Geneti ,ffi
, & Tekn-togi"Ge66*
Doryl K. Granner, MD & P. Anlhony Weil,
PERAN SIOMEDIS-
Perkembangan DNA rekombinan, perneriksaan penyaring
high-density, high+hroughput, dan metodologi genetika
molekulal lain menimbulkan revolusi dalam bidang biologi
dan belclampak semakin besar pada ilmu kedokteran klinis.
Penvakit genetik manusia telah banyak dipeiajari melalui
analisis silsilair dan penelitian terhadap protein yang
terkena, tetapi pada banyak kasus dengan kelainan genetik
spesifik yang tidak diketahui, berbagai per.rdekatan ini tidak
dapat digunal<an. Teknoiogi-teknologi baru di atas telah
mengatasi belbagai kendala ini dengan langsung menuju
moleliui DNA untui< memperoleh infbrmasi. Manipuiasi
suatu sekuens DNA dan pen.rbentukan molekul chimeric
(campurarr/gabungan)-apa yang disebut sebagai rekayasa
genetik-merupakan suatu metode ur-rtuk meneliti cara kerja
suatlr segmen DNA terterrtu. Berbagai perangkat genetika
rnolekular baru memungkinkan para peneliti menyelidiki
dan memanipulasi sekuens genom serta meneliti profil
protein dan nRNA sel di tingkat molekul.
'Teknologi ini perlu dipahami karena beberapa alasan:
-Ibknologi
(1) ini memberikan pendekatan rasional untuk
rnemahami dasar molekular sejumlah penyakit (mis.
hiperkolesterolernia farnilial, penyakit sel sabit, talasemia,
fibrosis kistik, distrofi otot). (2) Teknologi ini rne mungkinkan
protein manusia dapat diproduksi dalam jumlah besar
untuk terapi (mis. insulin, hormon pertumbuhan, aktivator
plasminogen jaringan). (3) Kita dapat memperoleh protein
untuk membuat vaksin (mis, hepatitis B) dan pemeriksaan
diagnostik (mis. pemeriksaan AIDS). (4) Gknologi ini
digr,rnakan untuk mendiagnosis penyakit yang sudah
dii<etahui dan me mperkirakan risiko timbulnya suatu
penyakit. (5) lbknik-teknik khusus telah rnembawa banyak
kema.juan vang luar biasa dalam ilmr-r kedokteran f,orensik.
(6) 'Ibknologi ini memungkinkan ditemukannya terapi
Ltrr.il Ll.riL.rr r'tiirh rli alhir l, 'h rrr'.
PhD
gen untuk penyakit sel sabit, talasemia, defisiensi adenosin
deaminase, dan penyakit lain.
PENJETASAN CIRI.CIRI fVIENDASAR DNA
MEMUNGKINKAN DICIPTAKANNYA
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
DNA Ad<rloh Biopolimer Kompleks yong
Tersusun Sebogoi Heliks Gondq
Elemen penyusun mendasar adalah rangkaian basa purin
(adenin [A] atau guanin [G]) dan pirimidin (sitosin [C] atau
timin [T]). Rangkaian basa ini melekat pada posisi C-1'
gula deoksiribosa, dan terangkai melalui penyatuan gugus
gula di posisi 3' dan 5' melalui ikatan fosfodiester (Gambar
34-1). Gugus deoksiribosa dan fosfat yang berselang-seling
membentuk'tulang-punggung' heliks ganda (Gambar 34-
2). Ikatan 3'-5' ini juga menentukan orientasi untai tertentu
rnolekul DNA dan karena kedua untai berjalan dalam arah
berlawanan, keduanya dikatakan sebagai antiparalel.
Pembentukon Posqngon Bqstr Adoloh
Konsep Dosor Struktur & Fungsi DNA
Adenin dan timin selalu berpasangan melalui ikatan
hidrogen, demikian juga dengan guanin dan sitosin (Gambar
34-3). Pasangan basa ini dikatakan sebagai komplementer,
dan kandungan guanin dalam sebuah potongan DNA
untai-ganda akan selalu sama dengan kandungan sitosinnya;
dernikian pula, kandungan timin dan adenin setara. Untai-
untai t)NA dijaga keutuhai.rnya oleh pembentukan Pasangan
basa (base pairing) dan interaksi tumpukan basa yang bersifat
hidrofobik. Interaksi-interalai ini dapat dikurangi dengan
memanaskan DNA untuk mendenaturasikannya. Hukum-
hukum pembentukan pasangan basa r-nemperkirakan
bahwa dua untai DNA kompiementer akan kembali
menyatu (reanneal) secara tepat jika renaturasi dilakukan,
seperti yang terjadi ketika suhu larutan secara perlahan
414
 BAB 39: GENETIKA MOTEKULAR. DNA REKOMBINAN, & TEKNOLOGI
diturunkan menjadi normal. Sebenarnya, derajat kecocokan
(atau ketidak-cocokan) pembentukan pasangan basa dapat
diperkirakan dari suhu yang diperlukan untuk melakukan
denaturasi-renaturasi. Segmen-segmen DNA dengan derajat
kecocokan pasangan basa yang tinggi memerlukan lebih
banyak asupan energi (panas) agar mengalami denaturasi-
atau, dengan kata lain, suatu segmen yang berpasangan secara
tepat akan lebih mampu menahan panas sebelum untai-
untainya terurai. Reaksi ini digunakan untuk menentukan
ada atau tidaknya perbedaan bermakna antara dua sekuens
DNA, dan temuan ini mendasari konsep hibridisasi yang
bersifat fundamental bagi proses-proses yang dijelaskan di
bawah.
Pada setiap genom haploid m"tusia te{dapat sekitar
3 x lOe pasangan basa (pb). Jika panjang sebuah gen
rata-rata adalah 3 x 103 pb (3 kilobasa [kb]), genom dapat
mengandung sekitar 106 gen, dengan anggapan bahwa tidak
terdapat tumpang tindih dan transkripsi berlangsung hanya
dalam satu arah. Diperkirakan bahwa terdapat <105 gen
pada manusia dan hanya 1-2o/o dari DNA yang mengode
protein. Fungsi pasti dari sekitar 98o/o gen sisanya pada
genom manusia belum diketahui.
DNA heliks-ganda dikemas menjadi suatu struktur
yang lebih kompak oleh sejumlah protein, terutrma
protein-protein basa yang disebut histon. Kondensasi ini
dapat memiliki peran regulatorik dan jelas berperan dari segi
praktis. Jika DNAyang terdapat di dalam nukleus sebuah sel
diluruskan, akan memiliki panjang sekitar 1 meter. Protein-
protein kromosom memadatkan untai panjang DNA ini
sehingga dapat dikemas ke dalam sebuah nukleus dengan
volume beberapa mikrometer kubik.
DNA Tersusun Meniodi Berbogoi Gen
Secara umum, gen prokariot terdiri dari sebuah regio
regulatorik kecil (100-500 pb) dan sebuah segmen panjang
yang mengode protein (500-10.000 pb). Beberapagen sering
dikendalikan hanya oleh satu unit regulatorik. Sebagian
besar gen mamalia bersifat lebih rumit karena regio-regio
pengode diselang-selingi oleh regio-regio noncoding (ttdak
mengode protein) yang dieliminasi saat transkrip RNA
primer diproses menjadi ntessenger RNz4 (mRNA, RNA
perantara) yang matur. Regio pengode (coding region; yaitu
bagian yang muncul pada spesies RNA matur) disebut ekson,
dan regio bukan-pengode (noncoding region) yang terletak
di antara atau menyela elcson, disebut intron (Gambar 39-
1). Intron selalu dikeluarkan dari RNA prekursor sebelum
RNA diangkut ke daiam sitoplasma. Proses pengeluaran
intron dari RNA prekursor dan penyatuan ekson-ekson
disebut RNA splicing (penggabungan RNA). Pemrosesan
transkrip primer menjadi mRNA matur secara keliru
dapat menyebabkan timbulnya penyakit pada manusia
GENOMIK I 415
(lihat bawah); hal ini menggarisbawahi pentingnya tahap-
tahap pengolahan pascatranskripsi ini. Variasi ukuran dan
kompleksitas sebagian gen manusia dilukiskan pada Tabel
39'1. Meskipun terdapat perbedaan 300 kali lipat dalam
ukuran gen-gen yang diperlihatkan, ukuran mRNA hanya
bervariasi sekitar 20 kali lipat. Hal ini karena sebagian besar
DNA adalah gen-gen yang terdapat sebagai intron, dan intron
cenderung jauh lebih besar dibandingkan dengan elson.
Regio-regio regulatorik untuk gen-gen eukariot spesifik
biasanya terletak di dalarn DNA yang mengapit temPat
inisiasi (awal) transkripsi di ujung 5' (5'fla.nhing-seqaence
DNA). Kadang-kadang, sekuens-sekuens ini ditemukan di
dalam gen itu sendiri atau di regio yang mengapit ujung 3'
gen. Pada sel mamalia, masing-masing gen memiliki sendiri
regio regulatoriknya. Banyak gen eukariot (dan sebagian
virus yang bereplikasi di dalam sel mamalia) memiliki
regio-regio khusus yang disebut enhancers (penguat) yang
meningkatkan iaju transkripsi. Sebagian gen juga memiliki
sekuens-sekuens DNA yang dikenal sebagai silsncers
(peredam), yang menekan transkripsi. Gen mamalia jelas
merupakan struktur yang rumit dan multikomponen.
Gen Ditrqnskripsikon Meniodi RNA
Informasi umumnya mengalir dari DNA ke mRNA hingga
protein, seperti dilukiskan pada Gambar 39-1, dan dibahas
secara lebih rinci di Bab 38. Hal ini adalah proses yang diatur
secara ketat serta melibatkan sejumlah tahapan kompleks'
yang masing-masing dan diatur oleh satu atau lebih enzim
atau faktor; kesalahan fungsi di setiap langkah ini dapat
menimbulkan penyakit.
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
METIBATKAN ISOTASI & MANIPULASI
DNA UNTUK MENGHASILKAN
MOIEKUI KIMER
Isolasi dan manipulasi DNA, termasuk penyambungan
sekuens ujung-ke-ujung dari sumber yang sangat berbeda
untuk menghasilkan molekul gabungan/kimer (chimeric
molecules, misalnya molekul yang mengandung sekuens
DNA manusia dan bakteri tanPa bergantung pada
sekuensnya), adalah intisari dari riset DNA rekombinan.
Untuk melakukan hal ini diperlukan beberapa teknik dan
reagen khusus.
Enzim Restriksi Memotong Rontqi DNA
di Loknsi Spesifik
Endonuklease tertentu-enzim yang memotong DNA di
sekuens-sekuens tertentu di dalam molekul DNA (berbeda
dengan eksonuklease, yang mencerna molekul DNA dari
416 / BAGIAN lV: STRUKTUR, FUNGSI, & REPLIKASIMAKROMOLEKUL PEMBAWA INFORMASI

,."fi,i3i3..* o5;nJ?",.
basal
'"'f,:1ff1,;:i'*' p"J:#8:;""
Poli(A)
, l- a*ron Ekson
DNA u' ffiW.'
\.J \.., '., \_______--\1--_--J
Regio lntron Regio
noncoding noncoding
5'r3'
t_
I transkrtps,
NUKLEUS
+
TranskripRNAprimer
"""W
I Modifikasi di-
I ujung 5'dan 3'
v
TranskripyangtelahmengalamimodifikasiWAAA---A
Tuo=ing Ekor Poli(A)
I Pengeluaran intron dan
{ neneoabunean (splicing) ekson
mRNAnukleus yang telah diproses AAA---A
W
I
- -l- pengangkutan
SITOPLASMA * metintasi membran

mRNA @AAA_A
I rr"rtttsi
+
/'--X-\
Protein NH'J U5L cooH

Gambar 39-1. Susunan unit transkripsi eukariot dan jalur ekspresi gen eukariot. Cen-gen eukariot memiliki regio
struktural dan regio regulatorik. Regio struktural terdiri dari sekuens DNA yang mengode (coding) serta sekuens DNA
noncoding (tidak mengode protein) 5'dan 3'. Regio pengode dibagi menjadi dua bagian: (1) ekson yang akhirnya
disatukan bersama untuk menjadi RNA matur, dan (2) intron yang diproses keluar dari transkrip primer. Regio struktural
pada ujung 5'nya dibatasi oleh tempat permulaan (inisiasi) transkripsi dan pada ujung 3'nya oleh tempat penambahan
poliadenilat atau tempat terminasi (penghentian). Regio promotor yang mengandung sekuens-sekuens DNA spesifik
dan berinteraksi dengan berbagai faktor protein untuk mengatur transkripsi, dibahas secara rinci pada Bab 36 dan
38. Transkrip primer memiliki suatu struktur khusus, cap (tudung), di ujung 5'dan serentetan A di ujung 3'. Transkrip
ini diolah untuk mengeluarkan intron; dan mRNA matur kemudian dipindahkan ke dalam sitoplasma, tempat zat ini
ditranslasikan menjadi protein.

