Pengeditan genom secara terarah telah menjadi metode alternatif bagi

pemuliaan konvensional dan transgenik dalam perbaikan tanaman. Editing

genom, menggunakan nucleases rekayasa (geen) adalah jenis rekayasa genetik
di mana DNA dimasukkan, diganti, atau dihapus dari genom menggunakan
senyawa nuclease artifisial yang direkayasa, atau "gunting molekuler." Nuclease
akan membuat double strand breaks (DSBs) di lokasi yang diinginkan dalam
genom, dan memanfaatkan mekanisme endogen sel untuk memperbaiki induksi
yang patah akibat proses alami rekombinasi homolog (HR) dan non homolog end
joining (NHEJ). Saat ini ada empat kelompok rekayasa nuclease yang digunakan:.
Zinc finger nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs),
the CRISPR/Cas system, dan rekayasa meganuclease yang direkayasa ulang pada
endonuklease .

Rekayasa genetika (transgenik) atau juga yang lebih dikenal dengan Genetically Modified Organism
(GMO) dapat diartikan sebagai manipulasi gen untuk mendapatkan galur baru dengan cara
menyisipkan bagian gen ke tubuh organisme tertentu. Rekayasa genetika juga merupakan
pencangkokan gen atau DNA rekombinan.
Rekayasa genetika merupakan transplantasi atau pencangkokan satu gen ke gen lainnya dimana
dapat bersifat antar gen dan dapat pula lintas gen sehingga mampu menghasilkan produk. Rekayasa
genetika juga diartikan sebagai perpindahan gen. Menurut Kamus Besar Bahasa Indonesia (2003)
rekayasa genetika dapat diartikan sebagai ilmu dari cabang biologi yang berhubungan dengan prinsip
keturunan dan variasi pada binatang dan tumbuhan jenis yang sama.

Teknologi CRISPR telah diterapkan pada sel eukariotik, termasuk sel

manusia, mencit, zebrafish, lalat buah, dan khamir, juga bakteri. Pada
tahun 2013, setidaknya ada delapan publikasi hasil penelitian yang
membuktikan dapat diterapkannya CRISPR pada DNA genom tanaman,
baik dikotil maupun monokotil
Teknologi CRISPR telah terbukti dapat memfasilitasi pengeditan genom
dengan target banyak gen dengan menggunakan hanya satu enzim
nuklease (Cas9). Dengan pencarian menggunakan komputer, prediksi
menggunakan sekuen guideberukuran 20 bp mengidentifikasi lebih dari
tiga juta sekuen dalam genom dan cDNA padi yang dapat menjadi target
sgRNA, yang berarti rata-rata hampir sembilan target tiap cDNA-nya,
bahkan bila prediksinya menggunakan sekuen guide berukuran 1921 bp,
dapat diidentifikasi rata-rata 32 target per cDNA-nya.
Teknologi CRISPR termasuk dalam new plant breeding techniques (NPBTs)
yang saat ini sedang diperdebatkan, terkait dengan peraturan pelepasan
produk hasil rekayasa genetika (genetically modified organisms/GMO).
Teknik-teknik ini memungkinkan terjadinya modifikasi genom tanaman
yang tidak dapat dibedakan dengan hasil modifikasi pemuliaan
konvensional dan mutagenesis kimia atau fisik, sehingga varietas
tanaman yang dihasilkan bisa jadi diklasifikasikan sebagai produk nonGMO

