Praktikum biofarmasi-farmakokinetika 2020

MODUL 1

PERLAKUAN AWAL SAMPEL BIOLOGIS DAN PEMISAHAN ZAT AKTIF

I. TUJUAN PERCOBAAN

Setelah mengikuti percobaan ini mahasiswa diharapkan mampu:

- Melakukan berbagai teknik presipitasi protein dari sampel plasma

- Melakukan ekstraksi cair-cair terhadap plasma menggunakan berbagai pelarut
organik

II. TEORI DASAR

Metode bioanalisis merupakan suatu metode yang digunakan untuk penentuan kuantitatif
obat dan metabollitnya dalam sampel biologis. Dalam industri farmasi, metode bioanalisis
dilakukan dalam studi farmakokinetik, toksikokinetik, bioekivalen dan farmakodinamik dari
suatu obat. Sampel yang digunakan dalam metode ini adalah obat dalam berbagai matriks
biologis seperti urin, darah, saliva, feses atau jaringan tubuh lain.

Penentuan kadar obat dalam matriks biologis merupakan hal yang rumit. Hal ini disebabkan
oleh kandungan senyawa yang kompleks dan berbeda pada setiap jenis matriks biologis,
salah satu contohnya adalah penentuan kadar obat dalam sampel darah yang sangat
dipengaruhi oleh adalah adanya kompleks matriks dengan sampel obat dalam bentuk
ikatan protein. Dengan demikian, penyiapan awal sampel untuk menghilangkan komponen
dalam matriks yang mengganggu analisa merupakan hal yang sangat krusial dalam metode
bioanalisis.

Keberhasilan tahap penyiapan sampel ditandai dengan beberapa hal sebagai berikut:

- Sampel obat berada dalam keadaan terlarut

- Sampel bebas dari komponen matriks yang mengganggu
- Sampel terlarut pada konsentrasi yang memenuhi syarat untuk dilakukan dianalisa
lebih lanjut

1
 Praktikum biofarmasi-farmakokinetika 2020
Perbedaan jenis matriks biologis dimana obat atau metabolitnya akan dianalisa,
memerlukan teknik penyiapan sampel yang berbeda pula. Sampel dalam matriks serum,
plasma atau darah pada umumnya berada dalam ikatan dengan protein darah. Untuk
melepaskan ikatan tersebut dapat dilakukan beberapa teknik berikut;

- Mengatur pH sampel pada pH ekstrim (pH<3 atau pH>9), dengan penambahan asam
atau basa
- Presipitasi protein menggunakan pelarut polar seperti acetonitril, methanol atau
aseton
- Presipitasi protein dengan penambahan asam atau garam anorganik seperti asam
format, asam perklorat, asam trikloroasetat, amonium sulfat, atau natrium sulfat.
- Presipitasi dengan sonikasi selama 15 menit

Sampel dalam matriks urin memerlukan penyiapan yang lebih sederhana dibanding dalam
darah. Penyiapan awal sampel ini pada umumnya hanya memerlukan pengenceran dengan
air atau dapar pada pH tertentu. Pada beberapa kondisi khusus diperlukan hidrolisis asam
atau basa untuk membuat senyawa yang akan dianalisa terlarut sempurna dalam urin.

Metode isolasi atau pemisahan obat yang banyak digunakan dalam penelitian
farmakokinetik adalah ekstraksi padat-cair (solid-phase extraction) dan ekstraksi cair-cair
(liquid-liquid extraction). Ekstraksi padat-cair menggunakan cartridge khusus untuk
memisahkan obat dari sampel dengan volume yang relatif kecil (0,5-1 ml) yang tersedia
secara komersial dengan harga yang cukup mahal. Ekstraksi cair-cair merupakan suatu
metode yang paling banyak digunakan karena relatif lebih cepat, simpel dan murah
dibanding ekstraksi padat cair.

Pemilihan pelarut pengekstraksi dalam ekstraksi cair-cair harus didasarkan pada sifat
fisikokimia obat maupun metabolit yang akan diisolasi. Berbagai faktor dapat menjadi
pertimbangan dalam seleksi pelarut yang akan digunakan, antara lain:

- Tidak bercampur dengan air

- Mempunyai kemampuan melarutkan obat yang diinginkan dalam jumlah
besar

2
 Praktikum biofarmasi-farmakokinetika 2020
- Mempunyai titik didih yang relatif rendah sehingga waktu evaporasi pelarut
lebih singkat
- Sedapat mungkin volume yang digunakan untuk ekstraksi minimal sehingga
akan menekan biaya yang dikeluarkan

Keberhasilan suatu ekstraksi ditandai dengan nilai perolehan kembali yang mendekati 100%.
Berbagai pendekatan dapat digunakan untuk mendapatkan perolehan kembali yang
sempurna, seperti penggunaan volume pelarut pengekstraksi dalam jumlah yang besar,
ekstraksi berulang atau ekstraksi bertahap. Perolehan kembali obat dari matriks biologis
sampai serendah 50% masih dapat diterima dengan catatan parameter lain seperti
sensitifitas, presisi, akkurasi dan selektifitas memenuhi standar umum yang berlaku.

III. PERCOBAAN:

I. Pengendapan Protein Plasma

-Pipet 250 µL plasma blanko ke dalam tabung reaksi

-Tambahkan zat pengendap protein yang tersedia dengan perbandingan yang sesuai:
Zat Pengendap Protein Perbandingan (plasma: zat pengendap protein)
10% (b/v) TCA 1:0,2
Larutan jenuh (NH4)2SO4 1:2
10% (b/v) ZnSO4 – NaOH 0,5N (1:1) 1:2
Acetonitril 1:2
Metanol 1:2

- Vortex selama ± 1-2 menit

- Sentrifuga dengan kecepatan 3500-6000 rpm selama 15 menit
- Amati supernatant dan endapan yang diperoleh dan bandingkan hasil yang diperoleh
menggunakan berbagai zat pengendap protein

3
 Praktikum biofarmasi-farmakokinetika 2020
II. Ekstraksi Cair-Cair

- Pipet 1 mL plasma blanko kedalam 2 tabung sentrifuga

- Tambahkan pelarut pengekstraksi : kloroform sebanyak 5 mL ke dalam tabung
kesatu dan n heksan sebanyak 5 mL kedalam tabung kedua
- Lakukan proses ekstraksi dengan menaruh tabung roller mixer selama 15 menit
dengan kecepatan maksimal
- Sentrifuga dengan kecepatan 3500-6000 rpm selama 15 menit
- Amati perbedaan yang terjadi dari hasil ekstraksi menggunakan pelarut
kloroform dan heksan