RESUME

Insulin dan reseptornya banyak diekspresikan dalam berbagai jaringan di seluruh tubuh termasuk
hati, jaringan adiposa, hati dan otak. Reseptor insulin dinyatakan sebagai dua isoform yang
berbeda secara fungsional, dibedakan oleh dua belas ekson asam amino tunggal. Dua isoform
reseptor, yang ditunjuk IR / A dan IR / B, diekspresikan secara spesifik pada kebanyakan jaringan
dan proporsinya relatif berbeda dari isoform yang bervariasi selama masa perkembangan,
penuaan (aging) dan dalam kondisi sakit. Tingkat kesamaan yang tinggi antara kedua isoform
tersebut telah mencegah penelitian terperinci karena diferensiasi kedua isoform dengan metode
imunologis tradisional tidak dapat dilakukan. Dalam penelitian ini dilakukan penelitian dengan
menggunakan metode pengujian baru yaitu RT PCR FISH secara in situ yang memungkinkan
visualisasi IR / A dan IR / B pada jaringan bersama dengan marker jaringan yang spesifik.
Penggunaan metode baru ini digunakan untuk menunjukkan pertama kalinya bahwa IR / A dan
IR / B yang keduanya dapat diekspreksikan ke dalam neuron di otak manusia dewasa. Dengan
demikian, metode dalam penelitian ini dapat memungkinkan pemeriksaan ekspresi isoform pada
insulin IR / A dan IR / B secara in situ pada berbagai jaringan.
Latar Belakang
Insulin adalah regulator utama homeostasis glukosa dalam tubuh, terutama sebagian hati,
jaringan adiposa dan otot yang merupakan target utamanya. Reseptor insulin (IR) telah terdeteksi
pada berbagai macam jaringan termasuk : plasenta, jantung, ginjal, sel hematopoetik dan otak
(1). Insulin yang mengikat reseptor insulin (IR) menghasilkan auto-phosphorylation dan
pemberian sinyal secara downstream melalui protein substrat reseptor insulin (IRS) ke jalur
MAPK dan AKT (2). IR diekspresikan sebagai satu polipeptida yang mengkodekan subunit α dan
subunit ß. Pembelahan polipeptida ini menghasilkan subunit β transmembran, yang berisi domain
tirosin kinase dan binding domain Src3. Subunit α adalah domain ekstra seluler yang mengikat
insulin (3). Splicing alternatif pada keseluruhan transkrip pada ekson 11 menghasilkan dua
isoform dari subunit α: IR / A dan IR / B. Signaling melalui jalur Ras-MEK1-ERK meningkatkan
tingkat faktor penyisipan SRSF1, yang menyebabkan inklusi ekson 11 dan mendukung ekspresi
isoform IR / B (4). Dua isoform reseptor, yang ditunjuk IR / A dan IR / B, diekspresikan secara
spesifik pada kebanyakan jaringan dan proporsinya relatif berbeda dari isoform yang bervariasi
selama masa perkembangan, penuaan (aging) dan dalam kondisi sakit (5). Signaling melalui
reseptor insulin terjadi melalui phosphoinositol-3 kinase (PI3K), namun PI3K spesifik yang
digunakan oleh setiap isoform menentukan cascade signaling secara downstream (6). Signaling
IR / A secara intraselular terjadi melalui PI3K kelas 1a, p70 s6 (p70s6k) dan IR / B terjadi melalui
PI3K kelas II –like activity dan protein kinase B (PKB / c-Akt) (6). Signaling secara intraseluler
melalui isoform IR mengikuti jalur terpisah yang mengarah pada tujuan fungsi yang berbeda.
Insulin mengikat IR / A memicu cascade signaling (sinyal berantai) mitogenik secara klasik,
sedangkan pengikatan ke IR / B mengaktifkan jalur fenotip metabolik (1,7).