Hal ini biasa dilakukan dalam analisis genetik untuk memahami fungsi gen atau
fungsi protein yang mengganggu dengan cara-urutan spesifik dan memantau
dampaknya pada organisme. Namun, dalam beberapa organisme sulit atau tidak
mungkin untuk melakukan spesifik lokasi mutagenesis, dan karena itu metode
yang lebih tidak langsung harus digunakan, seperti membungkam gen yang
diinginkan oleh interferensi RNA pendek (siRNA). [4] Namun gen gangguan oleh
siRNA dapat variabel dan tidak lengkap. Editing genom dengan nucleases seperti
ZFN berbeda dari siRNA dalam bahwa nuklease direkayasa mampu memodifikasi
spesifisitas DNA-mengikat dan karena itu dapat pada prinsipnya memotong
setiap posisi yang ditargetkan dalam genom, dan memperkenalkan modifikasi
urutan endogen gen yang tidak mungkin secara khusus menargetkan oleh RNAi
konvensional. Selain itu, kekhususan ZFNs dan Talens ditingkatkan sebagai dua
ZFNs diperlukan dalam pengakuan bagian mereka dari target dan kemudian
langsung ke urutan tetangga.

Akan tetapi genome editing merupakan suatu cara rekayasa yang mengganti atau bahkan
menghilangkan dna yang ada pada organisme dengan senyawa lain
Suara Karya Online edisi 9 Maret 2010 Dr. Rosari Saleh dari Lembaga Penelitian Universitas
Indonesia (UI) mengatakan bahwa, Pada awalnya, teknologi rekayasa genetika ditujukan untuk
memperoleh organisme yang identik demi kepentingan riset dan produksi, seperti tanaman pangan
dan hewan riset. Modifikasi gen dilakukan dengan memanipulasi kode genetik tumbuhan dan hewan
serta merekayasa sifat-sifat tertentu dari kedua makhluk hidup tersebut agar diperoleh organisme
yang lebih baik.Kemajuan dalam mengetahui kemampuan kognitif dan kesehatan manusia secara
genetika membantu pendidikan dan program penyembuhan, tetapi dapat disalahgunakan untuk
mendis

Konsep [sunting]
Pendekatan yang umum dalam penelitian biologi modern adalah untuk
memanipulasi urutan genetik (genotipe) dari suatu organisme (atau sel tunggal)
dan mengamati dampak perubahan ini pada organisme (fenotipe). Pendekatan
seperti ini disebut reverse genetics dan maknanya bagi biologi modern terletak
pada relatif sederhana. Sebaliknya, dalam genetika maju fenotipe baru pertama
kali diamati dan kemudian secara genetik dipelajari. Tentu saja hal ini lebih
kompleks, karena perubahan fenotipe sering hasil dari beberapa interaksi
genetik.

Di antara aspek-aspek kunci dari analisis genetik reverse kemampuan untuk

memodifikasi kode genetik. Hal ini dapat dicapai dengan:

Situs-diarahkan mutagenesis yang mempekerjakan polymerase chain reaction

(PCR) dengan primer yang berisi mutasi yang diinginkan. (Di mana organisme itu
digunakan? Hanya bakteri?) [Rujukan?]
rekombinasi metode yang memanfaatkan kemampuan alami sel untuk bertukar
DNA antara informasi genetik sendiri dan DNA eksogen berbasis. Metode ini
telah dimungkinkan dalam ragi dan tikus. [Rujukan?]
Kedua pendekatan memiliki beberapa kelemahan:

Mereka kurang berhasil dalam organisme lain. [Rujukan?]

Mereka juga memerlukan langkah-langkah seleksi yang ketat dan dengan
demikian penambahan urutan tertentu seleksi, bersama dengan orang-orang
dimasukkan ke dalam DNA.
Mereka bisa sangat tidak efisien - misalnya pada tikus sel batang embrio diobati
dengan DNA donor, hanya 1 juta DNA mendapat dimasukkan pada posisi yang
diinginkan. [6]
Penggunaan teknik lain seperti transgenesis P-elemen dalam Drosophila juga
memiliki keterbatasan mereka, yang utama adalah keacakan pendirian dan
kemungkinan mempengaruhi gen lain dan pola ekspresi.

Oleh karena itu, editing genom dengan nucleases rekayasa, teknologi

berkembang pesat adalah pendekatan baru yang menjanjikan. Ini mengatasi
kekurangan ini dan menggunakan konsep yang relatif sederhana.

