DNA REKOMBINAN DAN

TEKNOLOGI PCR
INDAH HAIRUNISA, M.BIOTECH., APT

Program Studi S1 Farmasi

Fakultas Farmasi
Universitas Muhammadiyah Kalimantan Timur
2020
 APA YANG AKAN DIPELAJARI

• Isolasi DNA & Gen

• Seleksi & Skrining
• Prinsip Rekombinasi DNA
• Aplikasi Rekombinasi DNA
• Dasar-dasar PCR & Aplikasinya
 DEFINISI

• Rekayasa genetika adalah suatu proses yang

mengubah susunan genetik dari suatu organisme
dengan menghapus atau memasukkan DNA
(Wikipedia)
• Konsep-konsep dasar genetika molekular yang
mengantarkan berbagai kemungkinan dan
pengembangan prosedur isolasi, manipulasi, dan
eskspresi bahan-bahan genetika yang dapat
diterapkan baik pada tingkat dasar maupun tingkat
terapan
• Tingkat dasar → mempelajarai mekanisme replikasi
dan ekspresi gen pada prokariot, eukariot dan visrus
• Tingkat terapan → pengkulturan mikroba dll
 PRINSIP DNA REKOMBINAN

Gen target → Gen yang akan

mengekspresikan protein yang
diinginkan

Akan
dimasukkan
kedalam
vektor
(umumnya
bakteri) untuk
perbanyakan

Plasmid → materi genetika

sirkular milik bakteri yang Disambung dengan
kemudian menjadi tempat menggunakan
menyisipkan gen target enzim ligase
PRINSIP DNA
REKOMBINAN
 CONTOH
BESAR DNA
REKOMBINAN
ADALAH
PEMBUATAN
INSULIN
 PENJELASAN TAHAPAN-TAHAPAN
DNA REKOMBINAN

Secara umum, teknik dalam DNA rekombinan

terbagi menjadi :
• Teknik untuk mengisolasi DNA
• Teknik untuk memotong DNA
• Teknik untuk menggabung atu
menyambung DNA
• Teknuk untuk memasukkan DNA ke
dalam sel hidup
 PENJELASAN TAHAPAN-TAHAPAN
DNA REKOMBINAN

1. Isolasi DNA (Materi genetik)

• Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah
proses pemisahan fragmen DNA target dari
campuran fragmen-fragmen DNA pengotornya.
Hal ini penting dalam rekayasa genetik karena
fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak
dalam mendeteksi gen DNA lain dan dapat
dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya.

• Fragmen DNA yang tidak tercampur dengan

fragmen DNA lainnya diperoleh melalui beberapa
tahap, yakni :
1. Tahap pertama adalah pemisahan fragmen yang ingin
diisolasi dari fragmen lainnya dengan pemotongan
menggunakan enzim restriksi atau hasil PCR, elektroforesis
menggunakan gel agarose.
2. Tahap selanjutnya adalah mendeteksi fragmen yang akan
diisolasi dan memotong gel agarose yang mengandung
fragment tersebut (Tahapan Elusi)
3. Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen DNA dari gel
agarose dengan cara melewatkannya pada membran
Hybon N netral dan memberi larutan buffer elusi yang berisi
Tris buffer dan Sodium Dodesil Sulfat.
 PENJELASAN TAHAPAN-TAHAPAN
DNA REKOMBINAN

2. Pemotongan GEN
• Restriksi plasmid merupakan proses pemotongan fragmen DNA
pada situs tertentu sesuai yang diinginkan dengan menggunakan
enzim restriksi.
• Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah
tanpa adanya dua jenis enzim, yaitu: enzim restriksi endonuklease
yang berperan sebagai “gunting” untuk memotong DNA pada
situs spesifik.
• Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong
hanya di tempat-tempat tertentu dari urutan basa tersebut.
• Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus
ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida
dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan
dengannya.
2. Pemotongan GEN (lanjutan)

• Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt

end) dan ujung kohesif (sticky end).
• Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul
dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata
dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan.
• Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap
molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak sama
sehingga salah satu utas (5’ atau 3’) menggantung
dengan beberapa nukleotida.
• Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat
berpasangan secara spontan dengan basa
pasangannya sehingga disebut “sticky” (mudah
lengket) atau kohesif.
 ENZIM
RESTRIKSI
 PENJELASAN TAHAPAN-TAHAPAN
DNA REKOMBINAN