ujung-ujungnya)-adalah alat kunci dalam riset DNA dan menyebabkannya tidak dapat menjadi substrat bagi
rekombinan. Enzim-enzim ini disebut enzim restriksi enzim restriksi. Oleh karena itu, DNA metilase site-specific
(res*iction enzyne) karena keberadaan enzim-enzim ini dan enzim restriksi selalu berada berpasangan daiam suatu
dalam bakteri tertentu menghambat pertumbuhan virus bakteri.
bakteri tertenru yang disebut bakteriofaga. Enzim restriksi Enzim restriksi diberi nama sesuai bakteri asalnya.
memotong DNA, dari manapun asalnya, menjadi porongan- Contohnya, EcoR[ berxaJ. dari Escherichia coli, dan BamHI
potongan pendek dengan cara yang spesifik untuk setiap berasal dari Bacillus amyloliquifuciens (Tabel 39-2). Tigl-
sekuens-berbeda dengan metode enzimatik, kimiawi, huruf pertama adalah nama enzim restriksi yang terdiri dari
atau fisik lain, yang memurus DNA secara acak. Enzim huruf pertama genus (E) dan dua huruf pertama spesies
pertahanan ini (telah ditemukan hingga ratusan) melindungi (co). Huruf-huruf ini dapat diikuti oleh nama galur (R) dan
DNA bakteri dari DNA organisme asing (terutama faga angka romawi (I) untuk menunjukkan urutan penemuan
infektif). Namun, enzim-enzim ini hanya terdapat di dalam (mts. EcoRI, EcoRII). Masing-masing enzim mengenali
selyangjugamemiiiki enzimyangmemerilasiDNApejamu, dan memotong sekuens DNA untai-ganda spesifik
 BAB 39: GENETIKA MOLEKULAR, DNA REKOMBINAN, & TEKNOLOGI GENOMIK / 417

Tabel 39-1. Variasi ukuran dan kompleksitas Tabel 39-2, Endonuklease restriksi tertentu dan
beberapa gen dan mRNA manusial. spesifisitas sekuensnyar.

, .t' 2 ,0.$ J.i ',,,,, ""'B6cilf.us. i,l .i

.:,1,,2, 0,4
GGATCC ', omYloltque-
CCTAGG i fociens H
.gesepl{tr,,$ renergjk'.-: -, j ..., 3', ,,, ,,0 2:,2
,l:i

'" :l ]
r
' :1a"riti*
,:Albii..Ei
"i:-'.' ,', i,
r: ,1. t. ,l' 25 '', r,14 '2,;X Bgfil ,*l: r, l

:,,,.,,, its AGATCT ', ololbiaii

'Resbptb.f, ,
:, 17
TCTAGA
FqktorVJfi ,,;i '"196,. ,;'-, ,,,25 l , ?,0 t
Ti,r.ogtrobulin,,,'..uq ,...;,,,,,1,,:,,
j,, ',J,Q$
"'.,i ,,1';,,36 , :il ' : .8.2r:r fcofl J ,''
GAA.TTC
rUkuran dinyatakan dalam kilobasa (kb). Ukuran gen mcncakup beberapa CTI-AAG
sekuens regio regulatorik dan promotor proksimal; regio regio ini biasanya f
memiliki ukuran yang sama untuk semua gen. Cen bervariasi dalam ukuran
EcoRl/ .t
dari sekitar 1500 pasangan basa (pb) hingga lebih dari 2 x 106 pb. iumlah
CCTGG
intron dan ekstron juga sangat bervariasi. Cen reseptor p-adrenergik tidak
GGACC
memiliki intron, dan gen tiroglobulin memiliki 36 intron. Seperti terlihat dari ;']: .r r+,
perbedaan yang lebih kecil dalam ukuran mRNA, intron terdiri dari scbagian
besar sekuens gen. i,lindltl

dengan panjang 4-7 pb. Potongan-potongan DNA ini

menghasilkan ujung tumpul (blunt ends) (mis. HpaI) ata.t Hhal Haemopkilus
ujung tumpang-tindih (ujung lengket; sticby ends) (mis. ij.' tioerlolylF .,

BamHI) (Gambar 39-2),bergantung pada mekanisme yang '. a'',"tt1,'.,"1'

digunakan oleh enzim. Ujung lengket terutama bermanfaat -,r,..,;-- , -l-.rai:ir
"
dalam menciptakan molekul DNA hibrid atau campuran Hoemophilui
(lihat bawah). Jika keempat nukleotida terdistribusi secara paroinflvey
zoe
acak dalam sebuah molekul DNA, kita dapat menghitung
seberapa sering suatu enzim akan memotong panjang sebuah ;.:fiii";l-.
DNA. Untuk setiap posisi di dalam molekul DNA, terdapat Gsler,Al{ie,{g ;
empat kemungkinan (A, C, G, dan T); oleh karena itu, "','.", r, I :CCTNiAGG' ;',":,': ' .cg.lguJ,,' ,.r,:,1
' GGAzuTCC
.t,,t:::,,:,tillt,,
:t
l
? :,i"':' ,: ,,.
:

sebuah enzim restriksi yang mengenali sekuens 4 pb akan , I

memotong, secara rata-rata, satu kali setiap 256 pb (4"), ro
,Pstl Providencls,:. ',
sedangkan enzim lain yang mengenali sekuens 6 pb akan CTGEAG , rruorfrr,,rl{4.
r, t, .t,,ir.,iii:i,.::l
memotong setiap 4096 pb (40). Sepotong DNA memiliki CACGTC r,..,

rangkaian linier khas tempat-tempat untuk berbagai enzim t',

yang ditentukan oleh sekuens iinier basa-basanya; karena lbqt '
t,,i',,'

itu, suatu peta restriksi (restriction map) dapat dibuat. Jika :.I.TCGA
,,,i'AGCT
DNA dicerna oleh enzim tertentu, ujung semua fragmen
memiliki sekuens DNA yang sama. Fragmen-fragmen
.',.i'1 ' '"1
yang dihasilkan dapat diisolasi dengan elektroforesis pada rA, adenin; C, sitosin; C, guanin; T, timin. Tanda panah menunjukkan tempat

gel agarosa atau poliakrilamid (lihat pembahasan tentang
blot transfer, di bawah); hal ini adalah tahap penting dalam
melakukan kloning dan merupakan kegunaan utama enzim-
enzim ini.
Sejumlah enzim lain yang bekerja pada DNA dan RNA
merupakan bagian penting dari teknologi DNA rekombinan.
Banyak dari enzim tersebut dibahas di bab ini dan di bab-
bab selanjutnya (Tabel 39-3).
pemutusan; dapat terbentuk ujung Iengket (tlanrHl) atau ujung tumpul (Hpal),
bergantung pada tenrpat pemutusan. Panjang sekuens yang dikenal dapat
mcncapai 4 pb lTaqt), 5 pb (EcoR//), 6 pb (fcoR/), atau 7 pb (Mst//), atau lebih
panjang. Berdasarkan l<aidah, sekuens ini ditulis dalam arah 5'atau 3' untuk
untai alas masing-masing sekuens pengenal, dan untai bawah diperlihatkan
dengan polaritas yang bcrlarvanan (,vi. 3'atau 5'). Perhatil<an bahwa sebagian
besar sekuens yang dikenal aclalah palindrorr (vi. sekuens membaca sama
dalam arah yang berlawanan di kedua untai). Residu yang disebut N berarti
bahrva senru;r nukleotida dapat berada di tempat terscbut.
418 / BAGIAN lV: STRUKTUR, FUNGSI, & REPLIKASI MAKROMOLEKUL PEMBAWA INFORMASI

A. Ujung lengket atau staggered end

5' GATC C- 3',
--G GATC C-
llllll
" -G CCTA
BamHI, I *l I

Gambar 39-2. Hasil pencernaan dengan endonuklease

I

C T AG
-C restriksi. Pencernaan dengan endonuklease restriksi dapat
B, Ujung tumpul menyebabkan terbentuknya fragmen-fragmen DNA dengan
G T T A A C- 3, T T A A C_ rujung lengkct, atau kohesif (A) atau u;'ung tumpul (B). Hal ini

IIIIII
CAAT
Hpat> -G
Il A A
*ll1ttl aclalah hal yang penting dipertimbangkan cialam merancang
stratcgi pcngklorrarr.
-.C

Enzim Resfriksi & DNA Ligose Digunokon
untuk Mempersiopkqn Molekul DNA
Gobungon
Ligasi ujung-l engket. (sticky-end ligation) secara teknis mudah
dilakukan, tetapi sering diperlukan teknik-teknik khusus
untuk mengatasi masalah yang inheren pada pendekatan ini.
dengan menggunakan enzim terminal transferase ujung-
r-rjung baru ditambahkan. Jika poli d(G) ditambahkan
ke ujung-ujung 3' vektor dan poli d(C) ditambahkan ke
ujung-ujung 3' DNA asing, kedua molekul hanya dapat
bersambungan satu sama lain sehingga masalah-masa-lah
yang disebut sebelumnya dapat diatasi. Prosedur ini disebut
h o m op o ly m er ra i ling (p eoy amb un gan h omopolimer) . Lin h e rs

Ujung-ujung Iengket pada suatu vektor dapat kembali saling
berikatan, tanpa disertai penambahan netto DNA. Ujung-
ujung lengket fragmen juga dapat kembali bersambungan
sehingga terbentuk insert heterogen tandem. Ujung-ujung
lengket juga dapat tidak terpajan atau berada dalam posisi
yang tepat. Untuk mengatasi masalah-masaiah ini, digunakan
suatu enzim yang menghasilkan ujung-ujung tumpul, dan
(penghubung) oligonukleotida dupleks sintetik berujung-
tumpul dengan sekuens restriksi enzim yang sesuai kadang-
kadang diikatkan dengan DNA berujung tumpul. Ligasi
ujung-tumpul langsung dilakukan dengan menggunakan
enzim bakteriofaga 'f4 DNA ligase. Meskipun kurang
efisien dibandingkan dengan ligasi ujungJengket, teknik
ini memiliki keunggulan dapat menyatukan setiap pasangan

Tabel Sg-3. Sebagian enzim yang digunakan dalam riset DNA rekombinanl

Transf€isse
r.tldiminol',

rDiadaptasi dan diproduksi ulang dengan izin dari Ernery AEll. llalaman 41 dalam An lntroducLion La Reconbinant DNA. Wile,v, 1984. Hak Cipta O 1984 iohn
Wiley & Sons Limited. Diproduksi dengan izin.
 BAB 39: GENETIKA MOIEKUIAR, DNA REKOMBINAN, & TEKNOLOGI GENOMIK / 419

Endonuklease
restriksi
EcoRI

DNA. plasmid sirkular DNA plasrnid linier

dengan ujung lengket
tu\
I Endonuklease
I
restriksi EcoRr
J
AATT
GTNil[Hrc
aw@ry
TTAA
Polongan DNA manusia yang
DNA dipotong dengan nuklease restriksi
ligase yang sama dan mengandung
ujung-ujung lengket yang sama

Molekul DNA plasmid yang mengandung

DNA manusia {molekul DNA rekombinan)

Gambar 39-3. Pemakaian nuklease restriksi untuk membuat molekul DNA rekombinan atau gabungan yang baru. Jika dimasukkan
kembali ke dalam sel bakteri (melalui proses yang disebut transformasi), biasanya hanya satu plasmid yang diserap oleh satu sel,
dan DNA plasmid tidak hanya mereplikasi dirinya sendiri tetapi juga potongan DNA baru yang secara fisik menempel padanya.
Penyatuan ujung-ujung lengket, seperti yang ditunjukkan pada garnbar, menghasilkan sekuens DNA yang sama dengan sekuens
yang dikenali oleh enzim restriksi semula, potongan DNA klon yang dimasukkan dapat dipotong keluar secara bersih dari lingkaran
plasmid rekombinan dengan endonuklease ini. Jika untuk sumber DNA manusia, kita menggunakan suatu campuran potongan-
potongan DNA yang diciptakan dari pengolahan DNA manusia total dan diberi suatu nuklease restriksi, sekitar sejuta tipe molekul
DNA rekombinan yang berbeda-beda dapat diperoleh, rnasing-masing murni dalam klon bakterinya sendiri (Dimodifikasi dan
diproduksi ulangdenganizindari CohenSN.Themanipulatiorrof genes.Sci AmUulil 1975;233:25. HakCiplaOTheEstateof Bunji Tagawa).

