MODUL 4

Pada praktikum ini dilakukan untuk mengukur konsentrasi obat sipro dalam

ekskresi urin dan menghitung parameter-parameter farmakokinetika suatu obat dari sampel

urin dengan menggunakan dua metode yaitu metode laju reaksi dan metode sigma minus.

Sampel yang digunakan adalah urin sukarelawan, urin tersebut mengandung berbagai

senyawa, salah satunya adalah senyawa eksogen yaitu siprofloksasin yang digunakan

sebagai antibiotik, dimana senyawa eksogen adalah senyawa yang berasal dari luar tubuh

dan sengaja dimasukkan dengan tujuan tertentu. Obat berkhasiat tersebut tentunya akan

berinteraksi dengan molekul-molekul yang penting secara fungsional dalam tubuh (reseptor)

sehingga menghasilkan respon biologis. Jika proses biofarmasetik berlangsung dengan baik, maka

seharusnya jumlah siprofloksasin meningkat dalam urin. Proses biofarmasetik sendiri adalah

proses yang menggambarkan obat mulai dari pemberian sampai terjadinya penyerapan zat aktif

kemudian diekskresikan. Siprofloksasin lah yang akan menjadi acuan nilai konstanta eliminasi dan

waktu paruh pada tubuh.

Parameter farmakokinetik dapat ditentukan berdasarkan data urin. Pengambilan cuplikan

dari data urin memberikan proses analisis yang lebih mudah karena tidak terdapat protein yang

terlarut di urin seperti pada plasma, sehingga pemisahannya lebih mudah. Namun perbedaan pH

dan volume urin dapat menyebabkan perbedaan yang bermakna terhadap laju ekskresi urin.

Fungsi dari penetapan parameter farmakokinetika suatu obat adalah untuk mengkaji kinetika

absorbs, distribusi dan eliminasi di dalam tubuh (Shargel et al., 2005).

Sistem urin adalah suatu sistem saluran dalam tubuh manusia, meliputi ginjal dan

saluran keluarnya yang berfungsi untuk membersihkan tubuh dari zat-zat yang tidak

diperlukan. Sebanyak 1 cc urin dihasilkan oleh kedua ginjal kiri dan kanan setiap menitnya
 dan dalam 2 jam dihasilkan sekitar 120 cc urin yang akan mengisi kandung kemih. Saat

kandung kemih sudah terisi urin sebanyak itu mulai terjadi rangsangan pada kandung

kemih sehingga yang bersangkutan dapat merasakannya. Keinginan mengeluarkan mulai

muncul, tetapi biasanya masih bisa ditahan jika volumenya masih berkisar dibawah 150 cc.

(lauralee sheerwood, 2011. Hal 553)

Urin merupakan larutan kompleks yang terdiri dari sebagian besar air ( 96%) air dan

sebagian kecil zat terlarut ( 4%) yang dihasilkan oleh ginjal, disimpan sementara dalam kandung

kemih dan dibuang melalui proses mikturisi. Di dalam urin terkandung bermacam –

macam zat, antara lain (1) zat sisa pembongkaran protein seperti urea, asam ureat, dan

amoniak, (2) zat warna empedu yang memberikan warna kuning pada urin, (3) garam,

terutama NaCl, dan (4) zat – zat yang berlebihan dikomsumsi, misalnya vitamin C, dan

obat – obatan serta juga kelebihan zat yang yang diproduksi sendiri oleh tubuh misalnya

hormone. (Ethel, 2003)

Proses pembentukan urin, yaitu :

1. Filtrasi (penyaringan) : capsula bowman dari badan malpighi menyaring darah

dalam glomerulus yang mengandung air, garam, gula, urea dan zat bermolekul

besar (protein dan sel darah) sehingga dihasilkan filtrat glomerulus (urin primer).

Di dalam filtrat ini terlarut zat seperti glukosa, asam amino dan garam-garam.

2. Reabsorbsi (penyerapan kembali) : dalam tubulus kontortus proksimal zat dalam

urin primer yang masih berguna akan direabsorbsi yang dihasilkan filtrat tubulus

(urin sekunder) dengan kadar urea yang tinggi.

