NAMA : KEZIA WANTAH

NIM : 202032004
DOSEN PENGAJAR : DR. HARIYADI, M, SI

REKAYASA PROTEIN
Protein adalah susunan rantai polimer yang terbentuk dari sintesa asam amino dalam
rangkaian kompleks berbagai jenis ikatan dan struktur sehingga terbentuk jenis protein
yang berbeda satu sama lain. Dalam tubuh manusia protein terbentuk dari sintesa yang
terjadi dalam sel di mulai dari sintesa rantai genda DNA yang terdapat dalam nukleus sel
yang mengalami proses sintesa transkripsi menjadi rantai tunggal RNA dan rantai RNA
tersebut mengalami proses transkripsi dengan adanya ribosom sehingga terbentuk proses
pembentukan rantai ganda dengan proses pembentukan folfing atau lipatan-lipatan lantai
kompeks dalam struktur yang berbeda.
Karakteristik asam amino sangat di perlukan ketika rekayasa protein di gunakan untuk
memulai suatu proyek. Biasanya proyek yang bertujuan melakukan perubahan pada
protein yang telah eksis atau ada, memulai langkah awalnya dengan penentuan asam
amino yang di gunakan untuk menciptakan mutasi. Hal ini sangat penting karena
kontribusi asam amino terhadap fungsi protein merubah sifat dan karakteristik protein,
sehingga pengetahuan atau analisa terhadap karakteristik asam amino harus telah di
pikirkan.

Rekayasa protein adalah aplikasi campuran menarik dari pengetahuan :

 Biologi Molekuler
 Analisis Struktur Kimia Protein
 Matematika
 Ekonomi
 Komputasi atau Bio Informatika
 Biokimia

Tujuan Rekayasa Protein :

 Mengembangkan protein untuk sesuatu yang berguna atau berharga di bidang
indusstri atau kesehatan
 Membentuk produk baru dari suatu campuran protein
  Merubah struktur atau sifat protein sehingga dapat di hasilkan perubahan pada
produk protein dengan target struktur atau sifat yang di inginkan
 Merubah protein sehingga dapat di terjemahkan untuk memberikan informasi dan
aplikasi lain
 Menganalisa sifat protein yang ada untuk aplikasi produk lain
 Meningkatkan kemampuan dan efisiensi penggunaan produk untuk suatu produk

Kegiatan Rekayasa Protein :

 Peningkatan katalisis dengan substrat alami atau kofaktor
 Peningkatan katalisis dengan substratn non natural atau kfaktor
 Peningkatan katalisis di non natural pelarut
 Peningkatan ligan mengikat

Aplikasi Rekayasa Protein :

 Pembuatan enzim
 Memproduksi jenis obat-obatan
 Menghasilkan vaksin antibody tertentu
Beberapa contoh aplikasi langsung secara komersial sebagai berikut :
 Menggunakan perancah/scaffold protein berdasarkan domain pada protein A
untuk mengembangkan molekul-molekul seperti antibody (company : Affibody)
 Menambahkan asam amino yang tidak terkodekan kepada protein,
memungkinkan sintesa protein dengan diversity bahan kimia

Sifat-Sifat lain :
 Menambahkan tag untuk memfasilitasi pemurnian
 Mengubah kecenderungan untuk polimerasi
 Menambahkan tag untuk memvisualisasikan lokalisasi
 Merekayasa mengikat situs alostretik
 Mengubah titik isoelektrik

NMR (SPEKTROKOPI RESONANSI MAGNET)

NMR adalah pengetahuan struktur biologi, yang di aplikasikan oleh NMR untuk
menginvestigasi jenis protein, protein NMR dilakukan pada sampel air dari protein yang
sangat murni. Sampel terdiri dari antara 300 dan 600 microliteers dengan kosentrasi
protein dalam rentang 0, 1-3 milimol. Sumber protein dapat berupa alam atau dihasilkan
dalam sistem ekspresi menggunakan teknik DNA rekombinan melalui rekayasa genetik.
Panah biru mewakili orientasi N – H ikatan peptida obligasi yang di pilih dengan
menentukan orientasi yang cukup obligasi relatif terhadap medan magnet luar, struktur
protein dapat di tentukan.
Nuklir penentuan struktur magnetik resonansi menghasilkan sebuah emsemble struktur,
struktur hanya akan bertemu jika data yang cukup untuk mendikte lipatan tertentu. Dalam
struktur ini hanya kasus untuk menjadi bagian dari struktur dari PDB.
KETERBATASAN
Strategi desain de novo ini memiliki beberapa limitasi atau problem seperti :
 Ketersediaan data struktur protein 3 demensi yang terbatas
 Pengetahuan yang terbatas terhadap ilmu ikatan protein, struktur terhadap fungsi
biologis protein tersebut.