ujung-ujung DNA. Kekurangannya adalah bahwa tidak
terdapat kontrol terhadap orientasi insersi atau jumlah
molekul yang disatukan, dan sisipan yang dimasukkan tidak
mudah diambil kembali.
Pengklonon Memperbonyok DNA
Suatu klon (clone) adalah populasi besar molekul, bakteri,
atau sel identik yang berasal dari satu nenek moyang.
Pengklonan molekular memungkinkan kita memproduksi
molekul DNA yang idendk dalam jumlah besar, yang
kemudian dapat diteliti karakternya atau digunakan untuk
tujuan lain. Teknik ini didasarkan pada kenyataan bahwa
molekul DNA kimer atau hibrid dapat dibentuk dalam
vektor pengklonan (cloning aector)-biasanya plasmid
bakteri, faga, atau kosmid-yang kemudian terus bereplikasi
di sel peiamu dalam sistem kontroln,va sendiri. Dengan
cara ini, DNA kimer dapat diperbanyak. Prosedut umum
diperlihatkan pada Gambar 39-3.
Plasmid bakteri adalah molekul DNA dupleks kecil
melingkar yang fungsi alaminya memberikan resistensi
andbiotik terhadap sel pejamu. Plasmid memiliki beberapa
sifat yang menyebabkannya sangat bermanfaat sebagai vektor
pengklonan. Plasmid terdapat sebagai salinan tunggal atau
multipel di dalam bakteri dan bereplikasi tanpa bergantung
pada DNA bakteri. Sekuens DNA lengkap dari banyak
plasmid telah diketahui; oleh karena itu, tersedia lokasi pasti
tempat pemutusan enzim restriksi unruk menyisipkan DNA
asing. Plasmid lebih kecil dibandingkan dengan kromosom
pejamu sehingga mudah dipisahkan dari kromosom, dan
DNA yang telah dimasuki plasmid mudah dikeluarkan
melalui pemotongan plasmid dengan enzim yang spesifik
untuk tempat restriksi yang merupakan tempat potongan
DNA asli dimasukkan.
42O / BAGIAN lV: STRUKTUR, FUNGSI, & REPLIKASIMAKROMOLEKUL PEMBAWA INFORMASI
Faga biasanya memiliki molekul DNA linier tempat
DNA asing dapat dimasukkan ke dalamnya di beberapa
.lokasi enzim restriksi. DNA gabungan (kimer) dikumpulkan
setelah faga menjalani siklus litiknya dan menghasilkan
partikel-partikei faga infektif yang matang. Keunggulan
utamavektor faga adalah bahwa sementara plasmid menerima
potongan DNA dengan panjang sekitar 6-10 kb, faga dapat
menerima potongan DNA dengan panjang 10 20 kb, suatu
keterbatasan yang diakibatkan oleh jumlah DNA yang dapat
dikemas ke dalam kepala faga.
Fragmen DNA yang lebih besar dapat diklon dalam
kosmid (cosmid) yang memadukan keunggulan plasmid dan
faga. Kosmid adalah plasmid yang mengandung sekuens-
sekuens DNA (disebut jugacos-sites) yang diperlukan untuk
mengemas DNA lambda menjadi partikel faga. Vektor ini
tumbuh dalam bentuk plasmid di dalam bakteri, tetapi
karena banyak dari DNA lambda yang tidak diperlukan
telah dikeluarkan, lebih banyak DNA gabungan yang dapat
dikemas di dalam kepala partikel faga. Tidak jarang kosmid
membawa potongan-potongan DNA gabungan dengan
panjang 35-50 kb. Bahkan potongan DNA yang lebih besar
dapat dimasukkan ke dalam bacterial artifcial chromosome
(BAC, kromosom artifisial bakteri), least artif.cial
chromosome (YAC, kromosom artifisial ragi), atau vektor
berbasis bakteriofag E. coli P-l (PAC). Vektor-vektor ini
akan menerima dan memperbanyak potongan DNA dengan
panjang beberapa ratus kilobasa atau lebih dan umumnya
telah menggantikan vektor plasmid, faga, dan kosmid
untuk beberapa aplikasi pemetaan gen dan pengklonan.
Perbandingan vektor-vektor ini disajikan pada Tabel 39-4.
Karena insersi DNA ke dalam regio fungsional vektor
akan mengganggu kerja regio ini, fungsi esensial vektor
perlu diperhatikan agar tidah terganggu. Namun, konsep ini
dapat dieksploitasi untuk menghasilkan suatu teknik sele ksi.
Contohnya, vektor plasmid umum pBR322 memiliki gen-
gen resistensi tetrasiklin (tet) dan ampisilin (amp). Satu
tempat enzim restriksi PstI di dalam gen resistensi amp
sering digunakan sebagai tempat inser-si untuk sepotong
DNA asing. Seiain memiliki ujung-ujung lengket (Tabel 39-
2 dan Gambar 39-2), DNA yang dimasukkan di bagian ini
merusak gen resistensi amp dan menyebabkan bakteri yang
membawa plasmid ini
menjadi peka terhadap ampisilin
(Gambar 39-4). Oleh karena itu, plasmid induk yang
memberikan resistensi terhadap kedua antibiotik, dapat
dengan mudah dipisahkan dari plasmid gabungan, yang
hanya resisten terhadap tetrasiklin. YAC memiliki fungsi
seleksi, replikasi, dan segregasi yang bekerja baik pada sel
bakteri maupun ragi sehingga dapat diperbanyak di kedua
organisme tersebut.
Selain vektor-vektor yang dijelaskan pada Tabel 39-4
yang dirancang terutama untuk perbanyakan di dalam sel
bakeri, vektor juga dikembangkan untuk memperbanyak sel
Tahel 39-tl. Kapasitas penBklonan berbagai vektor
pengklonan yang biasa digunakan
mamalia dan ekspresi gen (cDNA)/protein sisipan. Vektor-
vektor ini semuanya didasarkan pada berbagai virus eukariot
yang terdiri dari genom RNA atau DNA. Contoh penting
vektor virus semacam ini adalah vektor yang menggunakan
genom adenovirus (berbasis-DNA) dan retrovirus (berbasis-
RNA). Meskipun ukuran sekuens DNA yang dapat
disisipkan agak terbatas, vektor pengklon virus mamalia
ini dapat mengatasi kekurangan ini karena vektor ini akan
menginfeksi berbagai jenis sel secara efisien. Karena alasan
ini, saat ini sedang dilakukan penelitian terhadap berbagai
vektor virus mamalia untuk digunakan dalam eksperimen
terapi gen.
Suqtu Perpusfokoon Mengondung
Kumpulon Klon Rekombinon
Kombinasi enzim restriksi dan berbagai vektor pengk-lon
memungkinkan kita mengemas genom keseluruhan
suatu organisme ke dalam sebuah vektor. Kumpulan klon
rekombinan vang berbeda-beda ini disebut perpustakaan.
Perpustakaan genornik (genomic librarjt) dibuat dari DNA
total suatu turunan sel atau jaringan. Perpustakaan cDNA
(cDNA library) terdiri dari salinan DNA komplementer
dari populasi nRNA suatu jaringan. Perpustakaan DNA
genomik sering dibuat dengan melakukan digesti parsial
DNA total dengan enzim restriksi yang memotong DNA
secara frekuen (mis. pemotong empat 6asa seperti TaqI).
Gagasannya adalah untuk menghasilkan fragmen yang agak
besar sehingga sebagian besar gen akan tetap utuh. Vektor
BAC, YAC, dan PI lebih disukai karena vektor-vektor ini
dapat menerima fragmen DNA yang sangat besar sehingga
memberikan kemungkinan lebih besar untuk mengisolasi
sebuah gen intak pada satu fragmen DNA.
Vektor tempat gen yang disisipkan melalui teknologi
DNA rekombinan benar-benar menghasilkan protein yang
disebut vektor ekspresi. Vektor semacam ini sekarang
sering digunakan untuk mendeteksi molekul cDNA spesifik
dalam perpustakaan dan menghasilkan protein melalui
teknik rekayasa genetik. Vektor-vektor ini diciptakan secara
 BAB 39: GENETIKA MOLEKULAR, DNA REKOMBINAN, & TEKNOLOGI GENOMIK / 421

Gen
resistensi ampisilin

Gen resistensi
tetrasiklin

Dipotong terbuka
dengan Psl/

W Kemudian
-+
dimasukkan
DNA yang telah
dipotong dengan Pst/

pBR322 pejamu pBR322 gabungan (kimer)

Gambar 39-4. Suatu metode untuk skrining adanya fragmen-fragmen DNA yang disisipkan dalam rekombinan. Dengan
menggunakan plasmid pBR322, sepotong DNA disisipkan ke dalam tempat Pstl. lnsersi ini mengganggu gen yang mengode
suatu protein yang menghasilkan resistensi ampisilin bagi bakteri pejamu. Oleh karena itu, plasmid gabungan ini tidak lagi
dapat bertahan jika ditanam pada medium substrat yang mengandung antibiotik ini. Jika, perbedaan sensitivitas terhadap
tetrasiklin dan ampisilin dapat digunakan untuk membedakan berbagai klon plasmid yang mengandung suatu sisipan. Skema
serupa, yang berdasarkan pembentukan suatu fusi in-frame dari sisipan DNA baru yang menghasilkan potongan peptida yang
mampu melengkapi suatu bentuk inaktif p-galaktosidase, memungkinkan terbentuknya koloni biru-putih pada lempeng agar
yang mengandung suatu zat warna yang dapat dihidrolisis oleh B-galaktosida. Koloni positif-B galaktosidase tampak biru;
koloni ini berisi plasmid yang mengandung sisipan DNA.