Istirahat terdampar ganda dan perbaikan mereka [sunting]

Pertama dan terutama dalam memahami penggunaan nucleases dalam
mengedit genom adalah pemahaman DNA double stranded istirahat (DSB)
mekanisme perbaikan. Dua jalur perbaikan DSB yang diketahui bahwa pada
dasarnya fungsional dalam semua organisme [rujukan?] Adalah ujung nonhomolog bergabung (NHEJ) dan homologi diarahkan perbaikan (HDR).

NHEJ menggunakan berbagai enzim untuk langsung bergabung dengan DNA

berakhir istirahat untai ganda. Sebaliknya, di HDR, urutan homolog digunakan

sebagai template untuk regenerasi hilang urutan DNA pada titik istirahat. Sifat
alami dari jalur ini membentuk sangat dasar nucleases editing genom berbasis.

NHEJ adalah rawan kesalahan sedemikian rupa sehingga terbukti menyebabkan

mutasi di lokasi perbaikan di sekitar 50% dari DSB di mikobakteri [7] dan juga
kesetiaan yang rendah telah dikaitkan dengan akumulasi mutasi di leukemia. [8]
Dengan demikian jika seseorang mampu membuat DSB pada gen yang
diinginkan dalam beberapa sampel, sangat mungkin bahwa mutasi akan
dihasilkan di situs di beberapa perawatan karena kesalahan yang dibuat oleh
perselingkuhan NHEJ.

Di sisi lain, ketergantungan HDR pada urutan homolog untuk memperbaiki DSBs
dapat dimanfaatkan dengan memasukkan urutan yang diinginkan dalam urutan
yang homolog dengan urutan mengapit dari DSB yang, bila digunakan sebagai
template oleh sistem HDR, akan menyebabkan penciptaan perubahan yang
diinginkan dalam wilayah genom bunga.

Meskipun mekanisme yang berbeda, konsep editing gen berbasis HDR adalah
dengan cara yang sama dengan yang homolog gen berbasis rekombinasi
penargetan. Namun, tingkat rekombinasi ini meningkat setidaknya tiga lipat
ketika DSBs diciptakan dan HDR sedang bekerja sehingga membuat rekombinasi
berbasis HDR jauh lebih efisien dan menghilangkan kebutuhan untuk tahap
seleksi yang ketat positif dan negatif. [9] Jadi berdasarkan pada prinsip-prinsip ini
jika seseorang mampu membuat DSB di lokasi tertentu dalam genom, maka
sistem perbaikan sel sendiri akan membantu dalam menciptakan mutasi yang
diinginkan.

Ganda istirahat-situs tertentu terdampar [sunting]

Penciptaan DSB di DNA tidak harus menjadi tugas yang menantang sebagai
enzim restriksi umum digunakan mampu melakukannya. Namun, jika DNA
genomik diobati dengan pembatasan endonuklease tertentu banyak DSBs akan
dibuat. Ini adalah hasil dari fakta bahwa sebagian besar enzim restriksi
mengenali pasangan basa beberapa di DNA sebagai target mereka dan sangat
mungkin bahwa kombinasi pasangan basa tertentu akan ditemukan di banyak
lokasi di seluruh genom. Untuk mengatasi tantangan ini dan membuat situs
khusus DSB, tiga kelas yang berbeda dari nucleases telah ditemukan dan buatan
sampai saat ini. Ini adalah nucleases jari Zinc (ZFNs), transkripsi-aktivator seperti
nucleases efektor (Talens) dan meganucleases. Di bawah ini adalah gambaran
singkat dan perbandingan enzim ini dan konsep di balik perkembangan mereka.