STRATEGIS DESAIN RASIONAL STRUKTUR DAN FUNGSI PROTEIN

Studi modern resolusi yang lebih tinggi ini adalah metode eksperimental untuk dapat
memicu lipatan sampel unfolded protein, dan mengamati dinamika yang dihasilkan.
Teknik cepat digunakan secara luas termasuk neutron hamburan, ultrafast, pencampuran
solusi, fitokimia metode, dan spektroskopi laser suhu melompat.
Teknik intio de novo (memprediksi struktur protein berhubungan dengan komputasi)
sangat berbeda dengan metode lipatan dinamika molekul protein.
MD merupakan perangkat penting mempelajari pelipatan protein dan dinamika di slico.
Karena biaya komputasi, simulasi MD lipat dengan air eksplisit hanya terbatas pada
peptida dan protein yang sangat kecil. MD simulasi protein yang lebih besar tetap
terbatas pada dinamika struktur eksperimental atau berlangsung pada temperatur tinggi.
Untuk mensimulasikan proses lipatan yang lama (diluar sekitar 1 mikrodetik) seperti
protein lipat ukuran kecil (sekitar 50 residu) atau lebih besar, beberapa pendekatan atau
penyerderhanaan dalam model protein perlu di perkenalkan.

SPEKTROMETRI CIRCULAR DICHROISM (CD)

Alat ini di perlukan dalam melakukan pengukuran struktur sekunder protein dengan
menggunakan teknologi standart dalam mengukur aktivitas optikal protein, yaitu
mengukur perbedaan absorbandi pada struktur sirkular bagian kanan dan kiri struktur
protein melalui polasrica cahaya dari sampel protein.
Ketebalan satndar Far-UV atau daerah amide adalah 170 – 250 nm untuk ikatan peptida
dan daerah near UV adalah 250 – 300 nm untuk aromatik asam amino.
Eksperimen teknik penentuan struktur protein, di lipat struktur protein secara rutin di
tentukan oleh kristalogafi sinar – X dan NMR, memahami dichroism melingkar. Dasar -
dasar polarisasi untuk benar memahami dichroism lingkaran, yang pertama harus
memahami dasar-dasar polarisasi. Terpolarisasi linier cahaya adalah cahaya yang osilasi
terbatas unntuk pesawat tunggal, semua negara terpolalisasi cahaya dapat di gambarka
sebagai jumlah dari linear terpolisasi tegak lurus satu sama lain, biasanya di rujuk ke
penampil sebagai vertikal dan harizontal terpolalisasi cahaya.
Kalau misalnya kita ambil harizontal dan vertikal terpolarisasi ampitudo gelombang
cahaya yang sama di fase satu sama lain, gelombang cahaya yang di hasilkan (biru)
adalah linear terpolarisasi pada 45 derajat.