khusus agar mengandung promotor terinduksi yang sangat
aktif, kodon-kodon inisiasi fase transiasi yang sesuai, sinyal
penghentian translasi serta transkripsi dan sinyal pengolah
protein yang sesuai, jika diperlukan. Sebagian vektor ekspresi
bahkan mengandung gen yang mengode inhibitor protease
sedemikian rupa sehingga produk akhir meningkat.
Pelqcqk lProbel Mencori Gen qtqu Molekul
cDNA Spesifik dolom Perpustokoon
Berbagai molekul dapat digunakan untuk "melacak" gen
atau molekul cDNA spesifik dalam perpustakaan atau untuk
mendefinisikan dan mengetahui jumlah DNA atau RNA
yang dipisahkan dengan elektroforesis melalui berbagai gel.
Pelacak (probe) umrmnya adalah potongan DNA atau RNA
yang diberi label nukleotida yang mengandung 32p-x12u
nukleotida yang berlabel fluoresen (sekarang lebih banyak
digunakan). Hal yang penting, kedua modifikasi (label
32P
dengan atau fluoresen) tidak memengaruhi sifat hibridisasi
pelacak asam nukleat berlabel yang terbentuk. Agar efektif,
pelacak harus mengenali suatu sekuens komplementer. Suatu
cDNA yang disintesis dari mRNA tertentu dapat digunakan
untuk menskrining perpustakaan cDNA dalam mencari
cDNAyang lebih panjang atau perpustakaan genomik untuk
mencari sekuens komplementer dalam regio pengode suatu
gen. Gknik populer untuk menemukan gen spesifik adaiah
dengan mengambil suatu sekuens pendek asam amino dan
dengan menggunakan kodon untuk spesies tersebut (lihat
Bab 37), yang membuat sebuah pelacak oligonukleotida
yang akan mendeteksi fragmen DNA yang sesuai di dalam
perpustakaan genomik. Jika sekuens tersebut benar-benar
cocok, akan terjadi hibridisasi probe dengan panjang 15-20
nukleotida. Pelacak cDNA digunakan untuk mendeteksi
potongan DNA pada Southern blot nansfer dan untuk
mendeteksi serta menghitung jumlah RNA pada ltlorthern
blot transfer. Antibodi spesifik juga dapat digunakan sebagai
pelacak asalkan vektor yang digunakan menyintesis molekul
protein yang dikenali oleh antibodi tersebut.
Teknik BIoIIing & Hibridisosi
Memungkinkqn Kito Melihot Frqgmen
Spesifik
Untuk melihat potongan DNA atau RNA spesifik di
antara ribuan molekul "pencemar" diperlukan perpaduan
sejumlah teknik, yang secara kolektif disebut blot nansfer.
Gambar 39-5 memperlihatkan prosedur Southern (DNA)'
Northern (RNA), dan 'Western (protein) blot transfer.
422 / BAGIAN lV: STRUKTUR, FUNGSI, & REPLIKASI MAKROMOLEKUL PEMBAWA INFORMASI
# x
Southern Northern Western
,fi
,=x
IIII llllEbkrrororesis
II
tI L_l se
i elektroforesis, direnaturasi, dan dianalisis untuk interaksi
Pemindahan
ffi I cDNA' I cnrun' I
ke kertas
on,,ooo- Tambahkan
t t I pebcak
t-t
t--l
t-l
Autoradiografi
Gambar 39-5. Prosedur blot transfer. Pada Southern (DNA) blot
transfer, DNA yang diisolasi dari suatu sel atau jaringan dicerna
dengan satu atau lebih enzim restriksi. Campuran ini diteteskan
ke dalam sebuah sumur pada gel agarosa atau poliakrilamid dan
dipajankan dengan arus listrik searah. DNA, karena bermuatan
negatif, akan bermigrasi ke arah anoda; fragmen yang lebih kecil
akan bergerak paling cepat. Setelah waktu tertentu, DNA akan
mengalami denaturasi akibat pajanan terhadap basa ringan dan
dipindahkan ke atas kertas nitroselulosa atau nilon, dalam suatu
replika yang identik dengan pola pada gel, dengan menggunakan
teknik b/ottrng 1,ang dirancang oleh Southern. DNA terikat pada
kertas karena pajanan terhadap panas, dan kertas kemudian
mengalami pemajanan terhadap pelacak cDNA berlabel, yang
berikatan dengan fragmen komplementer pada filter. Setelah dicuci
bersih, kertas dipajankan dengan film sinar X yang diciptakan untuk
mengungkapkan beberapa pita spesifik yang sesuai dengan fragmen
DNA yang dikenali oleh sekuens di pelacak cDNA. Pada hakikatnya
baik RNA maupun Northern, teknik b/ot-nya serupa. Pada RNA
dilakukan elektroforesis sebelum blot transfer. Hal ini memerlukan
beberapa tahap berbeda dengan tahapan yang dilakukan pada
pemindahan DNA, terutama untuk memastikan bahwa RNA tetap
utuh. dan umumnya agak lebih sulit. Pada protein, atau Western,
b/ot, protein dielektroforesis dan dipindahkan ke nitroselulosa
dan kemudian dilacak dengan antibodi spesifik atau molekul
pelacak lain. (* menunjukkan pemberian label, baik dengan bahan
radioaktif maupun fluoresen). Pada kasus Southwestern blotting
(lihat teks; tidak diperlihatkan), suatu protein blot yang serupa
dengan yang diperlihatkan di bawah "Western" dipalankan dengan
asam nukleat berlabel. dan kompleks protein-asam nukleat yang
terbentuk kemudian dideteksi dengan autoradiografi.
(Yang pertama dinamai sesuai nama orang yang merancang
teknik tersebut, dan nama-nama lain semula adalah istilah
laboratorium, tetapi sekarang sudah merupakan istilah yang
dapat diterima). Prosedur-prosedur ini bermanfaat dalam
menentukan berapa banyak salinan suatu gen yang terdaPat
dalam iaringan tertentu atau ada ddaknya perubahan besar
pada suatu gen (delesi, penyisipanlinsersi, atau tata-ulang).
Kadang-kadang, jika terjadi perubahan sebuah basa tertentu
atau perubahan tempat restriksi, Prosedur-Prosedur ini
dapat mendeteksi adanya mutasi
dan
'W'estern
titik. Teknik Northern
bht nansfer masing-masing digunakan untuk
mengetahui ukuran dan jumlah molekul RNA dan Protein
spesifik. Teknik hibridisasi keempat, Soutbutestexn blot,
meneliti interaksi protein-DNA. Protein dipisahkan dengan
melalui hibridisasi dengan menggunakan pelacak DNA
berlabel yang spesifik.
Hibridisasi koloni atau plak adalah metode untuk
mengidentifikasi dan memurnikan berbagai klon spesifik.
Bakteri dirumbuhkan sebagai koloni pada lempeng agar
dan dilapisi oleh kertas saring nitroseluiosa. Sel dari masing-
masing koloni melekat pada kertas saring dan terfiksasi
permanen di tempat tersebut oleh panas, yang dengan
pemberian NaOH juga melisiskan sel dan mendenaturasi
DNA sehingga DNA akan terhibridisasi oleh pelacak. Suatu
pelacak berlabel radioaktif ditambahkan pada kertas saring,
dan (setelah pencucian) kompleks hibrid dilokalisasi dengan
memajankan kertas saring dengan film sinar-X. Dengan
mencocokkan titik di autoradiografi ke suatu koloni, koloni
tersebut dapat diambil dari lempeng agar. Strategi serupa
digunakan untuk mengidentikasi fragmen-fragmen dalam
perpustakaan faga. Penerapan prosedur ini secara berulang
menghasilkan isolat klonal (koloni bakteri) atau plak faga
individual.
Semua prosedur hibridisasi yang dibahas pada bagian ini
bergantung pada sifat pasangan basa spesifik dari untai-untai
asam nukleat komplementer seperti dijelaskan di atas. Pasangan
yang cocok akan segera terhibridisasi dan tahan terhadap
suiu tinggi dalam reaksi hibridisasi dan pencucian. Pada
keberadaan konsentrasi garam yarg rendah, juga terbentuk
kompleks spesifik. Pasangan yang tidak benar-benar cocok
tidak akan dapat mentoleransi s*ingent condition (kondisi/
aturan ketat) ini (yi. peningkatan suhu dan konsentrasi garam
yang rendah); karena itu, hibridisasi tidak akan pernah terjadi
atau terganggu pada tahap pencucian. Famili-famili gen, yang
sedikit banyak terdapat homologi, dapat dideteksi dengan
mengubah-ubah tingkat ketatnya hibridisasi dan tahap
pencucian ini. Pembandingan antarspesies dari suatu gen juga
dapat dilakukan dengan menggunakan pendekatan ini. Saat
ini, peneiiti telah menciptakan kondisi-kondisi hibridisasi
yangmampu mendeteksi cukup satu ketidakcocokan pasangan
basa antara pelacak dan sasaran.
Untuk Menenfukqn Sekuens DNA Tersediq
Teknik Monuol & Ofomotis
Segmen-segmen molekul DNA spesifik yang diperoleh
dengan teknologi DNA rekombinan dapat dianalisis untuk
 BAB 39: GENETIKA MOLEKULAR, DNA REKOMBINAN, & TEKNOLOGI GENOMIK / 423

menentukan sekuens nukleotidanya. Metode ini bergantung
pada kemampuan kita untuk memperoleh molekul DNA
identik dalam jumlah besar. Persyaratan ini dapat dipenuhi
dengan melakukan klon fragmen yang bersangkutan, dengan
menggunakan teknik-teknik yang dijelaskan di atas. Metode
enzimatik man aal (S anger) menerap kan dideoksi n ukleotida
spesifikyang menghentikan sintesis untai DNA di nukleotida
tertentu sewaktu untai sedang disintesis pada cetakan murni.
Reaksi disesuaikan sedemikian rupa sehingga diperoleh
popuiasi fragmen-fragmen DNA yang mencerminkan
penghentian di setiap nukleotida. Dengan melekatkan
suatu label radioaktif di ujung yang berlawanan dari tempat
penghentian, kita dapar memisahkan fragmen-fragmen
sesuai ukurannya dengan menggunakan elektroforesis
gel poliakrilamid. Autoradiografi dilakukan, dan masing-
masing fragmen menghasilkan suaru citra (pita) pada film
sinar-X. Citra ini dibaca untuk memperoleh sekuens DNA
(Gambar 39-6). Metode manual iain (Maxam dan Gilbert)
menggunakan metode kimia unruk memutus molekul DNA
di tempat-tempatyang mengandung nukleotida spesifik. Pada
penentuan sekuens DNA secara oromaris, digunakan teknik
yang ddak memerlukan pemakaian radioisotop. Teknik
yang paling sering digunakan adalah prosedur otomatis yang
menggunakan empat label fluoresen berbeda-satu label
mewakili masing-masing nukleotida. Masing-masing label
memancarkan sinyal spesifik jika tereksitasi oleh berkas laser,
dan hal ini dapat direkam oleh komputer.
Sintesis Oligonukleorido Kini Rurin Dilqkukqn
Sintesis kimiawi otomaris oligonukieotida yang panjangnya
sedang (sekitar 100 nukieotida) dengan sekuens tertentu
kini menjadi prosedur laboratorium yang rutin dilakukan.
Masing-masing siklus sintetik memerlukan waktu beberapa
menit sehingga keseluruhan molekul dapat dibuat dengan
menyintesis segmen-segmen yang relatif pendek dan dapat
disambung satu sama lain. Oligonukleotida kini menjadi
hal yang tidak tergantikan untuk penenruan sekuens DNA,
skrining perpustakaan, pengikatan protein-DNA, DNA
mobility shifi assaTs, reaksi berantai polimerase (lihat bawah),
site-directed mutagenesis, pembuatan gen sinretik, dan
berbagai penerapan lainnya.
Reqksi Berontoi Polimerqse (Polymerase
Chain Reaction, PCR) Memperbonyok
Sekuens DNA
Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah metode ampiifikasi
suatu sekuens DNA tertentu. PCR merupakan cara yang
sensitif, selektif, dan sangat cepat untuk memperbanyak

Reaksi yang mengandung bahan berlabel radioaktif Sekuens untai asli:

ddGTP ddATP ddTTP ddCTP - A- G - T - C, T, T- G - G- A, G - C T-3'

'6
Io
e
-q
u

-t
- "il
t.l
;a berakhir
iill
AGTC
1

T TGGAGCT

Gambar 39-6. Penentuan sekuens DNA dengan metode yang dirancang oleh Sanger. Susunan yang menyerupai tangga
menggambarkan, dari bawah ke atas, semua fragmen yang semakin panjang pada untai DNA asii. Dengan mengetahui
reaksi dideoksinukleotida spesifik mana yang dilakukan untuk menghasilkan masing-masing campuran fragmen, kita dapat
menentukan sekuens nr-,kleotida dari ujung tidak berlabel ke ujung berlabel (*) dengan membaca gel ke arah atas. Pada
penentuan sekuens secara otomatis, dilakukan pembacaan deoksinukleotida yang dimodifikasi secara kimiawi. Hukum
pasangan-basa Watson dan Crick (A-T, C-C) menentukan sekuens untai yang Iain (komplementernya) (*menandakan
tempat pemberian label radioaktif).
424 / BAGIAN IV: STRUKTUR, FUNGSI, & REPLIKASIMAKROMOLEKUL PEMBAWA INFORMASI

sekuens DNA yang diinginkan. Spesifisitas didasarkan pada

pemakaian dua oligonukl eotida primer yang terhibridisasi ke
sekuens komplementer di untai DNA yang berlawanan dan
mengapit sekuens target (Gambar 39-7). Sampel DNA mula-
mula dipanaskan untuk memisahkan kedua untai; primer
dibiarkan berikatan dengan DNA; dan masing-masing untai
disalin oleh suatu DNA polimerase yang dimulai di tempat
primer. Kedua untai DNA masing-masing berfungsi sebagai
cetakan untuk sintesis DNA baru dari dua primer- SiHus
berulang denaturasi panas, penyattan primer dengan sekuens
komplementernya, dan pemanjangan primer yang telah
menyatu tersebut dengan DNA polimerase menyebabkan
perbanyakan eksponensial segmen DNA dengan panjang
tertentu. Realai-reaksi PCR awal menggunakan suatu DNA
poiimerase E. coli yang rusak oleh setiap siklus denaturasi
panas. Penggantian dengan DNA polimerase tahan-panas
dari Thermus aquaticus (atau DNA polimerase yang seara
dari bakteri termofiiik lain), suatu organisme yang hidup dan
berkembang biak pada suhu 70-80 oC, mengatasi masalah
ini sehingga memungkinkan terjadinya otomatisasi real$i,
karena reaksi polimerase'dapat dijalankan pada suhu 70 "C.
Hal ini juga meningkatkan spesifisitas dan hasil DNA.
Sekuens DNA sependek 50-100 pb dan sepanjang 10
SIKLUS 3
kb dapat diperbanyak. Dua puluh siklus akan menghasilkan
perbanyakan sebesar 106 dan 30 siklus sebesar 10e. PCR
memungkinkan DNA di dalam sebuah sel, folikel rambut,
atau spermatozoa diperbanyak dan dianalisis. Karena itu, tl+
PCR jelas digunakan dalam bidang kedokteran forensik. ff
PCR juga digunakan (1) untuk mendeteksi agen infelai,
terutama virus laten; (2) menegakkan diagnosis genetika
@
IF
pranatal; (3) mendeteksi polimorfisme alel; (4) menentukan ffi
tipe jaringan yang tepat untuk transplantasi; dan (5) meneliti
evolusi, dengan menggunakan DNA dari sampel arkeologis
@
atau (6) menggunakan analisis RNA setelah penyalinan
RNA dan kuantitasi mRNA dengan teknik yang disebut
sebagai metode RT-PCR (salinan cDNA dari mRNA yang
dihasilkan oleh reuerse trantniptase retrovirus). PCR juga
@ MTn]TtTrlTrrrrrwt

gffirmrrnmW
Gambar 39-7. Reaksi berantai polimerase digunakan untuk
memperbanyak sekuens gen tertentu. DNA untai-ganda dipanaskan
W
untuk memisahkannya menjadi untai-untai tunggal. Untai-untai ini
mengikat dua primer tertentu yang ditujukan pada sekuens spesifik
di untai yang berlawanan dan yang menentukan segmen yang akan SIKLUS 4-n
diperbanyak. DNA polimerase memperpanja ng primer di kedua arah
dan menyintesis dua untai komplementer terhadap dua untai asli'
Siklus ini diulang beberapa kali yang menghasilkan perbanyakan
produk dengan pan.iang dan sekuens tertentu. Perhatikan bahwa
kedua primer berada dalam keadaan berlebih.
 BAB 39: GENETIKA MOLEKULAR, DNA REKOMBINAN, & TEKNOLOGI GENOMIK / 425