3. Penggabungan GEN
• Ligasi adalah proses penyambungan antara satu
fragmen DNA dengan fragmen DNA lainnya. Di
dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan
dengan vector pengklonan.
• Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya
vector untuk bakteri adalah plasmid, phage dan
cosmid, serta beberapa vector lain yang
digunakan untuk organisme selain bakteri, yaitu
Yeast Artificial Chromosomes (YAC), Bacterial
Artificial Chromosomes (BAC), Plant Cloning Vectors
dan Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005).
• Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah
Enzim Ligase.
• Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan
disambungkan berkomplemen.
• Kecocokan yang sangat spesifik dibutuhkan bila
fragmen DNA yang akan disambungkan mempunyai
ujung tidak rata (sticky end), karena penyambungannya
harus mengikuti kaidah Chargaff, yaitu T berpasangan
dengan A dan G berpasangan dengan C.
• Sedangkan fragmen DNA yang mempunyai ujung rata
(blunt end) dapat disambungkan dengan sembarang
fragmen DNA lain yang berujung rata. Oleh karena itu
untuk mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik
menggunakan ujung tidak rata sedangkan pengklonan
DNA yang tidak memerlukan spesifikasi tertentu
menggunakan ujung rata (Suharsono, 2000).
 PENJELASAN TAHAPAN-TAHAPAN
DNA REKOMBINAN
4. Penyisipan GEN kedalam bakteri
• Penyisipan gen dapat dilakukan melalui tiga cara yaitu:
1. Konjugasi : perpindahan DNA dari satu sel (sel donor)
ke dalam sel bakteri lainnya
(sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel
2. Transformasi : pengambilan DNA oleh bakteri dari
lingkungan di sekelilingnya.
3. Transduksi : cara pemindahan DNA dari satu sel ke
dalam sel lainnya melalui
perantara fage.
• DNA yang masuk ke dalam bakteri dapat berintegrasi
dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga
terbentuk DNA rekombinan atau kromosom rekombinan.
 PENJELASAN TAHAPAN-TAHAPAN
DNA REKOMBINAN

5. Memasukkan DNA Rekombinan ke sel target

• Memasukkan DNA Rekombinan ke Sel Target / Sel

Hidup dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu:
1. Transformasi : pengambilan DNA rekombinan dari
lingkungan di sekelilingnya.
2. DNA-packaging : memasukkan molekul DNA-
phage ke dalam partikel phage.
3. Minkroinjection : memakai jarum super kecil untuk
menginjekasikan DNA rekombinan langsung ke inti
sel yang ditransformasi.
PEMANFAATAN DNA
REKOMBINAN
 BIDANG KESEHATAN

a. Insulin manusia telah diproduksi secara massal

menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan
untuk mengobati penyakit diabetis.
b. Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus
hepatitis. Telah diproduksi secara komersial
menggunakan S.cereviciae dalam skala industri
c. Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan
E.coli dan digunakan untuk mengobati kelainan
pertumbuhan (misal: cebol).
d. Therapi gen untuk penyakit dilakukan dengan
menggantikan gen yang mengalami kerusakan dengan
gen yang normal, digunakan untuk mengobati penyakit-
penyakit keturunan (genetic disorders) dan penyakit lain
yang disebabkan oleh kerusakan gen (misal: kanker)
 BIDANG PERTANIAN

a. Bakteri Ice- (ice minus): bakteri yang telah

direkayasa sehingga tidak membeku
pada suhu rendah. Digunakan
(disemprotkan) pada tanaman agar
tanaman tidak membeku di musim dingin.
b. mikroba pendegradasi limbah.
c. Tanaman tahan hama, misal kapas Bt,
tomat Bt
d. Tanaman tahan herbisida.
 BIDANG PENDIDIKAN

a. Membantu upaya memahami terjadinya

kelainan pada manusia (penyakit genetik)
misalnya kanker payudara
b. Kemajuan Teknologi DNA telah
mendorong para ilmuwan (konsorsium
ilmuwan internasional) untuk mewujudkan
proyek genom manusia dan genom
organisme lainnya.
 BIDANG HUKUM

a. Pelaku kejahatan dapat diidentifikasi

dengan menggunakan analisis Sidik Jari
DNA misalnya: kasus perkosaan
b. Untuk menentukan keturunan dan
keluarga berdasarkan DNA fingerprint.
 TEKNOLOGI POLIMERASE
CHAIN REACTION (PCR)
SI LAHKAN MENONTON VI DEO YANG DI SEDIAKAN
YANG PERLU DIINGAT DALAM PCR

• Definisi PCR
• Tujuan dan kegunaan PCR
• Komponen dalam PCR
• Proses PCR
• Aplikasi PCR Masa kini
 DEFINISI PCR

• Polymerase chain reaction (PCR) is a method widely used to

rapidly make millions to billions of copies of a specific DNA
sample, allowing scientists to take a very small sample of DNA
and amplify it to a large enough amount to study in detail.