TEKNIK DESAIN RASIONAL PROTEIN DENGAN PENDEKATAN

MUTAGENESIS SITE DIRECTED
Teknik mutasi site dirakted meniru mutasi alam yang terjadi pada gen organisme hidup
dengan merubah residu asam amino tunggal melalui teknik mutasi kodon yang
mengkodekan asam amino. Teknik ini adalah metode terlama yang di gunakan pertama
kali dalam rekayasa protein. Dengan sintesa oligonukleotida yang dimasukan kedalam
suatu plasmid. Metode pertama dari site directed mutageneis dikembangkan dengan
metode signe primer, oleh Giliam et,al 1980. Seperti yang di deskripsikan pada metode
alam yang melibatkan sintesa in vitro DNA dengan sintesa kimia oligunokleotida (7
hingga 20 rantai panjang nukleotida) yang membawah base yang sesuai dengan susunan
yang di lengkapinya. Metode ini membutuhkan DNA yang tersedia dalam bentuk rantai
tunggal untuk di mutasi, dan di kloning dengan vekto gene M13 untuk
mempermudahnya.
Sintesa primer DNA bersintesa dengan oligonukleotida dimasukkan ke dalam molekul
heteroduplex dihasilkan. Setelah transformasi dari host E. coli, heteroduplex ini
menimbulkan homoduplexes yang urutannya berasal dari wild-tipe DNA atau yang
mengandung dasar bermutasi. Frekuensi mutasi klon yang muncul lebih rendah
dibandingkan dengan klon wild type. Pengambilan mutan, dilakukan dengan
penyaringan hibridisasi asam nuklead dan probe nya yang dilabel dengan 32P-label
oligonukleotida.
Parameter yang berperan termasuk diantaranya suhu dan konsentrasi kation yang didapat
sebagai sinyal positif dari Mutasi Klon. Hal ini memungkinkan kesiapan untuk
mendeteksi mutan yang diinginakna (Wallace et. 1981, Traboni et al. 1983).
Sangat dianjurkan untuk memeriksa urutan mutan secara langsung dengan menggunakan
metode sekuensing DNA, untuk memastikan bahwa prosedur tidak melakukan perubahan
adventif lainnya. Ha Ini sangat dibutukan pada versi pertama teknik yang menggunakan
DNA polimerasi E-Coli.
Beberapa contoh PCR yang dapat untuk Rekayasa Protein diantaranya :
-PCR – Media Mutagenesis
Mutagenesis Oligonukleotida mismatch dapat menciptakan titik mutasi yang diinginkan
pada daerah yang telah ditentukan sebelumnya (site pre-determined) dengan molekul
DNA klone. Salah satu dari berbagai metode mutagenesisi adalah sel-base
oligonukleotida mismatch (untuk alternative PCR-base site directed mutagenesis).
Penggunaan mutagenetik oligonukleotide secara langsung pada nukleotida tunggal yang
disubstitusi pada gene.
Gene dikloning pada M13 untuk menciptakan rekombinasi DNA rantai tunggal.
Primer oligonukleotida dirancang untuk melengkapi secara berurutan bagian dari susunan
gen yang meliputi nukleotida yang akan dimutasi (A) dan mengandung base non-
komplementari yang diinginkan pada posisinya (C).
Meskipun berupa internal mismatch, annealing dari primer mutagenic dapat dilakukan ,
dan sintesa rantai kedua dapat diperpanjang dengan polimerasi DNA serta celah/gap
ditutup dengan DNA ligase.
Hasil heteroduplek dapat ditransformasikan ke dalam E-coli, dimana dua populasi
rekombina dapat dikembalikan menjadi wilde type dan mutant homoduplek, yang
kemudian dapat diidentifikasikan dengan hibridisasi molecular (dengan menggunakan
primer mutagenic sebagai probe oligonuklotida alel spesifik).