 3. Sekresi (pengeluaran) : dalam tubulus kontortus distal, pembuluh darah

menambahkan zat lain yang tidak digunakan dan terjadi reabsorbsi aktif ion Na+

dan Cl- dan sekresi H+ dan K+. Selanjutnya akan disalurkan ke tubulus kolektifus

ke pelvis renalis. (lauralee sheerwood, 2011. Hal 553).

Organ terpenting untuk ekskresi adalah ginjal obat diekskresi melalui ginjal dalam

bentuk utuh maupun bentuk metabolinya. Ekskresi dalam bentuk utuh atau bentuk aktif

merupakan cara eliminasi obat melalui ginjal. Ekskresi melalui ginjal melibatkan 3 proses

yaitu filtrasi glomerulus, sekresi aktif ditubulus proksimal, dan rebasorpsi pasif

disepanjang tubulus (Gunawan, 2007).

Semua obat absorpsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi berjalan melewati

membran. Disposisi dari obat ditentukan oleh mekanisme obat terhadap membran dan

sifat fisikokimia dari molekul dapat mempengaruhi pemindahan obat ke jaringan.

Pergerakan obat dan availability obat tergantung pada ukuran dan bentuk molekul,

derajat ionisasi, kelarutan relative lipid dari bentuk ionik dan nonionik dan yang mengikat

protein serum dan jaringan. (Brunton, 2006)

Obat yang digunakan pada percobaan ini adalah sipro. Siprofloksasin merupakan

golongan florokuinolon. Mekanisme kerja antibiotik tersebut adalah menghambat sintesis asam nukleat

sel bakteri. Siprofloksasin memiliki spektrum lebih luas terhadap bakteri gram negatif daripada kuinolon

generasi pertama, yaitu sinoksasin, asam nalidiksat, asam oksolinik.

 Metode yang igunakan untuk penentuan parameter-parameter faramakokitika obat sipro

dalam sampel urin adalah metode laju eksreksi dan metode sigma minus. Pada Rate metode,

perhitungan parameter farmakokinetika dilakukan berdasarkan pada perkiraan data tengah (Mid

Point Time) tiap interval pengambilan sampel urin. (Hakim, 2013). Sementara itu pada metode

Sigma-minus, perhitungan parameter farmakokinetika langsung menggunakan data yang

diperoleh tanpa mencari data tengah. Pengambilan sampel urin dalam metode Sigma-minus akan

berpengaruh pada jumlah kumulatif obat yang dieksresikan melalui urin karena pada metode ini

nilia kumulasi obat pada waktu tak terhingga dianggap sama dengan nilai kumulasi obat dalam

urin pada waktu terakhir pengambilan urin. Hal tersebut yang menjadi dasar lamanya waktu

pengambilan urin pada metode Sigma-minus (Paradkar dan Bakliwal, 2008; Hakim, 2013).

Langkah perama adalah pengumpulan urin sukarelawan dengan rentang waktu yang telah

dientukan. Hal ini dilakukan agar jumlah obat yang diekskresikan memiliki kecepatan eliminasi

yang tetap sehingga data urin yang diperoleh menjadi valid. Penggunaan sampel urin dalam

percobaan ini karena volume yang didapat banyak dan pada obat sipro merupakan salah satu obat

yang bisa dieksresikan dalam bentuk utuh melalui urin. Untuk mendapatkan data urin yang valid

harus diperhatikan beberapa hal seperti, pH dan volume urin berpengaruh padakecepatan

ekskresi obat, cara analisis spesifik dan selektif, obat tidak berubah yang diekskresikan dalam

jumlah bermakna di

Pada urin yang pertama ditampung adalah urin blanko, dimana pada urin tersebut belum

mengandung senyawa obat sipro. Penggunaan urin blanko digunakan untuk membandingkan

antara urin yang mengandung sipro dan dengan yang tidak. Urin blanko menandakan ada atau

tidaknya partikel lain yang terukur nantinya selain urin itu sendiri. Langkah selanjutnya adalah
sukarelawan diberikan obat yang ekivalen dengan dosis 500 mg siprofloksasi sehari sebelum

percobaan. Di pasaran, Ciprofloxacin memiliki sediaan 250 mg per tablet atau Ciprofloxacin 500

mg per tablet. Penggunaan dosis tersebut karena dosis tersebt merupakan dosis lazim dimana

dapat memberikan efek farmakologis sesaui dengan jendela terapi, dimana efek tersebut berada

diantara MEC (minimum effective concentration) dan MTC (minimum toxic concentration). Pada