Tabel 39-5. Lokalisasi gen manusial

lnsulin 1 lpiS
Froloktin, 6p23'q1?
Hormon perfumbuhon 17q21-qter Defisiensi hormao peitumbuhoh:,
"'
a-Globin ': ' 1 6p 1 2-pter cr-Tolosemio

BGlobin Ilpl? gdalqsenic,,sej sohiir.i r: r ':: i::

ir-
Adenosin dearninsse 20q13-qier Defisiensi :odenosin,deur,ninose,
",."
Feni[olonin hidr,oksilose 12q24 Fenilketonurio
Flipoxontin-guonin Xq26-q27 Sindrom Lesch-Nvhsn
fosforibosi ltrunsferase
DhlA regmen G8 4,p Koreo Huniington

'Tabel ini menunjukkan lol<asi beberapa gen di I<romosorr dan penyakit yang berkaitan dengan defisiensi atau
produksi produk gen yang abnormal. Kromosorr yang bersangkutan ditunjukkan olelr angka atau huruf pertama.
Angka dan lruruf lain merujuk pada lokasi pasti, seperti didefinisikan dalam McKusick, Victor A, MD. it4endelian
lnheritanct: in Man: Calalogs ctl Autosonal Dorninanl, ALtlasonal Rece.s.sive, and X Linked Phenorypes. Hak Cipta
O 1 983 iohns Hopkins University Press. Dicetak ulang dengan izin clari Johns Hopkins Universitv Press.

banyak digunakan dalam bidang ilmu pengetahuan dasar, dan identifikasi histologik kromosom. Fluorescence in situ
setiap tahun pemakaian baru metodeini dikembangkan. hybridization (FISH) adaiah teknik yang sangat sensitifjuga
digunakan untuk tujuan ini. Dengan teknik ini, lokasi gen
PENERAPAN PRAKTIS TEKNOLOGI DNA sering diketahui di pita atau regio tertentu pada kromosom.

REKOMB|NAN SANGAT BANYAK
Isoiasi gen spesifik dari genom keseluruhan memerh-rkan
suatu teknik yang akan membedakan satu bagian dari sejuta.
Identifikasi suatu regio regulatorik dengan par.rjang vang
hanya dapat mencapai l0 pb memer'lukan sensirivites satu
bagian per 3 x 1 08; suatu penyakit seperti anemia se1 sabit
disebabkan oleh perubahan satu basa, arau saru bagian dari
3x 10e. Teknologi DNA rekombinan cukup kuat untuk
me laksanakan 5emua tugas ini.
Pemeloon Gen Menentukqn Lokosi Gen
Spesifik di Kromosom Terlenlu
Penentuan lokasi gen dapat mendefinisikan pera genom
manusia. Hal ini sudah menghasiikan informasi bermanfaat
dalam mendefinisikan penyakit manusia. Hibridisasi sel
somatik dan hibridisasi in situ adalah dua teknik yang
digunakan untuk melakukan hal ini. Pada hibridisasi in
situ, yaitu prosedur yang lebih sederhana dan langsung,
ditambahkan suatu pelacak radioaktif ke penyebaran
metafase kromosom pada kaca obyek. Daelah pasti hibridisasi
diketahui dengan melapiskan emulsi fotografik di atas kaca,
dan setelah pajanan, menga.jarkan butiran-butiran dengan
Sebagian gen manusia yang lokasinya diketahui dengan cara
ini dicantumkan pada Thbel 39-5. Tabel ini hanyalah suatu
contoh karena ribuan gen telah berhasil dipetakan sebagai
hasil dari penentuan sekuens genom manusia. Jika kelainan
sudah diketahui terletak di suatu regio DNA yang memiliki
struktur gen yang khas (Gambar 39-1), suatu gen sintetik
dapat diciptakan yang kemudian diekspresikan dalam
vektor yang sesuai serta dianalisis fungsinya-atau peptida
yang susunannya diperkirakan dari open reading fame dt
regio pengode dapat disintesis. Antibodi yang ditujukan
pada peptida ini dapat digunakan untuk menilai kebenaran
bahwa peptida ini diekspresikan pada orang normai dan
tidak dijumpai pada mereka yang mengidap sindrom genetik
yang bersangkutan.
Prolein Dopol Diproduksi unluk
Kepentingqn Risef & Diognosis
Tirjuan praktis riset DNA rekombinan adalah menghasilkan
bahan yang dapat digunakan dalam bidang biomedis.
Teknologi ini memiliki dua manfaat berbeda: (1) Dapat
menghasilkan bahan dalam jumlah besar yang tidak dapat
diperoleh dari metode pemurnian konvensional (mis.
interferon, plasminogen dctiuating factor jaringan). (2)
426 / BAGIAN lV: STRUKTUR, FUNGSI, & REPLIKASIMAKROMOLEKUL PEMBAWA INFORMASI

Dapat menghasilkan zatyang terdapat pada manusia (mis.
insulin, hormon pertumbuhan). Keunggulan kedua hal ini
jelas terlihat. Meskipun tujuan utama adalah menghasilkan
produk-umumnya protein-untuk terapi (insulin)
diagnosis (pemeriksaan AIDS) penyakit pada manusia dan
hewan lain serta untuk mencegah penyakit (hepatitis B),
masih terdapat penerapan komersial lain yang potensial,
terutama dalam bidang agrikuitur. Salah satu contoh
penerapan dalam bidang agrikultur adalah upaya untuk
merekayasa tumbuhan yang lebih tahan terhadap kekeringan
atau suhu ekstrem, lebih efisien menyerap nitrogen, atau
menghasilkan benih yang mengandung asam amino esensial
lengkap (beras, gandum, jagung, dsb.).
Teknologi DNA Rekombinqn Digunokon
dolom Anqlisis Molekulor Penyokit
A. VARIASI GEN NORMAL
Sekuens DNA memiliki variasi normal seperti halnya aspek-
aspek struktur manusia yang lebih jelas terlihat. Variasi
sekuens DNA, atau polimorfisme, terjadi pada sekitar
dari setiap 500 nukleotida, atau sekitar 107 kali per genom.
Pada keadaan ini, pasti terdapat delesi atau insersi DNA
serta substitusi satu basa. Pada orang sehat, perubahan ini
jelas terjadi di regio-regio DNA yang tidak mengode protein
(noncoding regions) atau di tempat yang tidak menyebabkan
perubahan fungsi protein yang dikode. Polimorfisme
struktur DNA yang dapat diwariskan ini dapat berkaitan
dengan penyakit tertentu dalam suatu keluarga besar dan
dan dapat digunakan untuk mencari gen spesifik yang terlibat,
seperti digambarkan di bawah. Hal ini juga dapat digunakan
dalam berbagai aplikasi di bidang kedokteran forensik.
B. VARIASI GEN YANG MENYEBABKAN
PENYAKIT
Para ahii genetika klasik mengajarkan bahwa sebagian
besar penyakit genetik disebabkan oleh mutasi titik yang
menghasilkan protein abnormal. Hal ini mungkin masih
berlaku, tetapi fika saat membaca bagian-bagian awal bab
ini, kita memperkirakan bahwa penyakit genetik dapat
ditimbulkan oleh gangguan pada salah satu dari tahap-
tahap yang diperlihatkan pada Gambar 39-1, kita dapat
melakukan penilaian yang sesuai. Hal ini dilukiskan dengan
baik oleh pemeriksaan gen B-globin. Gen ini terletak pada
suatu kelompok di kromosom 1 1 (Gamb ar 39-8), dan versi
yang diperbesar dari gen ini diperlihatkan pada Gambar 39-
9. Gangguan pembentukan p-globin menyebabkan berbagai
1 penyakit dan timbul akibai berbagai lesi di dalam dan di
sekitar gen B-globin (Tabei 39-6).
C. MurAsr Tntrc
Contoh klasik adalah penyakit sel sabit yang disebabkan
oleh mutasi satu basa dari 3 x 10e dalam genom, suatu

' to trr
Hemoglobinopati

I Talasemia-Bo

I Talasemia-Bo

I Hemoglobrn Lepore

Talasemia-(Ay6P)o Tipe lll

Gambar 39-8. Cambaran skematis kelompok gen globin dan lesi pada beberapa penyakit genetik. Cen B-globin terletak
di kromosom 1 1 dan berkaitan erat dengan dua gen y-globin dan gen 6-globin. Famili gen p tersusun dalam urutan 5'-
e-Cy-Ay-ryB-6-B-3'. Lokus e diekspresikan pada masa mudigah dini (sebagai ctrs,). Cen y diekspresikan pada masa ianin,
yang menghasilkan hemoglobin janin (HbF, oryr). Hemoglotrin dewasa terdiri dari HbA (ctrpr) atau HbA, (crr6r). tyB adalah
rr"i, pr"udog"n yungrn"*iiki homologi sekuenj dengan B, tetapi mengandung mutasi-mutasi yang mencegah ekspresinya.
Suatu regio pengendali lokus (locus control rcgion, LCR) yang terletak di sebelah hulu (5') dari gen e mengendalikan laju
transkripii keseluruhan kelompok gen B-globin. Delesi (balok hitam) lokus B menyebabkan talasemia-p (defisiensi atau
tidak terbentuknya [PnJ dari p-globin). Delesi 6 dan B menyebabkan hemoglobin Lepore (hanya hemoglobin cr yang ada)'
lnversi (Ay6B)0 di regio ini (balok terbesar) merusak fungsi gen dan juga menyebabkan talasemia (tipe Ill). Masing-masing tipe
talasemia cenderung ditemukan pada kelompok orang tertentu, misalnya inversi delesi (Ay5F)0 terjadi pada orang dari lndia.
Banyak delesi lain di regio ini telah berhasil dipetakan, dan masing-masing menyebabkan suatu jenis talasemia.
 BAB 39: GENETIKA MOLEKULAR, DNA REKOMBINAN, & TEKNOLOGT GENOM|K / 427