PCR Mutagenesis
A. Mutagenesis ujung 5‘
Primer dimodifikasi pada ujung 5‘ untuk memulai proses, sebagai contoh, Group yang
telah dilabelkan, susunannya mengandung site restriksi yang sesuai, atau promoter phage
untuk menggerakkan ekspresi gen.
(B) Mutagenesis Site – Spesifik
Mutagenesis menunjukkan dapat menghasilkan produk amplifikasi dengan
menglokasikan mutasi pre-determinasi yang spesifik pada segmen central. Reaksi PCR A
dan B dihadapkan pada segmen overlapping yang diamplifikasi pada DNA yang
mengandung mutasi yang telah dimasukkan (dengan mempertimbangkan mismatching
base menggunakan primer mutant – 1M atau 2M). Setelah dua produk dikombinasikan,
denaturasi dan reanneal dilakukan, polimerasi DNA dapat memperpanjang ujung 3‘
heteroduplek dengan ujung 3‘ yang tersembunyi. Kemudian, produk panjang penuh
dengan mutasi yang dimasukkan pada segmen central dapat diamplifikasi dengan
menggunakan hanya primer outer 1 dan 2.
- PCR Base Tunggal Mismatched
Pada awal pengembangan metode PCR, amplifikasi DNA menunjukkan bahwa teknik
Base tunggal mismatched sangat potensial untuk diaplikasikan pada mutagenesis (Schart
et al. 1986).
Single base mismatched antara amplifikasi primer dan template dikorporasikan pada
susunan template sebagai hasil amplifikasi.
Hituchi et al. (1988) menerangkan bahwa variasi metode dasar memungkinkan mutasi
pada produksi fragmen DNA dengan PCR.
Dua primer reaksi PCR memproduksi reaksi dengan melakukan tumpang tindih atau
overlapping dua fragmen DNA, yang semuanya menampung mutasi yang sama pada
daerah overlapnya.
Susunan yang overlap memungkinkan terbentukanya fragmen menjadi hibridisasi. Salah
satu dari dua hybrid diperpanjang dengan DNA pllimerase untuk memproduksi fragmen
dupleks. Hibrid satunya memiliki recessed ujung 5’ dank arena bukan sebagai substrate
untuk polimerasi, maka akan secara efektif hilang dari percampuran reaksi. Seperti pada
mutageneisi konvernsional perpanjangan primer, dan mutasi penghilangan dan atau
penambahan daerah asam amino dapat juga diciptakan.
Langkah yang ditunjukkan pada bagian kiri atas ujung diagram menunjukkan metode
basic PCR mutagenesis. Setengah bagian ke bawah menunjukkan bagaimana mutasi
dapat dipindakan pada molekul DNA bagian tengh. Primer ditunjukkan dengan huruf
tebal dan primer A dan A’ saling melengkapi.
Metode Higuchi (1988) sedikit rumit karena membutuhkan empat primer dan 3 PCRs
(sepasang PCRs untuk amplifikasi segmen overlapping dan tiga PCR untuk
menggabungkan dua segmen).

Metode ini menargetkan DNA yang dimetilasi in vitro sebelum langkah mutagenesis dan
overlapping primer digunakan.
Linier amplifikan yang diproduksi, membawa mutasi yang diinginkan tetapi saat
ditransformasikan langsung pada E-coli, Sel Host memperbaiki sirkulasi enzim mutasi
DNA linear, sementara Endonuklease McrBC menguraikan Metilat-tempate DNA,
meninggalkan hanya un-metilat sebagai produk mutasi.