Sementara reseptor insulin diekspresikan di semua jaringan di tubuh manusia, pada rasio IR / A
: IR / B menunjukkan IR / B lebih diterima di hati, otot rangka, jaringan adiposa dan ginjal.
Sebaliknya, pada jaringan dimana efek metabolik insulin sangat dibutuhkan seperti janin atau
tumorigenik, IR / A disukai (5,8). Namun, karena masing-masing jaringan terdiri dari banyak jenis
sel, rasio ekspresi individu IR / A dan IR / B pada setiap sel di dalam jaringan belum ditentukan.
Pada otak, dimana pada sel glial telah ditunjukkan untuk mengekspresikan IR / A dan IR / B
secara in vitro, sementara pada neuron hanya IR / A yang telah terbukti dinyatakan secara in vitro
(9,10). Analisis lebih jauh dari ekspresi IR pada neuronal ekspresi IR yang nampak menunjukkan
IR / A sebagian besar diekspresikan sel yang belum matang atau progenitor pada populasi
(bagian besar) sel tanpa sedikit adanya IR / B yang terdeteksi secara in vivo (11). IR / A yang
dinyatakan secara neuronal tampak berbeda secara glikosilasi in vivo, yang selanjutnya
merupakan masalah yang menyulitkan (12).
Variasi splice isoform IR / B dibedakan dari IR / A hanya dengan 36 nukleotida (12aa) yang
mencegah deteksi spesifik dengan metode imunologi. Baru-baru ini, sebuah teknik PCR real-time
kuantitatif dikembangkan untuk mengukur secara diferensial transkrip IR / A dan IR / B pada sel
dan keseluruhan jaringan yang memungkinkan kuantifikasi masing-masing level isoform (13).
Namun, teknik ini tidak memungkinkan penelitian IR / A dan IR / B isoforms dengan cara tipe sel
tertentu. Maka pada penelitian ini dilakukan pengembangan uji RT-PCR / FISH in situ untuk
deteksi diferensial IR / A dan IR / B pada sel kultur dan pada jaringan manusia yang, dengan
kopling dengan imunohistokimia, memungkinkan lokalisasi spesifik ekspresi IR / A dan IR / B ke
tipe sel tertentu untuk pertama kalinya. Teknik ini akan berguna dalam mempelajari ekspresi
isoform IR spesifik di berbagai jaringan manusia seperti otak, hati dan pankreas untuk memahami
perannya dalam perkembangan dan penyakit.

Metode
Analisis Real-Time PCR
Total RNA diisolasi dari sel menggunakan RNeasy mini kit (Qiagen) dan ditranskripsikan dengan
menggunakan RT (2) First Strand kit (Qiagen) dari 1 μg total RNA. Analisis kuantitatif PCR
(qPCR) dilakukan dengan menggunakan sistem PCR StepOnePlus real-time (Biosystem
Terapan) dengan primer yang dijelaskan pada Tabel 1. Perhitungan relatif ekspresi gen dihitung
dengan metode ambang batas komparatif (Ct) dan dinyatakan sebagai 2-exp ( ΔΔCt)
menggunakan ß-actin manusia sebagai kontrol internal seperti yang dijelaskan sebelumnya (14).
Preparasi Sel.
Pemeliharaan dan diferensiasi sel neuron manusia SH-SY5Y sebelumnya telah dijelaskan (15).
Sel mikroglia manusia dewasa yang diimunisasi-SV40 (Applied Biologics Materials, Inc.
Richmond, Kanada) dikultur menurut petunjuk pabrik pembuatnya. Secara singkat, sel
dipertahankan dalam Media PriGrowIII (ABM) yang berisi Pen / Strep (Fisher Scientific) dan 10%
FBS (Gemini) dalam 5% CO2 dan 37 ° C. Untuk RT-PCR / FISH, sel-sel di-plating pada penutup
kaca terukir yang dilapisi dengan matriks ekstra seluler (ECM, 1: 2 di PBS, Applied Biologics
Material # G422) pada kerapatan sel 1 × 105 selama 3 hari sebelum difiksasi dengan 4%
paraformaldehida.