Tabel 39-6. Perubahan struktur gen B-globin
Iolosemio:[}
substitusi DNA T:ke-A, yang pada gilirannya menyebabkan
perubahan A-ke-U pada mRNA yang sesuai dengan kodon
keenam dari gen B-globin. Kodon yang berubah ini mengode
asam amino yang berbeda (valin dan bukan asam glutamat),
dan hal ini menyebabkan kelainan strukrur molekul B-
globin. Mutasi ritik (point mutariln) lain di dalam dan di
sekitar gen B-globin menyebabkan penurunan produksi
atau, pada sebagian kasus, tidak diproduksinya B-globin;
talasemia-B terjadi karena mutasi-mutasi ini. (Thlasemia
ditandai oleh kelainan pada sintesis subunit hemoglobin,
sehingga talasemia-B terjadi jika produksi p-globin kurang
memadai). Gambar 39-9 memperlihatkan bahwa mutasi
titik yang mengenai masing-masing dari banyak proses yang
terlibat dalam pembentukan mRNA normal (dan karenanya
protein normal) diperkirakan berperan sebagai penyebab
talasemia-B.
D. DeTesI, INSERSI, DAN TATA-ULANG DNA
Studi terhadap bakteri, virus, ragi, dan lalat buah
memperlihatl<an bahwa porongan-porongan DNA dapat
berpindah dari satu ternpat ke tempatlain dalam suatu genom.
Delesi sepotong DNA penting, tara-ulang (rearrangemeni)
DNA dalam suatu gen, atau insersi (penyisipan) seporong
DNA dalam suatu regio pengoc-le atau regio regulatorik,
semuanya dapat menyebabkan penLbahan ekspresi gen yang
berakibat timbulnya penyakit. Sekali lagi, analisis rnolekular
terhadap talasemia-B menghasilkan banyak contoh dari
proses-proses di 21x5-6s1utama delesi-sebagai penyebab
penyakit (Gambar 39-8). Kelompok gen globin tampaknya
sangat rentan terhadap lesi ini. Delesi pada kelompok
a-globin, yang terletak di kromosom 16, menyebabkan
talasemia-o. Pada banyak delesi, terdapat keterkaitan etnik
yang erat, sehingga orang keturunan Eropa utara, Filipina,
orang berkulit hitam, dan Mediterania memiliki lesi yang
berbeda, yang semuanya menl'g[x[kan tidak terbenruknya
hemoglobin A dan ralrscmia-cx.
Analisis serupa dapat dibuat untuk berbagai penyakit
lain. Mutasi titik biasanya ditentukan oleh sekuens DNA
sesuai permintaan, walaupun kadang-kadang, jika mutasi
tersebut merusak atau menciptakan tempat enzim restriksi,
teknik analisis fragmen restriksi dapat digunakan untuk
menentukan lesi. Delesi arau insersi DNA yang lebih besar
dari 50 bp sering dapat dideteksi dengan prosedur Sourhern
blotting.
E. ArunusIs SILSILAH
Penyakit sel sabit sekali lagi merupakan contoh yang sangar
baik tentang cara penerapan teknologi DNA rekombinan

000 0 00
II I I -L- I

TT T
NN AA
I

Cambar 39-9. Mutasi di gen B-globin yang menyebabkan talasemia-B. Cen p-globin diperlihatkan dalam orientasi 5, ke
3'. Daerah bergaris miring menun.jukkan regio 5'dan 3'yang tidak ditranslasikan. Pembaca:rn dari arah 5'ke 3', daerah
berarsir adalah ekson 1-3 dan daerah yang kosong adalah intron 1 (1,) dan 2 (lr). Mutasi yang memengaruhi kontrol
transkripsi (r) terletak di regio pengapit DNA 5'. Contoh mutasi nonsense (A), mutasi dalam pengolahan mRNA (0), dan
mutasi pemutusan RNA (O) pernah diidentifikasi dan diperlihatkan pada gambar ini. Di sebagian regio, telah banyal<
ditemukan mutasi-mutasi lain. Mutasi:mutasi ini ditandai oleh tanda kurung besar (-).
428 / BAGIAN IV: STRUKTUR, FUNGSI, & REPLIKASIMAKROMOLEKUL PEMBAWA INFORMASI
dalam studi tentang penyakit manusia. Penggantian T oleh
A di untai cetakan DNA dalam gen B-globin mengubah
iekuens di regio yang sesuai dengan kodon keenam dari
J bagai restriction fagment length polymorphisms, atau RFLP
CCTGAGG Untai pengode
GGAC|I-'CC Untai cetakan
,|
menjadi
CCTGTGG Untai pengode
GGAC|A]CC [Jntai cetakan
dan merusak tempat pengenalan (recognition site) untuk
enzim restriksi MstII (CCTNAGG; yang ditandai oleh tanda
panah vertikal kecil; Tabel 39-2).Tempat MstII yanglain 5'
dan 3' dari tempat ini (Gambar 39-10) tidak terpengaruh
sehingga akan terpotong. Oleh karena itu, inkubasi DNA dari
orang normal (AA), heterozigot (AS), dan homozigot (SS)
menghasilkan tiga pola transfer Southern blot yang berbeda-
beda (Gambar 39-10). Hal ini menggambarkan bagaimana
suatu silsilah DNA dapat dibuat dengan menggunakan
prinsip-prinsip yang dibahas pada bab ini. Analisis silsilah
telah diterapkan pada sejumlah penyakit genetik dan paling
bermanfaat pada penyakit yang disebabkan oieh delesi dan
insersi atau kasus-kasus iarang dengan tempat Pemutusan
enzim restriksi yang terpengaruh, seperti pada contoh yang
disajikan di sini. Analisis dipermudah oleh reaksi PCR, yang
dapat menghasilkan cukup banyak DNA untuk dianalisis
hanya dari beberapa buah sel darah merah berinti.
F. DIIONOSIS PRANATAL
Jika lesi genetiknya telah dipahami dan tersedia pelacak
spesifik, mungkin kita dapat melakukan diagnosis pranatal'
DNA dari sel yang berasal dari hanya 10 mL cairan amnion
(atau dari biopsi vilus korion) dapat dianalisis dengan
Southern bht transfer. Janin dengan pola restriksi AA dalam
Gambar 39-10 tidak terkena penyakit sel sabit dan bukan
merupakan pembawa sifat. Janin dengan pola SS akan
mengidap penyakit ini. Kini tersedia pelacak untuk tipe
analisis semacam ini pada banyak penyakit genetik.
G. RESTRTCTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM (RFLP) & POIIUORFISME
NUKLEOTIDA TUNGGAL (SINGLE NUCLEOTIDE
POLYMORPHTSM ISNPJ)
Perbedaan sekuens DNA yang disebutkan di atas dapat me-
nyebabkan variasi tempat-tempat restriksi dan, karenanya,
variasi panjang fragmen restriksi. Demikian juga, polimor-
fisme nukleotida tunggal (single nucleotide polymorphism,
SNP), dapat dideteksi dengan metode PCR yang sensitif'
Perbedaan herediter dalam pola restriksi (mis. variasi DNA
yang terjadi pada lebih dari lo/o populasi umum) dikenal se-
Peta RFLP dan SNP yang lengkap untuk genom manusia
kini sedang dibuat. Hal ini terbukti bermanfaat dalam Hu-
man Genome Sequencing Project dan merupakan komponen
penting dalam upaya untuk memahami berbagai penyakit
gen-tungg"l dan penyakit multigen. RFLP terjadi karena
per,rbah"n satu-basa (mis. penyakit sel sabit) atau akibat
delesi atau insersi DNA ke dalam fragmen restriksi (mis' ta-
lasemia) dan telah terbukti sebagai alat diagnostikyang ber-
manfaat. RFLP telah ditemukan di lokus-lokus gen tertentu
dan dalam sekuens-sekuens yang fungsinya tidak diketahui;
karena itu, RFLP dapat mengganggu fungsi gen atau mung-
kin tidak memiliki konsekuensi biologis.
RFLP dan SNP bersifat herediter, dan keduanya mengalami
segregasi menurut hukum mendel. Pemakaian utama RFLP
(kini telah diketahui ribuan) adalah dalam definisi penyakit-
penyakit herediter yang defisit fungsionalnya tidak diketahui'
SXplnffp dapat digunakan untuk membentuk kelompok
keterkaitan (linkage groupl, yang selanjutnya, melalui proses
chrotnosome ualbing, aldtirnya akan dapat menentukan lokus
penyakit. Pada chromosome walking (Gambar 39-11), suatu
fragmen yang mewakili salah satu ujung dari sebuah potongan
panjang DNA digunakan untuk mengisolasi fragmen lain
yang tumpang-tindih, tetapi mempetparyang yang Pertama'
ArJ perpanjangan ditentukan oleh peta restriksi, dan
prosedur diulang secara berurutan sampai diperoleh sekuens
yang diinginkan. Penyakit-penyakit terkait-kromosom X
sangat cocok untuk pendekatan dengan prosedur ini karena
hanya satu alel yang diekspresikan. Karena itu, 20olo RFLP
yang telah diketahui terletak pada kromosom X, dan peta
k.terk"it"n kromosom ini sudah cukup lengkap. Gen untuk
penyakit terkait-kromosom X, distrofi otot tipe Duchenne'
ditemukan de ngan menggunakan RFLP Demikian juga, defek
pada penyakit Huntington diketahui terletak di regio terminal
i.ng"n p.nd.k kromosom 4, dan defek yang menyebabkan
penyakit ginjal polikistik diketahui berkaitan dengan lokus cr-
globin di kromosom 16.
H. POLIMORFISME DNA MIKROSATELIT
Dalam genom manusia terdapat unit-unit pengulangan
tandem bNR y""g pendek (2-6 pb), herediter, dan muncul
sekitar 50.000 sampai 100.000 kali (Bab 35)' Unit-unit
tersebut menggantikan RFLP sebagai lokus penanda untuk
berbagai pelacakan genom karena lebih sering ditemukan-
dan mengingat pemakaian rutin metode-metode PCR yang
sensitif.
 BAB 39: GENETIKA MOLEKULAR, DNA REKOMBINAN, & TEKNOLOGI GENOMIK / 429

A.Tempat-tempat restriksi Mst / di sekitar dan di dalam gen p-globin

Normal (A) 5'

Sabit (S)

B. Analisis silsilah

{r, {}i m" (], []a rjr

Ukuran
fragmen

1,35 kb

I 1,15 kb

Genotipe

Gambar 39-10. Analisis silsilah pada penyakit sel sabit. Bagian atas gambar (A) memperlihatkan
bagian pertama dari gen B-globin dan tempat-tempat enzim restriksi Mstl/ di gen B-globin normal
(A) dan sel sabit (S). Pencernaan dengan enzim restriksi Mstl/ menghasilkan fragmen-fragmen DNA
dengan panjang 1,15 kb dan 0,2 kb pada orang normal. Perubahan T-ke-A pada orang dengan
penyakit sel sabit menghilangkan salah satu dari ketiga tempat Mstl/ di sekitar gen p-globin; karena
itu sebagai respons terhadap Mstll, salu fragmen restriksi dengan panjang 1,35 kb dihasilkan.
Perbedaan ukuran ini mudah dideteksi dengan Southern b/ot (Fragmen 0,2 kb berada di luar gel
dalam ilustrasi ini). (B) Analisis silsilah memperlihatkan tiga kemungkinan: AA = normal (lingkaran
tak berarsir); AS = heterozigot (lingkaran setengah terarsir, persegi setengah terarsir); SS = homozigot
(persegi terarsir). Pendekatan ini memungkinkan kita menegakkan diagnosis pranatal penyakit sel
sabit (persegi berarsir). Lihat teks.

I. RFLP & VruTn DALAM KEDOKTERAN FoRENSIK J. TERAPI GEN

Unit-unit uariable numbers of tandemly re?eats (\n'lTF')
adalah salah saru tipe "insersi" yang sering dijumpai dan
menyebabkan RFLP \/NTR dapat diwariskan dan unit-
unit ini bermanfaat untuk memastikan keterkaitan genetik
dengan suatu penyakit dalam suaru keluarga atau kelompok;
atau unik bagi suatu individu sehingga berfungsi sebagai
sidik-jari molekular individu tersebut.
Penyakit yang disebabkan oleh defisiensi suatu produk gen
(Tabel 39-5) dapat diobati dengan terapi sulih (replacement
therapy). Strateginya adaiah dengan mengklon sebuah gen
(mis. gen yang mengode adenosin deaminase) ke dalam suatu
vektor yang akan mudah diserap dan bergabung ke dalam
genom sel pejamu. Sel prekursor sumsum tulang kini diteliti
untuk tujuan ini karena sel-sel ini ternyata akan menetap di
43O / BAGIAN lV: STRUKTUR, FUNGSI, & REPLIKASIMAKROMOLEKUL PEMBAWA INFORMASI

DNA intak. U'

''
Fragmen a.
I ', ,_
1
t-
Probe
awal

Gambar 39-ll.Teknik chromo somewalking. Cen X akan diisolasi dari sebuah potongan besar DNA. Lokasi
pasti gen ini tidak diketahui, tetapi terdapatsebuah probe (pelacak) (*-) yang diarahkan ke suatu fragmen
bNn*(dulr* gambar ini diperlihatkan di ujung 5'), demikian juga perpustakaan klon yang mengandung
rangkaian-ranlkaian fragmen sisipan D NA yang bertumpang tindih. Untuk tampak, hanya lima fragma yang
diperlihatkan fadu gumbur ini. Pelacak hanya akan melakukan hibridisasi dengan klon yang mengandung
-l
fragmen yang keriudian dapat diisolasi dan digunakan untuk melacak fragmen 2. Prosedur ini diulang
saripai fragmen 4 berhibriclisasi dengan fragmen 5, yang mengandung sekuens lengkap gen X.