PCR - Hot Star

Teknik yang mengubah cara pencampuran PCR dengan pemanasan awal. Polimerase
diaktifkan, tapi target belum mengalami didenaturasi dan Primer dapat mengikat ke lokasi
non-spesifik (atau bahkan satu sama lainnya). Teknik dilakukan manual dengan
memanaskan komponen reaksi pada suhu pencairan (mis. 95 ° C) sebelum menambahkan
polimerase . Atau, sistem yang menghambat aktivitas polimerase yang pada suhu
lingkungan, baik oleh pengikatan suatu antibodi, atau dengan adanya inhibitor yang
terikat kovalen yang hanya terdisosiasi setelah langkah aktivasi temperatur tinggi. Hot-
start/cold- finish PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang tidak aktif pada suhu
lingkungan dan hanya diaktifkan pada temperatur tinggi.
STRATEGI DESAIN MUTAGENESIS ACAK/RANDOM
MUTAGENESIS
Hasil percobaan teknik kadangkala memberikan perubahan yang diinginkan dengan
adanya mutasi yang tidak diperkirakan.
Dalam teknik ini tidak diperlukan pengetahuan tentang struktur atau susunan protein,
ataupun mekanisme protein, melainkan penerapan pengetahuan dalam :
- Random mutagenesis
Digunakan untuk menciptakan perbedaan genetik
- Seleksi atau Screening/Penyaringan
Digunakan untuk memilih varian yang memiliki kualitas yang diinginkan
Prinsip dasar yang mendasari desain strategi ini adalah untuk memvariasikan asam amino
secara random atau acak pada susunan polipeptida untuk mendapatkan kombinasi
kombinasi baru dan kemudian menyeleksi produk produk gen baru (protein) .
Contoh mutagenesisi acak/random yang digunakan dalam rekayasa protein adalah
Evolusi yang diarahkan (Directed evolusi).
Tahapan dalam Random Mutasi adalah :
1. Memilih Gene
2. Menciptakan librari/pustaka dari varian varian
3. Memasukkan pustaka gen kepada vector yang diekspresikan
4. Memasukkan pustaka gen atau vector ke bakteri, yang memproduksi varian
varian enzim dari satu sel atau satu sususnan
5. Menyaring koloni koloni untuk sifat sifat yang diinginkan
6. Mengisolasi gen gen yang akan dikembangkan dan mengulangi proses
EVOLUSI YANG DIARAHKAN/DIRECTED EVOLUSI
Untuk memahami evolusi diarahkan, maka diperlukan pemahaman tentang evolusi.
Seleksi alam, bersama dengan kombinasi gen-protein, ber interaksi, mendorong evolusi.
Dalam evolusi, fungsi enzim tertentu dan sifat enzim berubah, menyempurnakan dan
disesuaikan dengan organisme lingkungan. Perubahan ini tidak bekerja dalam arah
tertentu atau terhadap apapun tujuan yang tepat, tetapi terjadi secara spontan pada bentuk
yang sangat spesial dalam menanggapi reproduksi spesifk dan persyaratan hidup. Kita
tahu ini, tapi kita tidak tahu bagaimana tepatnya interaksi proses bekerja. Juga hal apa
yang bekerja dengan baik dalam lingkungan selular tidak efektif dalam lingkungan
nonnatural untuk beberapa alasan, seperti substrate yang tdk dpt melarut, produk yang
tidak stabil atau reaksi kimia tambahan.. Sehingga enzim alam yang digunakan dalam
pertanian, kedokteran dan industri aplikasi mungkin tidak selalu memberikan hasil yang
dapat diandalkan. Apa yang dibutuhkan adalah enzim-enzim yang stabil yang dapat tetap
aktif dalam jangka periode waktu yang lama pada lingkungan non- selular dan yang
dapat bekerja dengan berbagai substrat. Di sinilah evolusi yang diarahkan dapat
diaplikasikan. Evolusi yang diarahkan merupakan proses yang dikendalikan dalam
biologi sintetis yang digunakan untuk merekaya protein atau RNA dengan sifat-sifat
tertentu yang diinginkan yang mungkin atau tidak mungkin terjadi secara alami. Dalam
jenis rekayasa protein ini, ilmuwan bekerja menuju tujuan yang didefinisikan secara pasti
- mungkin sebenarnya ada banyak cara untuk mencapai tujuan pasti, namun peneliti
memilih salah satu yang paling tidak memerlukan upaya - dan memonitor keseluruhan
proses.
Eksperimen Directed Evolution
Eksperimen evolusi yang diarahkan dapat dilakukan pada sel-sel hidup (in vivo) dan juga
tanpa menggunakan sel hidup (in vitro). Salah satu putaran percobaan biasanya
mengambil tiga langkah untuk menyelesaikan dan putaran beberapa percobaan biasanya
diperlukan untuk mendapatkan protein atau RNA dengan ciri-ciri yang diperlukan.
Untuk memulainya, dilakukan langkah mengisolasi gen-gen dengan sifat-sifat spesifik
yang diinginkan dan, dengan menggunakan proses mutagenesis dan / atau rekombinasi,
membuat perpustakaan besar varian gen; semakin besar perpustakaan semakin besar
kesempatan untuk menemukan varian gen dengan sifat-sifat yang dibutuhkan.

METODE NON KOMBINASI DOMAIN SWAPPING

Konstruksi aktual dari desain rasion genes domain – swapped genes dapat diselesaikan
dengan beberapa teknik yaitu :
- Metode Kaset Mutagenesis
Susunan site restriksi mengapit susunan DNA tertentu untuk ditempatkan dan
dihancurkan dengan enzim restriksi dan penggantian susunan dengan memasukkannya di
antara sitesnya (Wells et.al.1985).
- Metode Pemotongan Gene/Splicing dengan PCR perpanjangan overlapping
Molekul DNA direkombinasikan tanpa menggunakan pembatasan endonukelase
(Horton, et.al 1989). Fragemen gen yang akan direkombaniskan dari gen orangtua dapat
dihasilkan dalam reasi PCR.

