ASSALAMUALAIKUM

Kelompok 4 :
Annisa
Auliya Nur’aeni
Diky Fajar P
Irni Pratiwi
Ryad Anugrah
Tifani Dea A
Suci Ristiani
KARAKTERISASI PROTEIN
PENGERTIAN
Protein berasal dari bahasa Yunani “proteios” yang
berarti pertama atau utama. Protein merupakan
makromolekul yang menyusun lebih dari separuh bagian
dari sel. Protein menentukan ukuran dan struktur sel,
komponen utama dari sistem komunikasi antar sel serta
sebagai katalis berbagai reaksi biokimia didalam sel.
Karena itulah sebagian besar aktivitas penelitian
biokimia tertuju pada protein khususnya hormon,
antibodi, dan enzim (Fatchiyah dkk, 2011).
Protein merupakan makromolekul yang terdiri dari
rantai asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida
membentuk rantai peptidadengan berbagai panjang dari
dua asam amino (dipeptida), 4-10 peptida (oligopeptida),
dan lebih dari 10 asam amino (polipeptida) (Gandy dkk,
2014).
STRUKTUR PROTEIN
IKATAN PROTEIN
Di dalam protein, asam-asam amino diikat bersama
melalui ikatan peptida, yaitu ikatan C–N hasil reaksi
kondensasi antara gugus karboksil dengan gugus
amino dari asam amino lain.

Reaksi tersebut merupakan contoh dipeptida, yaitu

molekul yang dibentuk melalui ikatan peptida dari
dua asam amino. Suatu polipeptida (protein) adalah
polimer yang dibentuk oleh sejumlah besar asam
amino melalui ikatan peptida membentuk rantai
polimer.
SIFAT-SIFAT FISIKO KIMIA PROTEIN
Sifat fisikokima setiap Protein tidak sama
tergantung pada jumlah dan jenis asam amino.

Apabila larutan Protein+garam pengendapan

protein (daya larut berkurang atau salting out).
Protein dipanaskan/+alkohol
koagulasi/penggumpalan
 panas/ alkohol menarik mantel air yang
melingkupi molekul2 protein
JENIS PROTEIN BERDASARKAN
FUNGSINYA
 Protein Sempurna : protein sempurna adalah protein yang
didalamnya terkandung asam amino yang lengkap. Contohnya
kasein pada susu dan albumin pada putih telur. Protein sempurna
pada umumnya terdapat pada protein hewan.
 Protein Kurang Sempurna : protein kurang sempurna adalah
protein yang asam aminonya lengkap tetapi jumlah dari beberapa
asam amino sedikit. Protein kurang sempurna tidak mampu
mencukupi pertumbuhan, tetapi protein kurang sempurna ini dapat
mempertahankan jaringan yang telah ada. Contohnya protein pada
lagumin yang terdapat pada kacang-kacangan dan giladin pada
gandum.
 Protein Tidak Sempurna : protein tidak sempurna adalah protein
yang kurang atau tidak memiliki asam amino esensial. Protein tidak
sempurna tak mampu mencukupi pertumbuhan dan
mempertahankan yang telah ada sebelumnya. Contohnya, Zein yang
terdapat pada jagung, dan beberapa protein yang ada pada
tumbuhan.
EKSTRAKSI PROTEIN
Didalam sel protein terdapat membran plasma dan
membran internal. Protein adalah merupakan
biomakromolekul yang sangat heterogen apabila
berada diluar sel protein sangat tidak stabil. Maka
untuk mempertahankan fungsinya, ketika
diekstraksi harus dihindarkan dari proteolisis.
Karena proteolisis dapat menyebabkan gangguan
pengaktivasian protein yang diinginkan.
ISOLASI PROTEIN
Isolasi protein adalah suatu cara memisahkan
protein dari makromolekul yang lain atau
memisahkan protein dari protein lain yang tidak
diinginkan.
Secara sederhana proses dari isolasi protein
konsepnya sama dengan isolasi DNA, hanya saja
isolasi protein menggunakan buffer lysis untuk
melisiskan.
FAKTOR YANG MEMPENGARUHI ISOLASI
PROTEIN :

