralisasi (Sambrook dan Russell, 2001). Pelet sel diresuspensi
dengan larutan yang terdiri dari Tris-EDTA dan glukosa. Dinding sel dan
membran sel bakteri pecah karena proses pelisisan sel. Larutan pelisis dinding sel
mengandung SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) dan NaOH. Natrium hidroksida
berfungsi membuat kondisi menjadi alkali (pH <12,5) (Kendrick dkk, 2007)
sehingga dinding sel akan pecah dan menyebabkan DNA kromosom dan plasmid
terdenaturasi. Proses netralisasi dengan larutan kalium asetat (pH 4,8) dan asam
asetat glasial menyebabkan DNA kromosom dan plasmid mengalami renaturasi.
Pemurnian DNA plasmid yang digunakan dalam praktikum ini adalah
menggunakan fenol:kloroform-isoamil alkohol. Prinsip metode pemurnian ini
didasrkan pada perbedaan kelarutan DNA dan protein di dalam pelarut organik
(Sambrook dan Russell, 2001). DNA plasmid akan terlarut dalam lapisan yang
lebih polar (lapisan aqueous), protein berada di antara lapisan atas dan bawah
sedangkan lapisan bawah merupakan fase organik.

3. Isolasi Protein & Analisis Menggunakan SDS-PAGE

Isolasi Protein menggunakan Phosphate Buffer Saline (PBS). Menurut Janson
dan Ryden (1998) masalah utama dalam hal isolasi protein adalah dapat
mengeluarkan protein dari dalam sel tanpa terdegradasi atau terdenaturasi dan
tidak kontaminasi sehingga hal tersebut dapat diatasi dengan pemilihan medium
ekstraksi yang tepat, waktu persiapan cepat dan pada kondisi temperatur yang
rendah. Adapun sentrifuge difunakan untuk memisahkan protein berdasarkan
berat molekul. Isolasi dilakukan menggunakan PBS pH 7,2 karena buffer
ekstraksi yang ideal untuk target protein biasanya antara pH 7,0 dan pH 8,5 hal ini
bertujuan untuk membantu kestabilan target protein untuk menghalangi dari
aktivitas protein yang tidak dikehendaki (Bonner, 2007)
Analisis protein dilakukan dengan teknik elektroforesis menggunakan gel
poliakrilamid sebagai medium pemisahan. Pada sistem ini gel yang digunakan
terdiri dari dua jenis gel berbeda, yaitu separating gel (gel pemisah) dan tacking
gel (gel penumpuk). Pemisahan protein dengan elektroforesis gel poliakrilamid
berdasarkan pada perbedaan muatan dan ukuran molekul dapat dilakukan denagan
mendambahkan detergen ionik dan menambahkan tahap denaturasi (Kurniati dan
wanadi, 2001). Pada proses persiapan sampel, sampel ditambahkan dengan suatu
detergen anionik seperti sodium dodesil sulfat (SDS). Hasil analisis protein
menggunakan SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4. Running SDS-PAGE Hasil Isolasi Protein

Adapun dalam penelitian, elektroforesis diatur dengan tegangan 60 v selama

15 menit, kemudian ditingkatkan tegangannya menjadi 100 v selama 5 menit,
selanjutnya tegangan ditingkatkan kembali menjadi 140 V hingga proses running
selesai. Pengaturan ini dapat dimodifikasi oleh siapa pun yang melakukan sesuai
dengan keperluan dan pengalaman percobaan. Pengaturan tercatat tersebut dipilih
karena telah memberikan hasil yang paling baik di antara percobaan-percobaan
yang telah dilakukan. Elektroforesis dilakukan sampai pita sampel bergerak
menuju bagian dasar gel. Waktu total yang diperlukan adalah 2 jam. Setelah
running selesai maka dilakukan pewarnaan dengan menggunakan methanol, asam
asetat, air, dan pewarna coomasie briliant blue yang kemudian diikuti dengan
pengadukan (shake) selama satu malam yang bertujuan untuk menyempurnakan
penyerapan warna pada gel .
4. Penentuan Kurva Baku
Pengukuran kandungan protein yang berhasil diisolasi ditentukan dengan
menggunakan spektrofotometri. Larutan hasil isolasi protein diukur absorbannya
dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
Pembanding yang digunakan dalam penentuan kurva baku ini adalah BSA (bovine
serum albumin) dengan konsentrasi blanko 0 dan BSA 0.001, 0.002, 0.004, 0.008,
0.016, dan 0.032 mg/mL. Untuk serapan dan konsentrasi BSA dan sampel dapat
dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Konsentrasi dan Absorbansi Protein BSA dan Sampel

Konsentrasi
Deret standar protein (BSA)
(mg/ml) Abs
K1 (blanko) 0 0
K2 0.001 0.015
K3 0.002 0.089
K4 0.004 0.169
K5 0.008 0.297
K6 0.016 0.618
K7 0.032 1.131
sampel KIA 0.0045 0.172
sampel KIB 0.0013 0.055

Tujuan dari pembuatan larutan standar dengan berbagai konsentrasi adalah

untuk menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan menggunakan
persamaan regresi linear garis lurus yang diperoleh dari grafik larutan standar.
Dari 6 tabung BSA dengan satu blanko, diperoleh angka-angka absorbansi yang
menjadi sumbu y dan konsentrasi BSA sebagai sumbu x seperti yang ditunjukkan
pada Gambar 5.
 Abs
1.2
f(x) = 35.66 x + 0.01
1 R² = 1
0.8
Abs
0.6
Axis Title Linear (Abs)
0.4

0.2

0
0 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03 0.04
Axis Title

Gambar 5. Kurva Baku

Dari gambar diatas, kurba menunjukkan slop positif dengan gradien

mendekati 1 (0.9969). Dengan regresi linear, diperoleh pula nilai a = 35.657 dan
b = 0.0104. sehingga untuk persamaan garis y = ax + b diperoleh persamaan y =
35.657x +0.0104.
Berdasarkan persamaan dan kurva kalibrasi, kandungan protein hasil isolasi
diketahui seperti pada Tabel 1 yaitu 0.0045 dan 0.0013 mg/mL.
IV. KESIMPULAN