METODE KASET MUTAGENESIS

Pembatasan situs dapat terjadi secara alami atau artifisial dimulai pada lokasi yang
diinginkan pada gen target dengan oligonukleotida-directed mutagenesis. Pemilihan
pembatasan situs didasarkan pada keunikannya terhadap plasmid dan konservasi asam
amino akhir urutan pengkodean.

METODE PEMOTONGAN GEN DENGAN PCR OVERLAP EXTENSION

Primer untuk reaksi-reaksi ini didesain sehingga ujung produk mengandung urutan
komplementer. Ketika produk PCR ini dicampur, alur memiliki urutan yang sesuai pada
ujung rantai 3 ‘yang tumpang tindih dan bertindak sebagai primer satu sama lain, dan
ekstensi oleh polimerase DNA menghasilkan suatu urutan di mana urutan asli
dihubungkan bersama-sama. Memungkinkan untuk menggabungkan dua fragmen dalam
satu langkah kloning, namun langkah kloning multiple dibutuhkan untuk melakukan
swap domain internal.
Dalam variasi metode, Protokol PCR tiga langkah digunakan untuk pembentukan protein
chimeric, hanya satu langkah kloning dibutuhkan untuk bertukar dari domain internal
(Grandori et al 1997). Metode ini dapat digunakan untuk menggantikan suatu domain
tertentu dalam protein A oleh domain analog dalam protein B. Studi tentang hibrida
domain-bertukar dapat dihasilkan .

METODE KOMBINASI
 Kadang-kadang sulit diketahui mutasi seperti apa yang dapat menghasilkan sifat
tertentu pada suatu protein
 Misalnya, untuk meningkatkan termostabilitas suatu protein masih sulit untuk
dilakukan hanya dengan melakukan prediksi pada struktur 3 dimensi (3-D) untuk
menentukan asam amino mana yang menentukan sifat ini
  Dengan metoda ini dapat dilakukan mutasi pada berbagai tempat untuk
kemudian dilakukan identifikasi protein mutan yang mana yang dapat
menghasilkan fungsi yang diinginkan.

Pada metode in,i Protein Hibrid yang mengandung segmen (domains / subdomains) dari
paling sedikit dua natural yang berbeda atau protein dari orang tua lelaki (Armstrong
1990). Domains dan subdomains didefinisikan terhadap struktural motif untuk variasi
ukuran dan kekomplekan, termasuk unit unit kecil yang rata rata memiliki 10 – 30 asam
amino, melipat menjadi unit fungsional , dan domains besar dari beberapa ratus asam
amino yang memiliki aktivitas enzim (Ostermeier and Benkovic 2001).

- Susunan Asam amino Alignment pada Subtilisin S41(Davail, et.al 1992), S39
(Narinx, 1992), SSII (Wati,1997), BPN (Wells, 1983), E (Stahl
Ferrari ,84’),Carlsberg (Jacobs,85’) dan Termitase (Meloun, 85’). Alignmen
multiple dilakukan dengan CLUSTAK W (Thompson,94’). Residu ditemukan
frekuen >50% . Mutasi pada 3-2G7.
- Lineage substilisin varian S41. Varian generasi pertama yang didapat
sebelumnya. (Miyazaki&Arnold, 1999). Tujuh mutasi didapat dari Generasi
pertama direkombinasikan oleh StEO dan varian terbaik, 2-6C5 didapat pada
generasi Pustaka kedua. Diparentkan
/dihubungkan dengan gen orangtua untuk menciptakan generasi pustaka ketiga oleh PCR
Error prone. Hanya nonsinonim mutasi ditunjukkan.
- Subtilisin dari struktur yang diketahui. Tujuh mutasi termostabil diidentifikasi
padad varian 3-2G7. Kalsium Ca hitam menindikate site ikatan Ca2+ yang ketat
dan indikate Ca abu abu site mengikat Ca2+ yang lemah, yang dilokasikan
 dibelakang loop yang mengandung Ser175 Model diciptakan menggunakan
MOLSCRIPT (Kraulis, 1991). Dependasi Temperatur aktifitas spesifik subtilisin
S41, 3-2G7, dan SS11.
- Bagaimana Enzim beradaptasi dilihat dari studi evolusi yang diarahkan :
Divergent evolution leads untuk Adaptasi pada lingkungan yang berbeda ,
Sebuah trade off antara aktivitas katalitik pada suhu dan thermostabililt rendah.
(Miyazaki, Wintrode)
- Rekayasa Stabilitas Enzim – T4 lisozie dengan introduksi pada Ikatan S-2
(Matsumura)
- Rekayasa Stabilitas Enzim – Triosephospate isomerase dari Yeast dengan
menggantikan Asn (deaminasi pada temperatur tinggi) , Ahern et.al.
Stabilita Enzim diekspresikan sebagai half-life, atau laju inaktivasi enzim pada 100oC.
Half life yang lebih lama menunjukkan enzim yang lebih stabil.
- Rekayasa Aktifitas Enzim – Tyrosyl-tRNA synthetase dari B. Stearothermophilus
dengan menggantikan Thr 51 (meningkatkan affinitas ATP), Wilkinson et.al.
- Rekayasa pengaruh Ca/ Calsium – untuk menganalisa independensi Subtilisin.
Saturasi mutagenesi , menghasilkan 7 dari 10 daerah ditemukan untuk memberikan
peningkatan stabilitas. Mutan yang dihasilkan 10x lebih stabil daripada enzim asli dalam
ketiadaan Calsium. Dan 50% lebih stabil daripada enzim asli dengan adanya Calsium.
- Mengurangi Sensitifitas Protein dengan Streptococcus streptokinase, 47 kDa
protein yang melarutkan clot darah. Komplex dengan plasminogen untuk
merubah ke plasmin, yang menurunkan serat pada clot, Plasmin juga
menurunkan streptokinase [feedback loop].