obat yang diminum sehari sebelum percobaan dilakukan memaksimalkan proses biofarmasetik

dimana obat akan mengalami proses ADME. Pada saat pengumpulan urin, perlu dilakukan

pengukuran volume urin, dimana volume urin tersebut dimaksudkan aar dapat ditentukan berapa

jumlah obat yang telah diekskresikan. Volume urin yang didapat berdasarkan waktu yang telah

ditentukan berturut-turut 200, 240, 195, 260,165, 150, dan 230 mL.volume urin pada pagi hari

memiliki volume urin yang paling banyak yaitu 260 mL karena pada malam hari tubuh tidak

melakukan aktivitas sehingga energy akan difokuskan pada sistem pencernaan dan hasil

metabolismenya dikeluarkan melalui sistem ekskresi urinary, dimana semakin banyak volume urin

yang dihasilakn maka akan semakin banyak senyawa yang terdapat didalamnya. Sampel urin yang

didapat menjaga kestabilan sampell dan agar tidak terkontaminasi mikroba, karena komosisi urin

sekitar 70-80% adalah air, dimana air sendiri adalah media pertumbuhan mikroba yang baik.

Tahap selanjurnya adalah perlakuan sampel, yaitu pada sampel di encerkan dengan dapar

ammonium asetat. Penggunaan dapat ammonium asetat untuk menjaga pH sampel, karena

apabila pH tidak stabil pada saat dianalisis dengan HPLC, kromatogram yang kurang baik seperti

pada kromatogram terbentuk tailing sehingga yang terukur bukan obat sipro saja. Sampel

sebelum diinjeksikan pada HPLC, dilakukan penyaringan dulu dengan menggunakan membran

filter untuk menghilangkan pengokor atau partikulat sehingga sampel yang diinjeksikan bebas dari

particular sehingga yang terbaca hanya senyawa yang akan dianalisis. Penggunakan HPLC dalam

analisis obat sipro dalam urin karena pada urin banyak komponen sehingga digunakan hplc karena
hplc memili sifat yang selektif dan spesifik. Prinsip HPLC, pemisahan solute – solute diatru oleh

distribusi solute dalam fase ferak dan fase diam. Pada waktu retensi yang didapat harus memiliki

nilai yang sama karena obat yang dianalisi sama. Pada praktikum digunakan sistem kromatografi

fase balik, Teknik ini menggunakan fase gerakyang bersifat polar dan fase diam besifat non polar

atau kurang polar. Sipro memiliki kelarutan yang mudah larut dalam air sehingga memiliki sifat

polar, sehingga ketika sipro diinjeksikan ke dalam kolom HPLC akan tertarik atau terlarut dengan

fase gerak yang memiliki sifat polar sehingga sipro akan terdeteksi di hplc. Pada senyawa lain yang

memiliki sifat nonpolar, akan terjerap atau tertarik di fase diam sehingga senyawa nonpolar tidak

akan terukur. Pada fase gerak ditambahkan TEA dan H2so4 untuk menghasilkan puncak yang baik.

H2so4 digunakan untuk mempertahan pH agar berda pada pH 2,5 karena pada sipro mudah larut

dalam air tapi dalam suasana asam. Deterktor yang digunakan adalah spektro uv Karena pada

sipro memiliki gugus kromofor, dengan Panjang gelombang di 280 nm, Nilai tersebut merupakan

rentang sinar tampak biru violet yang akan diabsorpsi oleh senyawa (siprofloksasin)

sehingga terjadi eksitasi elektron dari keadaan dasar (ground state) menuju keadaan

tereksitasi (excited state) dan diperoleh nilai AUCLuas daerah auc digunakan untuk

mendapatkan konsentrasi sampel dengan cara mensubstituvikan nilai auc ke dalam ersamaan

kurva kalibrasi. Kemudian dilakukann penentuan parameter farmakokinetika dengan

menggunakan metode laju eksresi dan sigma minus. Laju reaksi persamaan regresi ln dxu/dt vs

t mid kemudian akan didapatkan nilai k,ke,t ½, dan Km (khopkar, 2012)

selanjutnya dilakukan pembuatan kurva baku siprofloksasin dengan membuat

beberapa konsentrasi pengenceran. Pembuatan kurva kalibrasi dimaksudkan untuk

mengetahui hubungan alat dengan analit. Selain itu, untuk menghilangkan kegalatan

(kesalahan pengukuran). Dengan adanya kurva kalibrasi, dapat mengetahui berapakah

konsentrasi pada nilai AUC. Nilai AUC akan berbanding lurus dengan konsentrasi, dimana

semakin tinggi AUC siprofloksasin maka akan semakin tinggi pula kadarnya.