 Suhu
 pH

 Pelarut organik

 Ion logam

 Enzim-enzim

 Perlakuan mekanis

 Penambahan garam
ISOLASI PROTEIN INTRASELULER
Sel
lisis

Sentrifugasi

Pelet supernatan
PELISISAN SEL
 Metode Pelisisan Sel

Mekanik Kimiawi

• Homegenisan
tingkat tinggai • Larutan buffer
• Ekstruksi tingkat • Detergen
tinggi • Ketalor
• Metode blending • Inhibitor protease
• sonikasi
SEBELUM SENTRIFUGASI
 Ditambahkan amonium sulfat, untuk prepitasi
garam secara salting out, sehingga menyebabkan
interaksi hidrofobik antara molekul protein.
Interaksi hirofobik antara molekul akan
meningkatkan kelarutan protein menjadi rendah
dan akan mengakibatkan penggumpalan. Sehingga
mudah dapat dipisahkan dengan sentrifuse.
SENTRIFUGASI
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
subtansi berdasarkan gaya sentrifugasi sehingga
subtansi yag lebih berat akan berada didasar,
sedangkan yang lebih ringan akan terletak diatas.
Akan menghasilkan :
 Supernatan : memiliki bobot rendah (yang akan
dideteksi)
 Pelet : memiliki bobot lebih tinggi
PEMURNIAN PROTEIN
Secara umum proses pemurnian protein dilakukan
dengan menggunakan metode kromatografi kolom
penukar ion.
kromatografi kolom penukar ion didasarkan atas
interaksi muatan ionik yang berbeda dari komponen
sampel terhadap sisi aktif.
WESTREN BLOT
 Adalah proses pemindahan protein dari gel hasil
elektroforesis ke membran.
 Membran yang didapat diperlakukan lebih
fleksibel daripada gel sehingga protein yang
berblot pada membran dapat dideteksi dengan
cara visual maupun flourosensi.
 Deteksi ekspresi protein pada organisme
dilakukan dengan prinsip imunologi mengunakan
antibodi primer dan antobodi sekunder.
TEKNIK WESTERN BLOT

elektroforesis
Pemisahan
Pemisahan protein dari gel Deteksi protein
protein poliakrilamid tersebut
didasarkan menuju gel memanfaatkan
ukuran molekul transfer interaksi antala
dalam suatu menggunakan antigen dan
tegangan listrik arus listrik antibodi yang
tertentu. sebagai bersifat spesifik.
pendorong.
 ELEKTROFORESIS
• Dalam elektroforesis, sampel yang mengandung protein
biasanya dicampur dengan SDS (sodium dodecyl
sulfas).

• Muatan negatif SDS mengandung kestabilan protein

sehingga protein mengalami denaturasi.

• Suatu protein miltimer juga akan terurai menjadi

monomer penyusunnya.

• Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus

tersebut dimasukan dalam suatu membran poliakrilamid
yang dialiri arus listri.

• Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita

yang merupakan protein-protein yang telah terpisah
berdasarkan berat molekul.
ELEKTROTRANSFER
Blotting semi kering
menggunakan kertas
saring yang telah Blotting basah tidak
dibasahi dengan buffer menggunakan kertas saring
transfer. diantara gel poliakrilamid dan
gel transfer, kedua gel tersebut
diimpitkan dan direndam dalam
buffer transfic.
DETEKSI PROTEIN
Berdasarkan penggunaan antibodi primer dan antibodi
sekunder , ada dua metode deteksi :
1. Metode lansung menggunakan antibodi primer yang
telah terkonjugasi dengan molekulmarker.
2. Metode tidak langsung menggunakan antibodi
primer dan antibodi sekunder.
 Antibodi primer berfungsi meningkatkan protein
target.
 Antibodi sekunder berfugsi mengikat antibodi primer
dan terkonjugasi
 Molekul penanda yang umum digunakan diantaranya
adalah enzim alkalin fosfatase (AP), enzim horsedish
petoksidase (HRP), dan imunogold.
KUANTIFIKASI PROTEIN
Metode kuantifikasi protein total :
1. Absorpsi pada panjang gelombang 280 nm
 Absorpsi dari asam aromatik, triptofan, dan
residu tirosin
 Keuntungan : cepat dan berguna untuk
mengidentifikasi protein sebelum menggunakan
metode akurat
 Kerugian : gangguan dari senyawa lain yang
terabsorpsi pada panjang gelombang 280 nm
KUANTIFIKASI PROTEIN
2. Lowry assay
Terdapat dua langkah reaksi :
- Pertama : Cu (II) protein akan terbentuk,
dalam suasana alkalis Cu(II) akan terduksi
menjadi Cu (I).
- Kedua : Ion Cu+ kemudian akan mereduksi
reagen Folin Ciocalte menghasilkan
heteropoly molybdenum blue akibat reaksi
oksidasi gugus aromatik (rantai sampai asam
amino) terkatalis Cu, yang memberikan
warna biru intensif yang dapat dideteksi pada
panjang gelombang 500-750 nm
KUANTIFIKASI PROTEIN
3. Bradford assay :
- Menggunakan pewarna Coomasie
Briliant Blue (CBB) yang akan
mengikat residu ariginin dan senyawa
aromatik pada protein
Menghasilkan warna kebiruan

- Protein diukur pada panjang gelombang

465-595 nm
Terimakasih 