• PCR is a revolutionary method developed by Kary Mullis in the

1980s. PCR is based on using the ability of DNA polymerase to
synthesize new strand of DNA complementary to the offered
template strand. Because DNA polymerase can add a
nucleotide only onto a preexisting 3'-OH group, it needs
a primer to which it can add the first nucleotide. This
requirement makes it possible to delineate a specific region of
template sequence that the researcher wants to amplify. At
the end of the PCR reaction, the specific sequence will be
accumulated in billions of copies (amplicons).
 KOMPONEN DALAM PCR
• DNA template
- the sample DNA that contains the target sequence. At the
beginning of the reaction, high temperature is applied to the
original double-stranded DNA molecule to separate the strands
from each other.

• DNA polymerase
- a type of enzyme that synthesizes new strands of DNA
complementary to the target sequence. The first and most commonly
used of these enzymes isTaqDNA polymerase (fromThermis
aquaticus), whereasPfuDNA polymerase (fromPyrococcus furiosus)
is used widely because of its higher fidelity when copying DNA.
Although these enzymes are subtly different, they both have two
capabilities that make them suitable for PCR: 1) they can generate
new strands of DNA using a DNA template and primers, and 2) they
are heat resistant.
 KOMPONEN DALAM PCR

• Primers
- short pieces of single-stranded DNA that are complementary
to the target sequence. The polymerase begins synthesizing
new DNA from the end of the primer.
• Nucleotides (dNTPs or deoxynucleotide triphosphates)
- single units of the bases A, T, G, and C, which are essentially
"building blocks" for new DNA strands.
• RT-PCR
(Reverse Transcription PCR) is PCR preceded with conversion
of sample RNA into cDNA with enzyme reverse transcriptase
PROSES PCR

Pada dasarnya proses PCR

terjadi dalam 3 tahapan
umum :
1. Denaturasi →
pemisahan template DNA
2. Annealing → Proses
penempelan primer pada
template DNA
3. Extension → Proses
pemanjangan oleh DNA
polymerase (Taq
polymerase)

Ketiga proses ini terjadi

pada suhu yang berbeda
 PROSES PCR

• Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang

meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi oleh enzim
DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang
spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’
menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi
untuk urutan yang diinginkan. Dasar siklus PCR ada 30-
35 siklus meliputi:
1. denaturation (95°C), 30 detik
2. annealing (55–60°C), 30 detik
3. extension (72°C), waktu tergantung panjang pendeknya
ukuran DNA yang diinginkan sebagai produk amplifikasi.
• Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 35 siklus tidak
memberikan efek yang positif.
 1. DENATURASI

• Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah

yang kritis selama proses PCR. Temperatur yang
tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan
untai ganda DNA. Temperatur pada tahap
denaturasi pada kisaran 92-95ºC, suhu 94ºC
merupakan pilihan standar.
• Temperatur denaturasi yang tinggi membutuhkan
kandungan GC yang tinggi dari DNA template,
tetapi half-life dari Taq DNA Polymerase menekan
secara tajam pada temperatur sekitar 95ºC.
 2. ANNEALING

• Primer Annealing, pengenalan (annealing) suatu primer

terhadap DNA target tergantung pada panjang untai,
banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu
sendiri. Optimalisasi temperatur annealing dimulai
dengan menghitung Melting Temperature (Tm) dari
ikatan primer dan DNA template.
• Cara termudah menghitung untuk mendapatkan melting-
temperatur yang tepat menggunakan rumus Tm =
{(G+C)x4} +{ (A+T)x2}. Rumus standar dapat dilihat di
subbab primer pada komponen PCR. Sedang
temperatur annealing biasanya 5ºC ddibawah Tm primer
yang sebenarnya. Secara praktis, Tm ini dipengaruhi
oleh komponen buffer, konsentrasi primer dan DNA
template.
 3. EXTENSION

• Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan

untai baru DNA, dimulai dari posisi primer yang telah
menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan
bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal
DNA.
• Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA
yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa
nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase
(1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1
menit. Sedang bila kurand dari 500bp hanya 30 detik
dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu
45 detik, namun apabila lebih dari 1kb akan memerlukan
waktu 2 menit di setiap siklusnya.
• Adapun temperatur ekstensi berkisar antara 70-72°C.
GAMBARAN PROSES PCR
YANG PERLU DIINGAT DALAM PCR
 APLIKASI PCR

• Covid-19 diagnosis
• Forensik (DNA Finger Printing)
• Penelitian Lab
• dll
DNA FINGER
PRINTING
HASIL DNA FINGER PRINTING
 SIAPA
AYAHKU ???

Anak Ibu Ayah 1 Ayah 2

THANK YOU