Preparasi Jaringan.
Jaringan otak manusia pada korteks bagian depan FFPE dari Alzheimer Shiley Marcos Brain
Bank di UCSD dipotong dengan ketebalan 7 μm dan dipasang pada slide Superfrost (Fisher
Scientific). Slides kemudian di deparaffinisasi. Secara singkat, slide dicelupkan: masing-masing
dua kali masing-masing 100% Xylene - 5′, 50%/50% Xylene/ Ethanol - 3′, 100% Ethanol - 3′, 95%
Ethanol - 3′, 70% Ethanol - 3′, 50% Ethanol - 3′ dan diH2O - 3′. Slides dikeringkan udara selama
1 jam dan kemudian disimpan pada suhu -80 ° C sampai digunakan untuk pewarnaan.
In situ RT-PCR/FISH.
Deteksi isoform reseptor insulin dilakukan serupa dengan protokol yang dipublikasikan
sebelumnya untuk in situ PCR / FISH (16). Sel PFA yang difiksasi pada coverlips kaca di-
mounting pada slide Superfrost (Fisher Scientific) dan kemudian Frame-Seal Incubation Chamber
(17 × 28 mm) (Bio-Rad) ditambahkan ke slide untuk prosedur inkubasi. Jaringan FFPE yang
dideparaffinisasi yang sudah terpasang pada slide juga diberi Frame-Seal Incubation Chamber
(17 × 28 mm). Sel atau jaringan diberi perlakuan dengan Proteinase K [2 μg / ml di PBS] (Life
Technologies) pada suhu 37 ° C selama 15 menit dengan mesin PCR in situ pada permeabilitas
membran-membran untuk enzim reverse transcriptase dan DNA polymerase. Setelah inkubasi
37 °C, slide dipanaskan sampai 92 °C selama 2 'untuk menginaktifkan Proteinase K. Slide dicuci
sekali dengan PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) - 5' dan kemudian sekali dengan diH2O - 5'.
Setelah perlakuan dengan proteinase K, mRNA reseptor insulin diamplifikasi oleh RT-PCR
dengan primer spesifik untuk masing-masing isoform (Tabel 1) (13) menggunakan Kit RTST-PCR
OneStep (Qiagen). Parameter berikut digunakan pada mesin PCR in situ; 50 °C-45 ', 95 °C-15'
untuk reverse transkripsi; 30 siklus masing-masing 94 ° C-1 ', 50 ° C-1', 72 ° C-1 'untuk amplifikasi;
72 °C-10 'untuk elongasinya. Setelah RT-PCR, slide dicuci dua kali dengan 2 × SSC (30 mM
sodium citrate, 300 mM NaCl, pH 7.0) - 5 'dan kemudian diinkubasi pada heat block 92 °C-1'.
Probe yang dirancang untuk masing-masing isoform (Tabel 1) diberi label dengan Kit Pelabel
Asam Nukleat ULYSIS 488/594 (Thermo Fisher) dan dimurnikan dengan kolom pemisah
Princeton (CentriSpin-10, Thermo Fisher) sesuai prosedur pemakaian dari perusahaan pembuat
kit.
Imunohistokimia
Untuk ko-lokalisasi spesifik sel, mengikuti RT-PCR / IO situ, jaringan diinkubasi dengan antibodi
anti-MAP2 (Neuron, Millipore) dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder yang diberi
biotinilasi dan direaksikan dengan diaminobenzidine (17). Slide dipasang dengan media anti-
fading yang mengandung DAPI (Vectashield, Vector Laboratories) untuk pencitraan 3-warna
yang diikuti oleh light imaging untuk pewarnaan DAB dengan mikroskop fluorescent digital
(Zeiss).