Nucleases rekayasa saat ini [sunting]

Kelompok saat nucleases rekayasa digunakan untuk geen. Mencocokkan warna

menandakan pola pengakuan DNA
Meganucleases, ditemukan biasanya dalam spesies mikroba, memiliki sifat yang
unik memiliki urutan pengakuan yang sangat panjang (> 14bp) sehingga
membuat mereka alami sangat spesifik [10] [11] Hal ini dapat dimanfaatkan
untuk membuat situs khusus DSB dalam mengedit genom.; Namun,
tantangannya adalah bahwa tidak cukup meganucleases diketahui, atau
mungkin pernah diketahui, untuk menutupi semua urutan target yang mungkin.
Untuk mengatasi tantangan ini, mutagenesis dan metode skrining throughput
yang tinggi telah digunakan untuk membuat varian meganuclease yang
mengakui urutan yang unik. [11] Lain-lain telah mampu memadukan berbagai
meganucleases dan menciptakan enzim hibrida yang mengenali urutan baru.
[12] Namun lain memiliki berusaha untuk mengubah berinteraksi aminoacids
DNA meganuclease untuk merancang urutan meganucelases tertentu dalam
sebuah metode bernama meganuclease dirancang secara rasional (US Patent
8021867 B2).

Meganuclease mendapatkan manfaat menyebabkan toksisitas kurang dalam sel

dibandingkan dengan metode seperti ZFNs mungkin karena pengakuan urutan
DNA yang lebih ketat; [11] Namun, pembangunan urutan enzim spesifik untuk
semua urutan yang mungkin adalah mahal dan memakan sebagai salah satu
waktu tidak menguntungkan dari kemungkinan kombinasi yang metode seperti
ZFNs dan Talens memanfaatkan. Jadi ada kelebihan dan kekurangan.

Berbeda dengan meganucleases, konsep di balik ZFNs dan Talens lebih

didasarkan pada enzim pemotong DNA non-spesifik yang kemudian akan
dihubungkan dengan urutan DNA spesifik mengakui peptida seperti jari seng dan
transkripsi penggerak seperti efektor (cerita). [13] Kunci untuk ini adalah untuk
menemukan endonuklease yang situs pengenalan DNA dan situs membelah
yang terpisah dari satu sama lain, situasi yang tidak umum di antara enzim
restriksi. [13] Setelah enzim ini ditemukan, sebagian membelah yang dapat
dipisahkan yang akan sangat non-spesifik karena akan memiliki kemampuan
pengenalan. Bagian ini kemudian dapat dikaitkan dengan urutan mengakui
peptida yang dapat menyebabkan spesifisitas yang sangat tinggi. Sebuah enzim
restriksi dengan sifat tersebut FokI. Selain itu FokI memiliki keuntungan yang
membutuhkan dimerisasi memiliki aktivitas nuklease dan ini berarti spesifisitas
meningkat secara dramatis karena setiap mitra nuklease akan mengenali urutan
DNA yang unik. Untuk meningkatkan efek ini, FokI nucleases telah direkayasa
hanya dapat berfungsi sebagai heterodimer dan telah meningkatkan aktivitas
katalitik. [14] heterodimer berfungsi nucleases akan menghindari kemungkinan

aktivitas homodimer yang tidak diinginkan dan dengan demikian meningkatkan

spesifisitas DSB. Meskipun sebagian nuklease kedua ZFNs dan Talens memiliki
sifat yang mirip, perbedaan antara nucleases rekayasa dalam mereka peptida
DNA pengakuan. ZFNs mengandalkan Cys2-His2 jari seng dan Talens di Tales.
Kedua domain peptida DNA mengakui memiliki karakteristik yang mereka alami
ditemukan dalam kombinasi protein mereka. Jari Cys2-His2 Zinc biasanya terjadi
dalam mengulangi yang 3 bp terpisah dan ditemukan dalam kombinasi beragam
di berbagai asam nukleat berinteraksi protein seperti faktor transkripsi. Cerita di
sisi lain ditemukan di mengulangi dengan pengakuan rasio satu-ke-satu antara
asam amino dan pasangan nukleotida diakui. Karena kedua jari seng dan cerita
terjadi dalam pola berulang, kombinasi yang berbeda dapat mencoba membuat
berbagai kekhasan urutan. [10] Seng jari telah lebih mapan dalam hal ini dan
pendekatan seperti perakitan modular (di mana jari Zinc berkorelasi dengan
urutan triplet yang melekat berturut-turut untuk menutup urutan diperlukan),
seleksi OPEN (rendah keketatan domain peptida vs nukleotida triplet diikuti
dengan pilihan tinggi keketatan kombinasi peptida vs target akhir dalam sistem
bakteri), dan satu-bakteri skrining hybrid perpustakaan zinc finger antara
metode lain telah digunakan untuk membuat nucleases spesifik lokasi.