sumsum tulang dan berproiiferasi di tempat tersebut. Gen
yang dimasukkan akan mulai mengarahkan ekspresi protein
produknya, dan hal ini akan mengoreksi defisiensi produk
gen tersebut pada sel pejamu.
K. HEWAN TRANSGENIK
T.t"p,"tlthg*t.lto*@
akan diwariskan ke keturunan. Strategi lain untuk mengubah
turunan sel germinativum pernah dirancang, tetapi baru
dicoba pada hewan elaperimental. Sejumlah tertentu gen-gen
yang disuntikkan ke dalam ovum mencit yang telah dibuahi
akan bergabung ke dalam genom dan ditemukan baik di
dalam sel somatik maupun sel germinativum. Ratusan hewan
transgenik telah diciptakan, dan hewan-hewan ini bermanfaat
untuk analisis efek spesifik-jaringan pada ekspresi gen dan eGk
mengontrol tempat gen tersebut menetaP. Pendekatan
pelengkap lain-dan jauh lebih sulit-adalah pengeluaran
selektif sebuah gen dari genom. Hewan dengan knochout gen
(biasanya mencit) dihasilkan dengan menciptakan suatu mutasi
yang merusak total fungsi sebuah gen. Mutasi ini kemudian
digunakan untuk mengganti satu atau dua gen dalam sel tunas
embrionik yang dapat digunakan untuk menghasilkan hewan
transgenik heterozigot. Perkawinan antara dua hewan jenis
ini berdasarkan hukum genetika Mendel akan, menghasilkan
mutasi homozigot pada 25o/o anak. Glah diciptakan beberapa
ratus galur mencit dengan knockout gen-gen tertentu. Teknik
untuk merusak gen di sel, jaringan, atau organ spesifik telah
dilakukan dan disebut knockout terkondisi atau terarah. Hal
ini dapat dilakukan dengan memanfaatkan kombinasi tenentu
moto r-Pen Stj€.t (? ro m o t e r- e n h an c er) y angmendorongeksp res i
p ro

pembentukan berlebihan produk gen (mis. produk dari gen
hormon pertumbuhan atau onkogen) dan dalam menemukan
gen yang berperan dalam perkembangan-suatu proses yang
sebelumnya sulit diteliti. Pendekatan transgenik baru-baru
ini digunakan untuk memperbaiki suatu defisiensi genetik
pada mencit. Ovum yang telah dibuahi yang diperoleh dari
mencit dengan hipogonadisme genetik disuntik dengan DNA
yang mengandung sekuens pengode untuk protein prekursor
gonadatroPin-releasing hormoze (GnRH) . Gen ini dieirspresikan
dan diatur secara normal di dalam hipotalamus sejumlah
mencit yang dihasilkan, dan hewan-hewan ini tetap normal
dalam segala aspek. Keturunan hewan-hewan ini juga tidak
memperlihatkan tanda-tanda defisiensi GnRH. Oleh karena
itu, hal ini merupakan bukti ekspresi transgen di dalam sel
somatik dan keberlangsungannya di dalam sel germinativum'
Disrupsi otqu Knockouf Gen Torget
Pada hewan transgenik, penzLrnbahan satu atau lebih salinan
suatu gen ke genom dilakukan, dan tidak ada cara untuk
DNA rekombinase atau SiRNA, yang keduanya menyebabkan
inaktivasi ekspresi gen. Metode ini sangat bermanfaat dalam
kasus-kasus dengan ablasi gen selama tahap perkembangan awal
yang menyebabkan letalitas pada mudigah'
Tronskrip RNA & Penentuon Profil Profein
Revolusi "-omik' dalam beberapa tahun terakhir telah
memuncak dengan diketahuinya sekuens nukleotida
genom keseluruhan, termasuk genom daiam pertunasan
J"n p.me."han sel ragi, berbagai bakteri, Ialat buah,
cacing Caenorhabditis elegans, mencit, dan terutama
-".rr;ri".Semakin banyak genom lain yang berhasil
diketahui sekuensnya dengan caru yang semakin cepat'
Ketersediaan semua informasi sekuens DNA ini disertai
kemajuan dalam bidang rekayasa genetik mendorong
dikembangkannya beberapa metodologi revolusioner yang
kebanyakan didasarkan pada high-density microartay
technologjr. Sekarang kita memiliki kemampuan untuk
mengendapkan ribuan sekuens DNA yang dapat diuraikan,
 BAB 39: GENETIKA MOLEKULAR, DNA REKOMBINAN. & TEKNOLOGI GENOMIK / 431

dikenal, dan spesifik (kini biasanya berupa oligonukleotida
sintetik) pada sebuah "kaca obyek mikroskop" dengan luas
beberapa sentimeter persegi. Dengan menggabungkan
miroarray DNA semacam ini dengan deteksi pelacak asam
nukleat berlabel fluoresen yang sangat sensirif dan berasal
dari mRNA, para peneliti dapat menghasilkan profii
ekspresi genetik (mis. kandungan mRNA sel spesifik)
dengan cepat dan akurat dari contoh sel dan jaringan
sebanyak I gram atau kurang dari I gram. Oleh karena itu,
informasi transkriptom (keseluruhan kumpulan mRNA
sel) untuk sel atau jaringan tersebut dapat cepat diperoleh
dalam waktu hanya beberapa hari. Informasi transkriptom
memungkinkan kira memperkirakan kumpulan protein
yang mungkin diekspresikan di dalam sel, jaringan, atau
organ tertentu dalam keadaan normal dan sakit berdasarkan
mRNA yang terdapat di sei-sel tersebut. Pemerikasaan
yang melengkapi metode penenruan profil transkrip yang
high+hroughput ini adalah spektrometri massa sampel
protein komplelis dengan sensitivitas dan throughput
yang tinggi. Metode-metode spektrometri massa yang
Iebih baru memungkinkan kita mengidentifikasi ratusan
hingga ribuan protein dalam protein yang diekstraksi dari
sel dalam jumlah terbatas (<1 gram). Informasi penring ini
memberi tahu peneliti mana dari sekian banyak mRNA yang
terdeteksi dalam penelitian pemetaan microarray transkrip
yang benar-benar ditranslasikan menjadi protein, yang
umumnya menjadi penentu utama fenotipe. Cara-cara baru
dalam bidang genetika untuk mengidentifikasi interaksi
antarprotein dan fungsi protein juga telah dikembangkan.
Penghentian ekspresi gen di seluruh genom secara sistemaris,
dengan menggunakan SiRNA atar genetic interaction screen
letal sintetik, telah diterapkan untuk menilai kontribusi
masing-masing gen terhadap berbagai proses dalam sistem
model (ragi, cacing, lalat) dan sel mamalia (manusia dan
mencit). Pemetaan jaringan spesifik interaksi antarprotein
yang mencakup genom keseluruhan telah dilakukan dengan
menggunakan varian-varian high+hroughput dan dua tes
interaksi hibrid (Gambar 39-12). Metode yang sederhana