Penerapan metode kimia untuk menyelidiki perannya dalam modulasi fungsi

protein.
Protein prenylation di alam mengacu pada lampiran pasca-translasi baik farnesyl (C-15)
atau geranylgeranyl (C-20) rantai lipid untuk sistein di urutan tertentu pada tulang
punggung protein (Eastman et al ;. McTaggart 2006) dekat (dan setelah lebih lanjut
dimodifikasi pada) C-terminal dari protein. Proses ini dikatalis oleh tiga enzim berbeda:
farnesyltransferase protein dan protein geranylgeranyltransferase tipe I dan II.
Prenylation memiliki efek dramatis pada lipophilicity target protein, membantu membran
menahan protein, contoh keluarga kecil Ras G-protein, membentuk kompleks dengan
protein pendampingnya, REP, dan selanjutnya terprenilasi (Rak et al 2004). Ramamurthy
et al 2003), membuat studi rasional prenylation target yang menarik. Dalam kasus
protein Ras, yang telah terlibat dalam ketidakpekaan untuk apoptosis sel baris kanker
tertentu, farnesylation dan membran sangat penting untuk fungsi target berikutnya
(Cohen et al 2.000). Ditemukan bahwa inhibisi dari Ras-farnesyltransferase nuklir
menekan ekspresi gen faktor-κB diatur (Takada et al 2004). Farnesylation Protein dan
geranylgeranylation memainkan peran dalam penyakit asasi tertentu, seperti
osteoporosis, penghambatan geranylgeranylation mencegah pembentukan dan fungsi
normal dari osteoklas, sel-sel yang terlibat dalam penghancuran jaringan tulang (Van
Beek et al 1999;. Woo et al.2005), dan dalam progeria Hutchinson-Gilford, penyakit
dimana pasien mengalami penuaan yang cepat (Meta et al 2006)..