Aplikasi [sunting]
Gen endogen targeted.jpg
Selama dekade terakhir, mengedit genom yang efisien telah dikembangkan
untuk berbagai sistem eksperimental mulai dari tanaman untuk hewan, sering di
luar kepentingan klinis, dan metode memegang masa depan yang menjanjikan
untuk menjadi strategi eksperimen standar dalam laboratorium penelitian. [15]
Generasi terbaru dari tikus, ikan zebra, jagung dan tembakau ZFN-dimediasi
mutan membuktikan pentingnya metode dan daftar ini berkembang dengan
cepat. Editing genom dengan nucleases rekayasa kemungkinan akan
memberikan kontribusi untuk berbagai bidang ilmu kehidupan dari mempelajari
fungsi gen pada tanaman dan hewan untuk terapi gen pada manusia. Misalnya,
bidang biologi sintetik yang bertujuan untuk insinyur sel dan organisme untuk
melakukan fungsi baru, kemungkinan untuk mendapatkan keuntungan dari
kemampuan nuklease direkayasa untuk menambah atau menghapus elemen
genom dan karena itu menciptakan sistem yang kompleks. [15] Selain itu, fungsi
gen dapat dipelajari dengan menggunakan sel induk dengan nucleases
direkayasa.

Di bawah ini adalah beberapa tugas khusus metode ini dapat melakukan:

Target mutasi gen

Membuat kromosom penataan ulang

Fungsi gen studi dengan sel induk

Hewan transgenik
Pelabelan gen endogen
Target penambahan transgen

Ikhtisar geen alur kerja dan editing kemungkinan

Selain gen yang ditargetkan pada tanaman [sunting]
Editing genom menggunakan ZFN menyediakan strategi baru untuk manipulasi
genetik tanaman dan kemungkinan untuk membantu rekayasa yang diinginkan
sifat tanaman dengan memodifikasi gen endogen. Misalnya, penambahan gen
spesifik pada spesies tanaman utama dapat digunakan untuk 'sifat susun'
dimana beberapa ciri yang diinginkan secara fisik terkait untuk memastikan
mereka co-segregasi selama proses pemuliaan. [14] Kemajuan dalam kasus
tersebut telah baru-baru dilaporkan di Arabidopsis thaliana [16] [17] [18] dan
Zea mays. Dalam Arabidopsis thaliana, menggunakan penargetan gen ZFNdibantu, dua gen tahan herbisida (tembakau acetolactate synthase Sura dan
Surb) diperkenalkan ke SuR lokus dengan setinggi 2% mengubah sel dengan
mutasi. [19] Di Zea mays, gangguan dari Target lokus dicapai oleh DSBs ZFNdiinduksi dan NHEJ yang dihasilkan. ZFN juga digunakan untuk menggerakkan
herbisida-toleransi ekspresi gen kaset (PAT) ke dalam lokus endogen ditargetkan
IPK1 dalam kasus ini. [20] modifikasi genom tersebut diamati pada tanaman
regenerasi telah terbukti diwariskan dan diteruskan ke generasi berikutnya. [20]

Beberapa optimasi perlu dibuat dalam rangka meningkatkan editing genom

tanaman menggunakan penargetan ZFN-dimediasi. [21] Ini termasuk desain
yang handal dan uji berikutnya dari nucleases, tidak adanya toksisitas nucleases,
pilihan yang tepat dari jaringan tanaman untuk penargetan, rute pengenalan
atau induksi aktivitas enzim, kurangnya off-sasaran mutagenesis, dan deteksi
handal kasus bermutasi. [21]

Terapi gen [sunting]

Praktek terapi gen yang ideal adalah yang menggantikan gen yang rusak dengan
yang normal alel di lokasi alaminya. Hal ini menguntungkan atas gen virally
disampaikan karena tidak ada kebutuhan untuk memasukkan coding urutan
penuh dan urutan peraturan ketika hanya proporsi kecil dari gen perlu diubah
seperti yang sering terjadi. [22] Ekspresi gen sebagian digantikan juga lebih

konsisten dengan biologi sel normal daripada gen penuh yang dibawa oleh
vektor virus.