Analisis ko-lokalisasi dilakukan pada 5 separate images per kondisi oleh Fiji (ImageJ) dengan
menggunakan plugin Squassh seperti yang dijelaskan sebelumnya (18,19)
1. Belfiore, A., Frasca, F., Pandini, G., Sciacca, L. & Vigneri, R. Insulin receptor isoforms and
insulin receptor/insulin-like growth factor receptor hybrids in physiology and disease.
Endocr Rev 30, 586–623 (2009).
2. Gralle, M. The neuronal insulin receptor in its environment. J Neurochem 140, 359–367
(2017).
3. Goldfine, I. D. The insulin receptor: molecular biology and transmembrane signaling.
Endocr Rev 8, 235–255 (1987).
4. Malakar, P. et al. Insulin receptor alternative splicing is regulated by insulin signaling and
modulates beta cell survival. Sci Rep 6, 31222 (2016).
5. Moller, D. E., Yokota, A., Caro, J. F. & Flier, J. S. Tissue-specific expression of two
alternatively spliced insulin receptor mRNAs in man. Mol Endocrinol 3, 1263–1269 (1989).
6. Leibiger, B. et al. Selective insulin signaling through A and B insulin receptors regulates
transcription of insulin and glucokinase genes in pancreatic beta cells. Mol Cell 7, 559–
570 (2001).
7. Bedinger, D. H. & Adams, S. H. Metabolic, anabolic, and mitogenic insulin responses: A
tissue-specific perspective for insulin receptor activators. Mol Cell Endocrinol 415, 143–
156 (2015).
8. Westermeier, F. et al. Insulin receptor isoforms: an integrated view focused on gestational
diabetes mellitus. Diabetes Metab Res Rev 32, 350–365 (2016).
9. Garwood, C. J. et al. Insulin and IGF1 signalling pathways in human astrocytes in vitro
and in vivo; characterisation, subcellular localisation and modulation of the receptors.
Molecular brain 8, 51 (2015).
10. Frolich, L. et al. Brain insulin and insulin receptors in aging and sporadic Alzheimer’s
disease. J Neural Transm (Vienna) 105, 423–438 (1998).
11. Ziegler, A. N. et al. IGF-II promotes stemness of neural restricted precursors. Stem cells
30, 1265–1276 (2012).
12. Kenner, K. A., Kusari, J. & Heidenreich, K. A. cDNA sequence analysis of the human brain
insulin receptor. Biochem Biophys Res Commun 217, 304–312 (1995).
13. Flannery, C. A. et al. Development of a Quantitative PCR Assay for Detection of Human
Insulin-Like Growth Factor Receptor and Insulin Receptor Isoforms. Endocrinology 157,
1702–1708 (2016).
14. Spencer, B. et al. alpha-Synuclein interferes with the ESCRT-III complex contributing to
the pathogenesis of Lewy body disease. Hum Mol Genet 25, 1100–1115 (2016).
15. Kim, C. et al. Antagonizing Neuronal Toll-like Receptor 2 Prevents Synucleinopathy by
Activating Autophagy. Cell reports 13, 771–782 (2015).
16. Bagasra, O. Protocols for the in situ PCR-amplification and detection of mRNA and DNA
sequences. Nat Protoc 2, 2782–2795 (2007).
17. Spencer, B. et al. Systemic Central Nervous System (CNS)-targeted Delivery of
Neuropeptide Y (NPY) Reduces Neurodegeneration and Increases Neural Precursor Cell
Proliferation in a Mouse Model of Alzheimer Disease. J Biol Chem 291, 1905–1920 (2016).
18. Rizk, A. et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence
microscopy images using Squassh. Nat Protoc 9, 586–596 (2014).
19. Paul, G., Cardinale, J. & Sbalzarini, I. F. Coupling Image Restoration and Segmentation:
A Generalized Linear Model/Bregman Perspective. International journal of computer
vision 104, 69–93 (2013).