..PREY'' e
fusion
protein

Gambar 39-12. Skema dua sistem hibrid untuk mengidentifikasi dan menentukan karakterisasi interaksi antarprotein. Dalam skema ini,
diperlihatkan berbagai komponen dasar dan operasi dua sistem hibrid yang awalnya dirancang oleh Fields and Song INature 340:245-246
(i989)l sehingga berguna dalam sistem ragi Bakers. (1) Cen reporter, suatu penanda selektif fse/ectable markerl (misalnya, sebuah gen
yang menyebabkan pertumbuhan prototrofik, atau menghasilkan enzim untuk penilaian kalorimetrik koloni, seperti, p-galaktosidase) yang
hanya diekspresikan saat faktor transkripsi mengikat ujung bagian awal lupstreaml pada penguat terkait crs Lcis-linked enhancerl (bagian
yang berwarna abu-abu gelap). (2) "Bait" fusion protein (DBD-X) terbentuk karena sebuah gen kimer/ gabungan mengekspresikan DNA
modular yang mengikat domain (DBD yang sering diperoleh dari protein Ca 14 ragi atau protein Lex A bakteri, keduanya merupakan DNA
pengikat protein dengan afinitas dan spesifisitas yang tinggi) digabungkan dalam suatu rangkaian untuk kepentingan protein, dalam skema
ini digambarkan dengan X. Pada dua percobaan hibrid, kita menguji apakah setiap protein dapat berinteraksi dengan protein X atau tidak.
ProteinXpredatordapatdigabungkanseluruhnya ataukemungkinanlainseringhanyabagianproteinXyangdiekspresikarrdalamrangkaian
dengan DBD. (3) Protein "predator" (Y-AD) yang mewakili penggabungan protein spesifik X yang disatukan dalam rangkaian dengan domain
aktivasi transkripsi (AD yang sering berasal dari protein virus Herpes Simpleks VP 16 maupun protein Ca 14 ragi). Sistem ini merupakan
tes yang bermanfaat pada interaksi berbagai protein, antara protein X dan Y karena pada ketiadaan transaktivator yang mengikat penguat
tertentu, tidak terjadi transkripsi gen reporter. OIeh karena itu, kita mengamati transkripsi hanya jika terjadi interaksi protein X-protein Y
terjadi sehingga menghasilkan AD fungsional ke unit transkripsi terkait c6, yang pada kasus ini mengaktifkan transkripsi gen reporter. Pada
keadaan ini, protein DBD-X itu sendiri, tidak dapat mengaktifkan transkripsi reporter karena domain-X yang disatukan dengan DBD tidak
mengandung suatu AD. Demikian juga, protein Y-AD itu sendiri tidak akan dapat mengaktifkan transkripsi gen reporter karena protein
tersebut kekurangan DBD untuk membuat protein Y-AD mencapai penguat. Hanya jika kedua protein tersebut diekspresikan dalam suatu sel
serta mengikat penguat, dan membentuk kembali "protein biner (binary protein)" transaktivator fungsional melalui interaksi protein-protein
DBD-X-Y-AD, aktivasi transkripsi gen reporterdan sintesis mRNAdapatterjadi (garisabu-abu dari AD kegen reporter).
492 / BAGIAN lV: STRUKTUR, FUNGSI, & REPLIKASIMAKROMOLEKUL PEMBAWA INFORMASI
namun ampuh ini dapat diterapkan pada sel bakteri, ragi,
atau metazoa, dan memungkinkan kita mendeteksi interaksi
antarprotein spesifik di dalam se1 hidup. Eksperimen
rekonstruksi menunjukkan bahwa interaksi antarprotein
dengan afinitas Ko - 1 pM atau lebih ketat dapat secara
mudah dideteksi dengan metode ini. Bersama-sama,
teknologi-teknologi ini merupakan alat yang sangat hebat
untuk menguraikan kerumitan biologi manusia.
Teknik-teknik microarray, hibrid dua high-throughput,
penghentian (knockdown) genetik, dan eksperimen identi-
fikasi protein dengan spektrometri massa telah menghasilkan
data dalam jumlah yang sangat besar. Selama ini, penangan-
an data dan interpretasi informasi yang sangat banyak dida-
patkan dari studi-studi yang mengandalkan metode statis-
tik; dan teknologi baru ini, bersama dengan membanjirnya
informasi sekuens DNA, mendorong dikembangkannya
bidang bioinformatika dan biologi sistem, disiplin baru
yang tujuannya adaiah membantu menangani, menganalisis,
dan mengintegrasikan "limpahan' informasi biologi yang
penting ini. Di masa mendatang, studi-studi yang melibat-
kan bioinformatika, penentuan profil protein transkrip, dan
biologi sistem akan menghasilkan revolusi pemahaman kita
tentang fisiologi dan ilmu kedokteran.
RINGKASAN
. Kini telah dapat diterapkan berbagai teknik yang sangat
sensitif untuk mengisolasi dan mengetahui karakteristik
gen serta mengukur kuantitas produk gen.
Dalam pengklonan DNA, segmen tertentu DNA
'
dikeluarkan dari lingkungan normalnya dengan PCR
atau salah satu dari berbagai endonuklease restriksi.
Segmen ini kemudian diligasikan ke dalam suatu vektor
tempat segmen DNA tersebut dapat diperbanyak dan
diproduksi dalam jumlah besar.
. DNA yang telah diklon dapat digunakan sebagai pelacak
(probe) di salah satu dari berbagai jenis reaksi hibridisasi
untuk mendeteksi potongan DNA terkait atau terdekat
lain, atau dapat digunakan untuk menghitung produk
gen, seperti mRNA.
. Manipulasi DNA untuk mengubah strukturnya
sehingga disebut sebagai rekayasa genetik adalah
elemen kunci dalam pengklonan (mis. pembuatan
molekul kimer [gabungan]) dan juga dapat digunakan
untuk mempelajari fungsi fragmen tertentu DNA dan
menganalisis cara gen-gen tersebut diatur'
. Molekul DNA kimer dimasukkan ke dalam sel untuk
menghasilkan transfeksi sel atau ke dalam oosit yang
telah dibuahi untuk menghasilkan hewan transgenik.
. Teknik-teknikyangmenggunakanDNAklondigunakan
untukmengetahui lokasi gen di regio tertentu kromosom,
untuk mengidentifikasi gen penyebab penyakit, untuk
meneliti mekanisme gangguan regulasi gen dalam
menyebabkan penyakit, untuk mendiagnosis penyakit
genetik, dan semakin sering untuk mengobati penyakit
genetik.
DAFTAR ISTILAH
.!rRS: Autonomously replicating sequence (sekuens yang
bereplikasi secara otonom); origin of replication
(awal replikasi) pada sel ragi.
Autoradiografi: Deteksi molekul radioaktif (mis. DNA,
RNA, protein) melalui visualisasi efek molekul
tersebut pada film fotografik.
Bakteriofaga: Virus yang menginfeksi bakteri.
Blunt-endedrNl (DNA berujung tumpul): Dua untai
dari suatu dupleks DNA dengan ujung-ujung yang
sama rata.
cDNA Molekul DNA untai-tunggal yang komplementer
terhadap suatu molekul mRNA dan disintesis
dari molekul mRNA tersebut oleh keria reuerse
transniptase.
DNA berujung lekat ('stichy-ended DNA)t Untai-untai
tunggal komplementer pada DNA yang menonjol
dari ujung-ujung berlawanan DNA dupleks atau
dari ujung-ujung molekul dupleks yang berbeda
(lihat juga Blunt-ended DNA' sebelumnya).
DNA rekombinan: DNA yang mengalami perubahan
karena penyisipan suatu sekuens deoksinukleotida
yang sebeiumnya tidak terdapat dalam molekul DNA
yang sudah ada dengan cara enzimatik atau kimiawi'
Endonuklease: Enzim yang memecah ikatan internal di
dalam DNA atau RNA.
Elsinuklease Nuklease elaisi yang berperan dalam
perbaikan DNA dengan cara pertukaran nukleotida'
Elrson: Sekuens sebuah gen y^ng diwakilkan (diekspre-
sikan) sebagai mRNA.
Elsonuklease: Suatu enzim yang memecah nukleotida
dari ujung 3' arau 5' DNA atau RNA.
Enzim restrilisi: Suatu endodeoksinuklease yang me-
nyebabkan pemutusan kedua untai DNA di tem-
pat-tempat yang sangat spesifik, yang ditentukan
oleh sekuens basa.
Fingerprinting: Pemakaian RFLP atau sekuens berulang
DNA untuk membuat suatu Pola tersendiri
fragmen DNA untuk masing-masing orang'
Footprinting: DNA dengan protein yang terikat
padanya akan resisten terhadap pencernaan oleh
enzim DNase. Jika reaksi sequencing dilakrtkan
dengan menggunakan DNA ini, akan terdeteksi
suatu daerah terlindung yang mencerminkan jejak
(fo o tprint) protein tersebut.
 BAB 39: GENETIKA MOLEKULAR, DNA REKOMBINAN, & TEKNOLOGI GENOMIK
Hairpin (jepit rambut): Rangkaian heliks ganda yang
dibentuk oleh pasangan basa anrara sekuens-
' sekuens komplementer yang berdekatan di dalam
untai tunggal RNA atau DNA.
Hibridisasi: Penyatuan kembali secara spesifik untai-untai
asam nukleat yang komplementer (DNA dengan
DNA, DNA dengan RNA, atau RNA dengan
RNA).
Insert (sisipan): Thmbahan panjang pasangan basa di
dalam DNA, yang umumnya dimasukkan dengan
teknologi DNA rekombinan.
Intron: Sekuens suatu gen yang ditranskripsikan, tetapi
kemudian dieksisi sebelum ditranslasikan.
Klon: Sejumlah besar organisme, sel, atau molekul yang
identik dengan satu organisme, sel, atau molekul
induk.
Kosmid: Suatu plasmid tempat disisipkannya sekuens
DNAdari bakteriofaga lamdayang diperlukan untuk
mengemas DNA (cas sitel; hal ini memungkinkan
DNA plasmid dikemas secara in vitro.
Ligasi: Penyatuan dua rangkaian DNA atau RNA men-
jadi satu melalui ikatan fosfodiester yang dikatalisis
oleh enzim; enzim tersebut masing-masing adalah
DNA dan RNA ligase.
Lines: Long inters?ersed repeat sequences.
miRNA: MikroRNA, spesies RNA dengan panjang
2l-25 ntUeotida yang berasal dari unit transkripsi
RNA polimerase II, panjang 500-1500 pb melalui
pengolahan RNA. RNA tersebut, yang ditemukan
baru-baru ini, diperkirakan berperan penting
dalam regulasi gen.
Molekul kimer: Suatu molekul (mis. DNA, RNA,
protein) yang mengandung sekuens-sekuens yang
berasal dari dua spesies yang berbeda.
Northern blot: Metode untuk memindahkan RNA
dari gel agarosa ke filter nitroselulosa, yang dapat
mendeteksi RNA dengan pelacak yang tepar.
Oligonukleotide Sekuens nuldeotida tertenru yang
pendek dan disatukan oleh ikatan fosfodiester biasa.
Ori: Origin ofreplication (asal/pangkal replikasi) DNA.
PAC: Vektor pengklon berkapasitas tinggi (70-95 kb)
yang didasarkan pada bakteriofaga E. colilitrkPl
yang bereplikasi di dalam bakteri sebagai suatu
elemen ekstrakromosom.
Palindrom: Sekuens DNA dupleks yang sama jika
kedua untai dibaca dalam arah berlawanan.
Perpustakaan (library): Kumpulan fragmen-
fragmen klon yang mewakili keseluruhan genom.
Perpustakaan dapat berupa DNA genomik (yang
di dalamnya terdapat intron maupun ekson) atau
cDNA (yang hanya mewakili ekson).
/ 433
Plasmid: Molekul DNA yang kecil, sirkular dan
ekstrakromosomal yang bereplikasi tanpa
bergantung pada DNA pejamu.
Polimorfisme mikrosatelit: Heterozigositas suatu
pengulangan mikrosatelit tertentu pada seseorang.
Poljrmerase chain reactioz (PCR Reaksi berantai
polimerase): Metode enzimatik untuk mengode
secara berulang (sehingga memperbanyak) kedua
untai DNA yang membentuk sekuens gen tertentu.
Primosom: Kompleks helikase dan primase yang dapat
bergerak dan berperan dalam replikasi DNA.
Probe (pelacak): Molekul yang digunakan untuk
mendeteksi keberadaan suatu fragmen tertentu
DNA atau RNA, contohnya koloni bakteri
yang dibentuk dari perpustakaan genetik atau
sewaktu analisis oleh teknik tr/tnsfer blot, pelacak
yang sering digunakan adalah molekul cDNA,
oligodeoksinukleotida sintetik dengan sekuens
tertentu, atau antibodi terhadap protein spesifik.
Proteom: Keseluruhan kumpulan protein yang
diekspresikan di dalam suatu organisme.
Pseudogen: Segmen DNA tak-aktif yang muncul
melalui mutasi gen induk yang aktif.
Reaerse transcrip tion (transkripsi terbalik) : Sintesis
DNA yang diarahkan oleh RNA yang dikatalisis
oleh reu ers e ilans crip tas e.
RT-PCR: Metode yang digunakan untuk menghitung
kadar mRNA dengan mengandalkan langkah per-
tama pengkodean cDNA pada mRNA yang di-
katalisis oleh reuerse transcriptrtse sebelum amplifi-
kasi dan kuantitasi oleh PCR.
Sekuens berulang mikrosatelit: Sekuens berulang yang
tersebar atau berkelompok dengan panjang 2*5 pb
dan diulang hingga 50 kali. Dapat ditemukan di
50-100 ribu lokasi di dalam genom.
Sines: S/orr interspersed repeat sequences.
Sinyal: Produk akhir yang diamati ketika sekuens ter-
tentu DNA atau RNA terdeteksi dengan autora-
diografi atau metode lain yang serupa. Hibridisasi
dengan polinukleotida radioaktif komplementer
(mis. dengan Sa utltern ara:u Northern blorting) sering
digunakan untuk menghasilkan sinyal.
SiRNA: Silencing RA/,4, dengan panjang 2l-25 nt dan
dibentuk oleh degradasi nukleolitik selektif RNA
untai-ganda yang berasal dari sel atau virus. SiRNA
yang terikat kuat dengan berbagai tempat spesifik
pada target di dalam RNA yang menyebabkan
degradasi mRNA ("gen knockdown" ).
SNP: Single nucleotide polymorphism (polimorfisme
nukleotida tunggal). Merujuk pada fakta bahwa
variasi genetik nukleotida tunggal di sekuens
434 / BAGIAN IV: STRUKTUR, FUNGSI, & REPLIKASIMAKROMOLEKUL PEMBAWA INFORMASI
genom terdapat pada lokus-lokus tersendiri di
sepanjang kromosom. Pengukuran perbedaan SNP
alel bermanfaat dalam studi-studi pemetaan gen.
snRNA: Small nuclear RNA (RNA kecil di dalam
nukleus). Famili RNA ini dikenal melalui perannya
dalam pengolahan mRNA.
Soutbern blot:Merode untuk memindahkan DNA dari
gel agarosa ke fiiter nitroselulosa, temPat DNA
dapat dideteksi dengan pelacak yang sesuai (mis.
RNA atau DNA komplementer).
Southuestern blot: Metode untuk mendeteksi interaksi
protein-DNA dengan menggunakan pelacak
DNA berlabel
pada suatu membran transfer yang
mengandung protein renaturasi.
Spliceosome: Kompleks makromolekul yang berperan
dalam splicing mRNA prekursor. Spliceosom terdiri
dari sedikitnya lima RNA nukleus kecil (snRNA;
rJl,lJ2,U4,U5, dan U6) dan banyak protein.
Splicing: Pengeluaran intron dari RNA disertai oleh
penyatuan ekson-eksonnya.
Thndem: Digunakan untuk mendeskripsikan salinan-
salinan dari sekuens yang sama (mis. DNA) yang
dan terletak berderet-deret.
Transferase terminal: Suatu enzim yang menambahkan
nukleotida dari satu tipe (mis. residu deoksiadeno-
nukleotidil) pada ujung 3' untai DNA.
Tiransgenik: Menjelaskan insersi DNA baru ke dalam
sel germinativum dengan menyuntikkan DNA
tersebut ke dalam nukleus ovum.
Transkripsi: Sintesis asam nukleat yang diarahkan oleh
DNA cetakan; biasanya adalah sintesis RNA yang
diarahkan oleh DNA.
Transkriptom: Keseluruhan kumpulan mRNA yang
diekspresikan dalam suatu organisme.
Translasi: Sintesis protein dengan menggunakan mRNA
sebagai cerakan.
Translasi takik (Nich Tianslation)z Suatu teknik
untuk memberi label DNA berdasarkan
kemampuan DNA polimerase dari E. coli unutk
menguraikan satu untai DNA yang telah tertakik
(nichefl dan kemudian menyintesis kembali untai
tersebut; jika suatu nukleosida trifosfat radioaktif
digunakan, untai yang dibentuk kembali tersebut
akan berlabel dan dapat digunakan sebagai pelacak
beradioaktif.
Vektor: Plasmid atau bakteriofaga tempat DNA asing
dapat dimasukkan ke dalamnya untuk tujuan
pengklonan
Western bhx Metode untuk memindahkan protein ke
filter nitroselulosa tempat protein dapat dideteksi
dengan pelacak yang sesuai (mis. antibodi).
REFERENSI
Friedman A, Perrimon N. Genome-wide high-throughput screens
in functional genomics. Curr Opin Gen Dev 2004:14:470.
Lewin B. Genes VII. Oxford Universiry Press, i999.
Martin JB, Gusella JF. Huntingtont disease: pathogenesis and
management. N Engl J Med 1986;375:7267.
SambrookJ, Fritsch EB ManiatisT. Molecular Ckning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Spector DL, Goldman RD, Leinwand LA Cells: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998.
\Watson
JD, et al. Recornbinant DNA, ed ke-2. Scientific American
Books, Freeman, 1992.
\Teatherall DJ. T'he Neu Genetics and Clinical Practice, ed ke-3.
Oxford Universiry Press, 1991.