Penargetan ZFN diinduksi juga dapat menyerang gen yang rusak di lokasi
kromosom endogen mereka. Contohnya termasuk pengobatan terkait-X parah
immunodeficiency gabungan (X-SCID) oleh ex vivo koreksi gen dengan DNA
membawa interleukin-2 reseptor rantai gamma umum (IL-2R) dengan urutan
yang benar. [23] insersional mutagenesis oleh retroviral yang vektor genom yang
diinduksi leukemia pada beberapa pasien, masalah diprediksi harus dihindari
oleh Geen dan ZFNs. Namun, ZFNs juga dapat menyebabkan off-sasaran mutasi,
dengan cara yang berbeda dari transductions virus. Saat ini banyak langkahlangkah yang diambil untuk meningkatkan deteksi off-sasaran dan menjamin
keamanan sebelum pengobatan.

Baru-baru ini, Sangamo BioSciences (SGMO) memperkenalkan Delta 32 mutasi

(penekan gen CCR5 yang merupakan co-reseptor untuk HIV-1 masuk ke sel T
sehingga memungkinkan infeksi HIV) menggunakan Zinc Finger Nuclease (ZFN).
Hasilnya dipresentasikan pada Konferensi Antar-51 pada Antimicrobial Agents
and Chemotherapy (ICAAC) yang diselenggarakan di Chicago dari September 1720, 2011. [24] Para peneliti di SGMO bermutasi CCR5 CD4 + sel T dan kemudian
menghasilkan T-sel HIV-tahan populasi. [25]

Prospek dan sekarang Keterbatasan [sunting]

Di masa depan, penelitian editing genom dengan nucleases direkayasa perlu
fokus pada peningkatan keamanan dan spesifisitas dari nucleases. Misalnya,
meningkatkan kemampuan untuk mendeteksi dari target peristiwa dapat
meningkatkan kemampuan kita untuk belajar tentang cara-cara mencegah
mereka. Selain itu, seng-jari digunakan dalam ZFNs jarang sekali spesifik, dan
beberapa dapat menyebabkan keracunan. Namun, toksisitas telah dilaporkan
dikurangi dengan modifikasi yang dilakukan pada domain pembelahan ZFN. [22]

Selain itu, studi oleh Dana Carroll melihat memodifikasi genom dengan
nucleases rekayasa menunjukkan kebutuhan pemahaman yang lebih baik
tentang dasar rekombinasi dan perbaikan mesin DNA. Di masa depan, metode
yang mungkin untuk mengidentifikasi target sekunder akan menangkap patah
ujung dari sel-sel mengekspresikan ZFNs dan untuk urutan DNA mengapit
menggunakan high-throughput sequencing. [22]

Editing genom terjadi juga sebagai proses alami tanpa rekayasa genetik buatan.
Para agen yang kompeten untuk mengedit kode genetik virus atau subviral RNAagen. [26]

Terakhir, kita juga harus menyadari bahwa meskipun geen memiliki efisiensi
yang lebih tinggi daripada banyak metode lain dalam genetika terbalik, masih
belum sangat efisien seperti dalam banyak kasus kurang dari setengah dari
populasi diperlakukan mendapatkan perubahan yang diinginkan. [19] Sebagai
contoh, ketika seseorang berencana untuk menggunakan NHEJ sel untuk
menciptakan mutasi, sistem HDR sel juga akan bekerja memperbaiki DSB
dengan tarif yang lebih rendah mutasi.