Siprofloksasin oral diserap dengan baik melalui saluran cerna. Ketersediaan

bioavailabilitas oral ciprofloxacin mutlak berada dalam kisaran 70-80% tanpa kehilangan

substansial pada metabolisme yang pertama. Ikatan siprofloksasin terhadap protein serum

adalah 20-40% sehingga tidak cukup untuk menyebabkan interaksi ikatan protein yang

bermakna dengan obat lain. Waktu untuk konsentrasi plasma puncak: 1-2 jam (oral). Setelah

administrasi oral, siprofloksasin didistribusikan ke seluruh tubuh. Obat ini berdifusi ke

cairan serebro spinal, namun konsentrasi di CSS adalah kurang dari 10% konsentrasi serum

puncak. Waktu paruh eliminasi serum pada subjek dengan fungsi ginjal normal adalah

sekitar 3-5 jam. Sebesar 40-50% dari dosis yang diminum akan diekskresikan melalui urin

dalam bentuk awal sebagai obat yang belum diubah. Ekskresi siprofloksasin melalui urin

akan lengkap setelah 24 jam . Dalam urin semua fluorokuinolon mencapai kadar yang

melampaui konsentrasi hambat minimal (KHM) untuk kebanyakan kuman patogen selama

minimal 12 jam. Klirens ginjal dari siprofloksasin, yaitu sekitar 300 mL/menit, melebihi

laju filtrasi glomerulus yang sebesar 120 mL/menit (katzung,2011. Hal. 870, MMI, 2017)
 Interaksi Obat Siprofloksasin sediaan tablet bila diberikan bersama makanan, akan

mengalami terjadi keterlambatan absorpsi, sehingga konsentrasi puncak baru akan dicapai

2 jam setelah pemberian. Pada siprofloksasin sediaan suspensi, tidak terjadi keterlambatan

absorpsi bila diberikan bersama makanan sehingga konsentrasi puncak dicapai dalam 1

jam. Bila diberikan bersama dengan antasid yang mengandung magnesium hidroksida atau

aluminium hidroksida dapat mengurangi bioavailabilitas siprofloksasin secara bermakna.

(metta sinta, 2011. Hal 243).

Berdasarkan hasil perhitungan, didapat konsentrasi sampel 1 – 7 berturut adalah …

µg/mL. Konsentrasi tersebut kemudian dikalikan dengan faktor pengenceran. Hal ini bertujuan

agar dapat diperoleh konsentrasi siprofloksasin yang sebenarnya pada urin. Untuk metode laju

eksresi ditentukan terlebih dahulu Jumlah obat tersebut dibagi selisih selang waktu, maka

diperoleh DU/t. tmid merupakan waktu pertengahan antara selang waktu yang digunakan.

Terakhir, dilakukan regresi antara ln DU/t dengan tmid. Untuk metode laju eksresi didapatkan

persamaan regresi linier yaitu y=3,856 – 0,138 x. dari persaman tersebut kemudia ditentukan nilai

parameter k, t ½, ke dan km. nilai K yang didapat yaitu 0,138/jam sedangkan nilai Ke yang didapat

yaitu 0,095/jam dimana konstanta eliminasi merupakan nilai tetapan laju eksresi ginjal yang

menunjukan bagaimana obat dimetabolisme dalam ginjal. Nilai k>Ke menunjukkan bahwa obat

siprofloksasin mengalami metabolisme dalam tubuh sehingga tidak diekskresikan secara utuh

yang ditunukkan dengan Nilai Km yaitu 0,043/jam.

Pada metode sigma minus (ARE) untuk menentukan persamaan regresi linier, dilakukan

regresi antara Ln ARE dengan nilai t. pada metode ini didapatkan persamaan regresi linier

y=0,198x + 6,117. Parameter farmakokinetika yang ditentukan pada metode sigma minus hanya

nilai K dan t1/2. Berdasarkan perhitungan nilai K yang didapat yaitu 0,198/jam sedangkan nilai