Menerapkan metode kimia untuk menyelidiki perannya dalam modulasi fungsi

protein.
Protein prenylation di alam mengacu pada lampiran pasca-translasi baik farnesyl (C-15)
atau geranylgeranyl (C-20) rantai lipid untuk sistein di urutan tertentu pada tulang
punggung protein (Eastman et al ;. McTaggart 2006) dan setelah lebih lanjut
dimodifikasi pada C-terminal protein.
Proses ini dikatalis oleh tiga enzim berbeda: farnesyltransferase protein dan protein
geranylgeranyltransferase tipe I dan II. Prenylation memiliki efek dramatis pada
lipophilicity target protein, membantu membran menahan protein, contoh keluarga kecil
Ras G-protein, membentuk kompleks dengan protein pendampingnya, REP, dan
selanjutnya terprenilasi (Rak et al 2004). Ramamurthy et al 2003), membuat studi
rasional prenylation target yang menarik. Dalam kasus protein Ras, yang telah terlibat
dalam ketidakpekaan untuk apoptosis sel baris kanker tertentu, farnesylation dan
membran sangat penting untuk fungsi target berikutnya (Cohen et al 2.000). Ditemukan
bahwa inhibisi dari Ras-farnesyltransferase nuklir menekan ekspresi gen faktor-κB diatur
(Takada et al 2004). Farnesylation Protein dan geranylgeranylation memainkan peran
dalam penyakit asasi tertentu, seperti osteoporosis, penghambatan geranylgeranylation
mencegah pembentukan dan fungsi normal dari osteoklas, sel-sel yang terlibat dalam
penghancuran jaringan tulang (Van Beek et al 1999;. Woo et al.2005), dan dalam
progeria Hutchinson-Gilford, penyakit dimana pasien mengalami penuaan yang cepat
(Meta et al 2006)..
- Reaksi Karbenoid dengan tryptophan sebagai tag aromatic. Walaupun tidak selective,
reaksi memaparkan tipe reaksi baru yang berguna untuk modifikasi protein.

Reaksi pengikatan plates terlapist (precoated dengan target ligan yang diinginkan) yaitu:
• Glutathione untuk GST
• Dekstrin untuk MBP
• Ni +2 atau Co 2 chelated untuk 6xHis tag
• NeutrAvidin Protein pengikat Biotin, Avidin dan Streptavidin untuk Biotin
• Resin Pra-pengendapan SwellGel pada filterplates untuk kapasitas tinggi-melalui
pemurnian lebih tinggi
• Poppers lisis Cell dan Reagen Ekstraksi dan Kits
Setelah kehadiran molekul target yang diinginkan diverifikasi, B-PER Reagen/ Pereaksi
Ekstraksi Bakteri Protein dan Y-PER Pereaksi Ekstraksi Yeast Protein Pereaksi
menyediakan cara mudah pemurnian yang efisien. Teknik ini mencakup semua yang
diperlukan untuk memurnikan molekul target, dari buffer lisis pada kolom afinitas untuk
buffer elusi. B-PER Reagent dipatenkan, ringan dan nonionic deterjen yang
memfasilitasi ekstraksi sederhana dan cepat dari target pada kondisi larut dan tidak larut.
Y-Pereaksi PER adalah deterjen nonionic ringan yang memungkinkan 100% lebih
ekstraksi dari sel ragi dari manik-manik kaca.
Teknik B-PER dan Y-PER dapat digunakan untuk ekstraksi protein rekombinan larut dan
pemurnian inklusi protein terlarut.

Klasifikasi Metode Isolasi Protein berdasarkan Jenis Jaringan Protein

\
Kadar garam maksimal pada target protein larut, sentrifuge dan membuang pelet.
Tambahkan cukup garam untuk menurunkan protein. Kumpulkan pelet.
 Pelarut organik
Mempunyai prinsip sama dengan penggaram; mengambil keuntungan dari kelarutan
yang berbeda. Menghindari total protein denaturasi.
 pH
Protein memiliki kelompok berionisasi berrentang pKs. Ketika muatan total protein nol
(titik isoelektrik/pI). Protein paling larut pada pl karena interaksi mereka untuk
meminimalkan muatan muatan.
 Kristalisasi
Metode kelarutan dimana protein adalah ppt dapat digunakan untuk menumbuhkan
kristal protein. Terjadi ketika protein relatif murni.
 Ketika konsentrasi garam yang tinggi hadir, protein cenderung terkumpul dan
mengendap keluar dari solusi: "salting out / penggaraman keluar"
 Endapan protein yang berbeda pada konsentrasi garam berbeda. pH, suhu dan
kemurnian protein memainkan peran menentukan titik salting out.
 Amonium sulfat adalah garam yang dipilih karena menggabungkan banyak fitur
yang berguna:
 Efektifitas penggaraman / Salting out
 pH versalitas
 Kelarutan tinggi
 Larrutan dengan temperature panas
 Harga yang rendah
 Amonium sulfat konsentrasi: persentasi kejenuhan
 Persamaan sederhana untuk perhitungan gram amonium sulfat yang dibutuhkan
untuk membuat suatu solusi X% dari% Xo: