REAKSI UJI PROTEIN

I.

Tujuan Percobaan Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari beberapa reaksi uji terhadap protein. Memahami metode identifikasi protein dengan uji biuret. Memahami metode identifikasi protein dengan pengedapan oleh logam. Memahami metode identifikasi protein dengan pengendapan oleh garam. Memahami metode identifikasi protein dengan pengendapan oleh alkohol. Memahami metode identifikasi protein dengan uji koagulasi. Memahami metode identifikasi protein dengan denaturasi protein.

II.

Teori Dasar Protein merupakan biopolimer polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein merupakan biopolimer yang multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel maupun jaringan dan organ, sebagai enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau pembawa senyawa atau zat ketika melalui biomembran sel dan sebagai zat pengatur. protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dn pengatur. Protein adalah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung unsur-umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992). Protein merupakan suatu polipeptida dengan BM yang sangat bervariasi dari 5000 samapi lebih dari satu juta karena molekul protein yang besar, protein sangat mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti panas, asam, basa, solven organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioaktif (Sudarmadji, 1996). Selain itu protein juga merupakan makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme. Protein merupakan instrumen yang mengekspresikan informasi genetik

Protein mempunyai fungsi unik bagi tubuh, antara lain menyediakan bahanbahan yang penting peranannya untuk pertumbuhan dan memelihara jaringan tubuh, mengatur kelangsungan proses di dalam tubuh, dan memberi tenaga jika keperluannya tidak dapat dipenuhi oleh karbohidrat dan lemak. Struktur asam amino digambarkan sebagai berikut:

(Lehninger, 1995). Struktur protein tidak stabil karena mudah mengalami denaturasi yaitu keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversibel maupun ireversibel. Faktor-faktor yang menyebabkan denaturasi adalah pH, panas, pelarut, kekuatan ion, terlarut, dan radiasi. Denaturasi yang berbahaya yaitu raksa (Hg) untuk pemurnian emas seperti yang terjadi di Minamata, Jepang. Protein ada yang reaktif karena asam amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH, -OH, NH2, dan COOH. Contoh protein aktif adalah enzim, hormon, antibodi, dan protein transport. Reaksi protein aktif bersifat selektif dan spesifik, gugus sampingnya yang selektif dan susunan khas makromolekulnya. Ciri- Ciri Protein yaitu : 1. Susunan kimia yang khas Setiap protein individual merupakan senyawa murni 2. Bobot molecular yang khas Semua molekul dalam suatu contoh tertentu dari protein murni mempunyai bobot molecular yang sama. Karena molekulnya yang besar maka protein mudah sekali mengalami perubahan fisik atau aktivitas biologisnya. 3. Urutan asam amino yang khas

Urutan asam amino dari protein tertentu adalah terinci secara genetic. Akan tetapi, perubahan-perubahan kecil dalam urutan asam amino dari protein tertentu. ( Page,D.S. 1997 ). Jenis- jenis protein a. Kolagen, protein struktur yang diperlukan untuk membentuk kulit, tulang, dan ikatan tisu. b. Antibodi, protein system pertahanan yang melindungi badan dari pada serangan penyakit. c. Dismutase superoxide, protein yang membersihkan darah kita. d. Ovulbumin, protein simpanan yang memelihara badan. e. Hemoglobin, protein yang berfungsi membawa sebagai pembawa oksigen. f. Toksin, protein racun yang digunakan untuk membunuh kuman. g. Insulin, protein hormone yang mengawal arah glukosa dalam darah. h. Tripsin, protein yang mencernakan makanan protein. Penggolongan protein berdasarkan Struktur molekulnya : 1. Struktur Primer ( struktur utama) Struktur ini terdiri dari asam-asam amino yang dihubungkan satu sama lain secara kovalen melalui ikatan peptida.

2. Struktur sekunder Protein sudah mengalami interaksi intermolekul, melalui rantai samping asam amino. Ikatan yang membentuk struktur ini, didominasi oleh ikatan hidrogen antar rantai samping yang membentuk pola tertentu bergantung pada orientasi ikatan hidrogennya. Ada dua jenis 3. Struktur Tersier Terbentuk karena adanya pelipatan membentuk struktur yang -sheet.

kompleks. Pelipatan distabilkan oleh ikatan hidrogen, ikatan disulfida, interaksi ionik, ikatan hidrofobik, ikatan hidrofilik. 4. Struktur Kuartener Terbentuk dari beberapa bentuk tersier, dengan kata lain multi sub unit. Interaksi intermolekul antar sub unit protein ini membentuk struktur keempat/kuartener Fungsi dan Peranan Protein Protein memegang peranan penting dalam berbagai proses biologi. Peranperan tersebut antara lain: 1. Katalisis enzimatik

Hampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi dikatalisis oleh enzim dan hampir semua enzim adalah protein. 2. Transportasi dan penyimpanan

Berbagai molekul kecil dan ion-ion ditansport oleh protein spesifik. Misalnya transportasi oksigen di dalam eritrosit oleh hemoglobin dan transportasi oksigen di dalam otot oleh mioglobin. 3. Koordinasi gerak

Kontraksi otot dapat terjadi karena pergeseran dua filamen protein. Contoh lainnya adalah pergerakan kromosom saat proses mitosis dan pergerakan sperma oleh flagela. 4. Penunjang mekanis

Ketegangan kulit dan tulang disebabkan oleh kolagen yang merupakan protein fibrosa. 5. Proteksi imun Antibodi merupakan protein yang sangat spesifik dan dapat mengenal serta berkombinasi dengan benda asing seperti virus, bakteri dan sel dari organisma lain. 6. Membangkitkan dan menghantarkan impuls saraf

Respon sel saraf terhadap rangsang spesifik diperantarai oleh oleh protein reseptor. Misalnya rodopsin adalah protein yang sensitif terhadap cahaya ditemukan pada sel batang retina. Contoh lainnya adalah protein reseptor pada sinapsis. 7. Pengaturan pertumbuhan dan diferensiasi

Pada organisme tingkat tinggi, pertumbuhan dan diferensiasi diatur faktor pertumbuhan. Misalnya faktor pertumbuhan saraf mengendalikan

pertumbuhan jaringan saraf. Selain itu, banyak hormon merupakan protein (Santoso, H. 2008)

Ada berbagai cara dalam pengujian terhadap protein yaitu dengan reaksi uji asam amino dan reaksi uji protein. Reaksi uji asam amino sendiri terdiri dari 6 macam uji yaitu: uji millon, uji hopkins cole, uji belerang, uji xantroproteat, dan uji biuret. Sedangkan untuk uji protein, berdasarkan pada uji biuret, pengendapan oleh garam, pengendapan oleh logam dan alkohol. Serta uji koagulasi dan denaturasi protein A. Uji Biuret Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSo4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan rekasi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet. B. Uji Xantroprotein Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan. C. Uji Hopkins-Cole Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut. D. Uji Millon Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk

fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. E. Uji denaturasi
Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tertier dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovelen. Karena itu, denaturasi dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hydrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan aterbukanya lipatan atau wiru molekul protein (Winarno, 1992).

III.

Alat dan Bahan Bahan Pereaksi Molisch Reagent Benedict Reagent Barfoed Pereaksi Seliwanoff Larutan Iodium Larutan Asam Sulfat Pekat 9 Jenis Larutan Karbohirat : - Larutan 0,1 M Glukosa - Larutan 0,1 M Fruktosa - Larutan 0,1 M Galaktosa - Larutan 0,1 M Arabinosa - Larutan 0,1 M Sukrosa - Larutan 0,1 M Maltosa - Larutan 0,1 M Laktosa - Larutan 1 pati/amilum - Suspensi selulosa (kapas) dalam air HCl 6 N NaOH 6 N Air

Alat Tabung reaksi Pipet tetes Gelas ukur Erlenmeyer Penangas air

IV.

Prosedur Percobaan Uji Biuret

Dalam tabung reaksi dimasukan 3 ml larutan protein (gelatin dan albumin). Lalu ditambahkan 1 ml NaOH 2,5 N, aduk. Ditambahkan pula setetes larutan CuSO4 0,01 M, aduk. Bila tidak timbul warna, tambahkan lagi setetes atau 2 tetes larutan CuSO4. Pengendapan Dengan Logam Dalam tabung reaksi dimasukan 3 ml larutan protein (gelatin dan albumin). Lalu ditambahkan 5 tetes HgCl2 0,2 M. Ulangi percobaan dengan menggunakan Pb asatat 0,2 M. Pengendapan Dengan Garam Larutan protein (gelatin dan albumin) sebanyak 5 ml dijenuhkan dengan ammonium sulfat. Untuk pekerjaan ini: Pertama ditambahkan sedikit garam tersebut kedalam larutan protein (gelatin dan albumin), aduk hingga melarut. Lalu ditambahkan lagi sedikit ammonium sulfat dan aduk lagi, lakukan sehingga sedikit garam tertinggal tidak terlarut. Setelah larutan jenuh, lalu disaring. Uji kelarutan endapan di dalam air. Uji pula endapan dengan reagen Millon dan filtrat dengan uji biuret. Pengendapan Dengan Alkohol Disiapkan 3 tabung reaksi: Tabung 1: Dimasukan larutan albumin sebanyak 5 ml, buffer asetat pH 4,7 (1M) sebanyak 1 ml dan etil alkohol 95% sebanyak 6 ml. Tabung 2: Dimasukan larutan albumin sebanyak 5 ml, HCl 0,1 M sebanyak 1 ml dan etil alkohol 95% sebanyak 6 ml. Tabung 3: Dimasukan larutan albumin sebanyak 5 ml, NaOH 0,1 M sebanyak 1 ml dan etil alkohol 95% sebanyak 6 ml. Uji Koagulasi Dalam tabung reaksi dimasukan 5 ml larutan protein, lalu ditambahkan 2 tetes CH3COOH 1M. Tabung kemudian diletakan dalam air mendidih selama 5 menit. Lalu endapan diambil dengan batang pengaduk. Uji kelarutan endapan di dalam air, uji pula endapan dengan reagen Millon. Denaturasi Protein Disiapkan 3 tabung reaksi: Tabung 1: Dimasukan larutan albumin sebanyak 9 ml dan HCl 0,1 M sebanyak 1 ml Tabung 2: Dimasukan larutan albumin sebanyak 9 ml dan NaOH 0,1 M sebanyak 1 ml

Tabung 3: Dimasukan larutan albumin sebanyak 9 ml dan buffer asetat pH 4,7 (1M) sebanyak 1 ml. Lalu ketiga tabung tersebut ditempatkan didalam air mendidih selama 15 menit dan dinginkan pada temperatur kamar. Pada tabung 1 dan 2 ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7 lalu ditulis hasilnya.

V.

Data Pengamatan Tabel 1. Uji Biuret Prosedur 3 ml larutan gelatin + 1 ml NaOH 2,5 N diaduk ditambah 6 tetes CuSO4 0,01 M diaduk Hasil Reaksi Larutan gelatin yang berwarna kuning bening menjadi berwarna agak bening setelah ditambah NaOH 2,5 N. Setelah ditambah 6 tetes CuSO4, Permukaan larutan berwarna ungu Keterangan Gambar

3 ml larutan albumin + 1 ml NaOH 2,5 N diaduk ditambah 6 tetes CuSO4 0,01 M diaduk

Larutan albumin yang berwarna putih keruh menjadi berwarna bening setelah ditambah NaOH 2,5 N. Setelah ditambah 6 tetes CuSO4, Permukaan larutan berwarna ungu lebih tua

Tabel 2. Uji Pengendapan dengan Logam Prosedur 3 ml larutan gelatin + 5 tetes HgCl2 0,2 M Hasil Reaksi Keterangan Gambar Larutan berwarna kuning pudar dan keruh Tidak terbentuk endapan (-)

3 ml larutan gelatin + 5 tetes Pb asetat 0,2 M

Larutan berwarna kuning pudar dan keruh Tidak terbentuk endapan (-)

3 ml larutan albumin + 5 tetes HgCl2 0,2 M

Larutan berwarna putih susu Terbentuk endapan berwarna putih di bagian bawah larutan lebih banyak (++) dari endapan oleh Pb asetat HgCl2 Hg2+ + 2 Cl-

 3 ml larutan albumin + 5 tetes Pb asetat 0,2 M

Larutan berwarna putih susu Terbentuk endapan (+) di bagian bawah berwarna putih Pb(COOH)2 Pb2+ + 2 COOH-

Tabel 3. Uji Pengendapan dengan Garam Prosedur 5 ml gelatin + 10 tetes (NH4)2SO4 hingga terjadi pengendapan Hasil Reaksi Terbentuk endapan (+) warna putih Endapan yang dihasilkan larut dalam air Menyaring endapan Endapan yang diuji dengan reagent Menguji kelarutan millon memberikan endapan di dalam warna kuning muda air Filtrat yang diuji dengan reagent Menguji endapan biuret menjadikan dengan reagent permukaan larutan Millon filtrat berwarna ungu Menguji filtrat dengan uji Biuret Keterangan Gambar Terbentuk endapan gelatin

Filtrat gelatin dengan uji biuret

5 ml albumin + 10 tetes (NH4)2SO4 hingga terjadi pengendapan

Terbentuk endapan warna putih yang lebih banyak (++) daripada endapan yang dihasilkan

Menyaring endapan Menguji kelarutan endapan di dalam air Menguji endapan dengan reagent Millon Menguji filtrat dengan uji Biuret

reaksi gelatin dengan (NH4)2SO4 Endapan yang dihasilkan larut dalam air Endapan yang diuji dengan reagent millon memberikan warna kuning kemerah-merahan Filtrat yang diuji dengan reagent biuret menjadikan permukaan larutan filtrat berwarna ungu

Albumin Millon (merah bata) dan Gelatin Millon (kuning)

Filtrat albumin dengan uji biuret

Tabel 4. Uji Pengendapan dengan alkohol Prosedur 5 ml larutan albumin + 1 ml buffer asetat pH 4,7 (1 M) + 6 ml etil alkohol 95 % Hasil Reaksi Terjadi dua fase warna pada larutan. - Di bagian atas terbentuk endapan (+++) berwarna putih - Di bagian bawah berwarna keruh Terjadi dua fase warna pada larutan. - Di bagian atas terbentuk endapan (++) berwarna putih - Di bagian bawah berwarna keruh Larutan berwarna bening dan tidak terjadi endapan (-) Keterangan Gambar Ketiga larutan sebelum ditambahkan alkohol 95% Tabung dari kiri ke kanan -Tabung 1 albumin+buffer -Tabung 2 albumin+HCl -Tabung 3 albumin+NaOH

5 ml larutan albumin + 1 ml HCl 0,1 M + 6 ml etil alkohol 95 %

5 ml larutan albumin + 1 ml NaOH 0,1 M + 6 ml etil alkohol 95 %

Ketiga larutan setelah ditambahkan alkohol 95% Tabung dari kiri ke kanan -Tabung 1 albumin+buffer+alkohol 95% -Tabung 2 albumin+HCl+alkohol 95% -Tabung 3 albumin+NaOH+alkohol 95%

Tabel 5. Uji Koagulasi Prosedur 5 ml larutan gelatin + 2 tetes asam asetat 1 M diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit ambil endapan dengan spatula Menguji kelarutan endapan di dalam air Menguji endapan dengan reagent Millon 5 ml larutan albumin + 2 tetes asam asetat 1 M diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit ambil endapan dengan spatula Menguji kelarutan endapan di dalam air Menguji endapan dengan reagent Millon Hasil Reaksi Warna larutan gelatin yang ditambahkan 2 tetes asam asetat 0,1 M tetap berwarna kuning, begitu pula setelah dipanaskan selama 5 menit, larutan tidak membentuk endapan Karena tidak terbentuk endapan, maka tidak dilakukan uji kelarutan endapan dalam air maupun uji endapan dengan reagen Millon Warna larutan albumin yang ditambahkan 2 tetes asam asetat 0,1 M tetap berwarna putih keruh, dan setelah dipanaskan selama 5 menit, larutan membentuk endapan (gumpalan) berwarna putih Endapan albumin yang diuji kelarutannya dalam air memberikan hasil bahwa endapan albumin tidak larut dalam air Endapan albumin yang diuji dengan regent Millon memberikan warna merah bata Keterangan Gambar Gelatin Setelah dipanaskan selama 5

Albumin Setelah dipanaskan selama 5

Uji kelarutan endapan dalam air

Uji endapan Millon

Tabel 6. Uji Denaturasi Protein Prosedur Hasil Reaksi 9 ml larutan albumin + 1 Larutan albumin yang ditambahkan HCl 0,1 ml HCl 0,1 M M, setelah dipanaskan menempatkan dalam air selama 15 menit mendidih selama 15 terjadi warna putih menit mendinginkan susu dan terbentuk pada temperatur kamar endapan. melihat ada atau tidak Setelah ditambahkan adanya endapan buffer asetat pH 4,7, ditambahkan 10 ml warna larutan tetap buffer asetat pH 4,7 berwarna putih susu Keterangan Gambar Gambar setelah ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7

9 ml larutan albumin + 1 ml NaOH 0,1 M menempatkan dalam air mendidih selama 15 menit mendinginkan pada temperatur kamar melihat ada atau tidak adanya endapan ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7

Larutan albumin yang ditambahkan NaOH 0,1 M, setelah dipanaskan selama 15 menit terjadi warna kuning bening dan tidak terbentuk endapan. Setelah ditambahkan buffer asetat pH 4,7 warna larutan menjadi warna putih susu dan terbentuk sedikit endapan Larutan albumin yang ditambahkan 1 ml buffer asetat pH 4,7, setelah dipanaskan selama 15 menit terjadi gumpalan berwarna putih susu

Gambar setelah ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7

9 ml larutan albumin + 1 ml buffer asetat pH 4,7 menempatkan dalam air mendidih selama 15 menit mendinginkan pada temperatur kamar melihat ada atau tidak adanya endapan ditambahkan 10 ml buffer asetat pH 4,7

Ketiga larutan sebelum dipanaskan

 Tabung 1 albumin+HCl+ dipanaskan selama 15 menit (sebelum ditambah buffer asetat) Tabung 2 albumin+NaOH+ dipanaskan selama 15 menit (sebelum ditambah buffer asetat) Tabung 3 albumin+buffer asetat pH 4,7+dipanaskan selama 15 menit

VI.

Pembahasan Pada berbagai uji kualitatif yang dilakukan terhadap beberapa macam protein, semuanya mengacu pada reaksi yang terjadi antara pereaksi dan komponen protein, yaitu asam amino. Gugus amino dan gugus karboksil yang ada pada asam amino akan menunjukkan sifat-sifat spesifiknya pada reaksi kimia yang dilakukan. Asam amino

juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat. Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, yaitu gugus karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan dalam air. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik pada gugus R-nya, sehingga dari reaksi tersebut dapat diketahui komponen asam amino suatu protein. Pada praktikum Biokimia Reaksi Uji Protein ini akan dipelajari cara identifikasi protein dengan memanfaatkan ikatan yang khas pada protein, yaitu ikatan peptida dan juga akan diamati pengaruh perubahan fisik seperti suhu, pH, dan zat-zat kimia terhadap struktur protein. Adapun larutan protein yang kami uji adalah larutan gelatin dan larutan albumin. 1. Uji Biuret Pada uji biuret, baik pada larutan protein gelatin dan albumin yang diujikan memberikan hasil positif, ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada permukaan larutan setelah ditambah NaOH dan CuSO4. Uji biuret hanya akan memberikan hasil positif pada protein yang memiliki ikatan peptida, artinya jika hanya terdiri dari satu asam amino saja (contoh: Glisin, alanin, valin), uji biuret akan memberikan hasil negatif. Larutan Gelatin dan albumin memiliki rumus bangunan yang kompleks dan mengikat dua atau lebih asam amino esensial, sehingga terbentuk ikatan peptida. Gelatin termasuk pada protein fiber yang terdiri atas beberapa rantai polipeptida yang memanjang dan dihubungkan satu dengan lain oleh beberapa ikatan silang hingga merupakan bentuk serat atau serabut yang stabil. Sementara itu, albumin merupakan protein globular yang terdiri atas rantai polipeptida yang berlipat (Poedjiadi, 1994). Jadi, dengan adanya ikatan peptida (polipeptida) inilah, hasil uji biuret pada gelatin dan albumin positif. Pada uji Biuret, maksud ditambahkannya NaOH dalam larutan uji adalah untuk mengkondisikan suasana basa, sehingga Cu dapat bereaksi dengan larutan protein. NaOH mencegah endapan Cu(OH)2, memecah ikatan protein sehingga terbentuk urea, sbg katalisator Reaksi menghasilkan warna violet pada permukaan larutan protein yang menandakan terbentuknya senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada asam amino dalam protein. Biuret merupakan senyawa dengan dua ikatan peptida yang

terbentuk pada pemanasan dua molekul urea dan mempunyai struktur mirip dengan struktur peptida dari protein (Routh, 1969), sehingga ion Cu2+ dari pereaksi biuret dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu

2.

Uji Pengendapan dengan Logam Pada uji protein pengendapan dengan logam, kami menguji larutan protein

(gelatin dan albumin) dengan larutan HgCl2 0,2 M dan Pb asetat 0,2 M. HgCl2 dan Pb asetat merupakan garam logam berat yang dapat mendenaturasi protein sama dengan halnya asam dan basa. Reaksi yang terjadi antara garam logam berat akan mengakibatkan terbentuknya garam protein-logam yang tidak larut. Garam logam berat seperti Pb dan Hg akan membentuk endapan logam proteinat. Ikatan yang terbentuk amat kuat dan akan memutuskan jembatan garam, sehingga protein mengalami denaturasi. Secara bersama, gugus COOH dan gugus NH2 yang terdapat dalam protein dapat bereaksi dengan ion logam berat Hg dan Pb membentuk senyawa kelat. Selain gugus COOH dan gugus NH2, gugus R pada molekul asam amino tertentu dapat pula mengadakan reaksi dengan ion atau senyawa lain. Gugus sulfihidril (-SH) pada molekul sistein akan bereaksi dengan ion Ag+ atau Hg++ (Poedjiadi, 1994). Dari hasil percobaan kami, diketahui bahwa reaksi antara logam berat Hg dan Pb dengan albumin menghasilkan endapan berwarna putih susu, sedangkan reaksi pada gelatin dengan logam Hg dan Pb tidak membentuk endapan. Tidak terbentuknya endapan oleh logam Hg dan Pb pada gelatin mungkin disebabkan konsentrasi gelatin yang rendah, sehingga kalaupun ada endapan jumlahnya sangat sedikit, sehingga hampir tidak ada endapan. Albumin merupakan protein yang jauh lebih kompleks daripada gelatin karena albumin lebih banyak tersusun atas asam amino. Hal ini juga mempengaruhi sifat albumin yang lebih cepat membentuk endapan dengan logam daripada gelatin. Pada albumin, endapan yang paling banyak dihasilkan adalah dari reaksi albumin dengan HgCl2 daripada dengan Pb asetat. Hal ini karena tetapan disosiasi Hg lebih tinggi daripada Pb, sehingga lebih banyak ion Hg2+ yang berada dalam bentuk bebas yang bereaksi dengan protein membentuk endapan. Sistein dan Metionin merupakan asam amino yang mengandung atom S pada molekulnya. Reaksi Pb-asetat dengan protein tersebut akan membentuk endapan berwarna putih

kekuningan, yaitu garam PbS. Dari hasil terbentuknya endapan albumin yang berwarna putih oleh Pb asetat, yakni endapan PbS, sehingga dapat disimpulkan albumin mengandung Sistein ataupun Metionin. 3. Uji Pengendapan dengan Garam Kelarutan protein akan berkurang bila ke dalam larutan protein ditambahkan garam-garam anorganik, akibatnya protein akan terpisah sebagai endapan. Pada percobaan yang kami lakukan, terjadi pengendapan pada masing-masing 5ml larutan protein albumin dan gelatin dengan penambahan garam amonium sulfat hingga jenuh, yaitu sebanyak 10 tetes, peristiwa pemisahan protein ini disebut salting out (penurunan kelarutan). Menurut literatur, bila garam anorganik yang ditambahkan berkonsentrasi tinggi, maka protein akan mengendap, pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air, maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang (Winarno, 2002). Pada larutan albumin yang memiliki struktur lebih komplek daripada gelatin, maka endapan yang terbentuk lebih banyak. Setelah larutan albumin dan gelatin dijenuhkan dengan (NH4)2SO4 dan terjadi pengendapan, selanjutnya dilakukan uji kelarutan endapan dalam air, uji endapan dengan reagent Millon, dan uji filtrat dengan reagent biuret. Pada endapan albumin, uji kelarutan endapan yang terjadi dengan air menunjukkan hasil positif (endapan larut membentuk butiran). Kemudian butiran endapan direaksikan dengan pereaksi Millon, untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin pada albumin. Prinsip dari uji Millon adalah pembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Tirosin merupakan asam amino yang mempunyai molekul fenol pada gugus R-nya, yang akan membentuk garam merkuri dengan pereaksi millon. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein albumin mengandung tirosin sebagai salah satu asam amino penyusunnya, karena hasil reaksinya positif, ditandai endapan berwarna kuning kemerahan. Uji filtrat albumin dengan pereaksi biuret juga menunjukkan hasil positif yang ditandai larutan berwarna ungu violet, pengujian filtrat dengan pereaksi biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya gugus amida pada filtrat yang dihasilkan. Hasil positif uji filtrat albumin dengan

reagent biuret ini menunjukkan bahwa masih ada protein yang belum terendapkan oleh garam amonium sulfat, sehingga masih ada protein yang memiliki ikatan peptida. Pada endapan gelatin, uji kelarutan endapan yang terjadi dengan air menunjukkan hasil positif (endapan larut membentuk butiran). Kemudian butiran endapan direaksikan dengan pereaksi Millon, untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin pada gelatin. Dari hasil percobaan, diketahui bahwa protein gelatin tidak mengandung tirosin pada asam amino penyusunnya, karena hasil reaksinya dengan reagent Millon negatif, ditandai endapan berwarna kuning. Pada Uji filtrat gelatin dengan pereaksi biuret menunjukkan hasil positif yang ditandai larutan

berwarna ungu violet. Hasil positif uji filtrat gelatin dengan reagent biuret ini menunjukkan bahwa masih ada protein yang belum terendapkan oleh garam amonium sulfat, sehingga masih ada protein yang memiliki ikatan peptida. 4.Uji Pengendapan dengan Alkohol Protein dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Alkohol merupakan pelarut organik yang akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air, sehingga terjadi daya tarik-menarik yang terjadi lebih besar antar molekul. Adanya alkohol memaksa gugus positif pada protein berikatan dengan ion positif lain pada larutan, sehingga kelarutan protein berkurang dan terjadi pengendapan. Pada uji pengendapan protein oleh alkohol pada tabung 1 (larutan albumin+Baffer asetat pH 4,7+etil alkohol 95%), endapan yang dihasilkan paling banyak dibandingkan tabung lainnya, karena buffer asetat memiliki pH 4,7 yang sama dengan pH isolistrik albumin (4,55-4,90). Pada titik isoelektrik, protein akan membentuk zwittterion sehingga dapat mengendap. Pada uji pengendapan protein oleh alkohol pada tabung 2 (larutan

albumin+HCl 0,1 M+etil alkohol 95%), juga terbentuk endapan protein, hal ini karena HCl mempunyai muatan positif yang dapat berikatan dengan protein yang dikondisikan oleh alkohol untuk mengendap. Pada uji pengendapan protein oleh alkohol pada tabung 3 (larutan albumin+NaOH 0,1 M+etil alkohol 95%), tidak

terbentuk endapan protein, karena NaOH tidak mempunyai muatan positif, sehingga tidak terjadi pengendapan dengan alkohol.

5. Uji Koagulasi Prinsip kerja koagulasi yaitu merusak ikatan peptida atau memutus ikatan protein menjadi asam amino dan merupakan suatu sistem irrevesible yang tidak dapat kembali ke bentuk semula. Protein akan mengalami koagulasi apabila dipanaskan pada suhu 50oC atau lebih. Koagulasi ini hanya terjadi bila larutan protein berada titik isolistriknya (Poedjiadi, 1994). PH isoelektrik adalah pH larutan tertentu di mana protein mempunyai muatan positif dan negatif sama, sehingga saling menetralkan. Pada pH isoelektrik, kelarutan protein sangat menurun atau mengendap. PH isolistrik albumin adalah 4,55-4,90 sedangkan pH isoelektrik 4,80-4,85. Pada pH isoelektrik, kelarutan protein sangat menurun atau mengendap. Pada temperatur diatas 60oC kelarutan protein akan berkurang (koagulasi) karena pada temperatur yang tinggi energi kinetik molekul protein meningkat sehingga terjadi getaran yang cukup kuat untuk merusak ikatan atau struktur sekunder, tertier dan kuartener yang menyebabkan koagulasi (Blogspot, 2007). Pada uji koagulasi, penambahan asam asetat bertujuan agar larutan protein mencapai pH isolistriknya sehingga bisa terkoagulasi. asam asetat berfungsi untuk mengkondisikan atau merusak protein dan memberikan hasil positif ketika direaksikan dengan pereaksi millon. Pada larutan albumin, setelah penambahan asam asetat dan dididihkan dalam air mendidih selama 5 menit, terbentuk gumpalan berwarna putih yang menunjukkan albumin terkoogulasi, sedangkan pada gelatin setelah penambahan asam asetat dan dididihkan dalam air mendidih selama 5 menit, tidak terbentuk endapan sama sekali, yang menunjukkan gelatin tidak terkoogulasi. Tidak terjadinya koagulasi pada gelatin mungkin disebabkan belum tercapainya pH isoelektrik gelatin yang cukup tinggi. Pada endapan albumin yang terbentuk dilakukan uji endapan dalam air dan uji endapan dengan reagent Millon. Untuk uji kelarutan endapan dengan air menunjukkan hasil negatif, sedangkan endapan yang direaksikan dengan pereaksi millon memberikan hasil positif, ditandai dengan warna endapan berubah menjadi merah bata yang artinya ada kandungan tirosin. Pada uji koagulasi, endapan albumin yang terjadi setelah penambahan asam asetat dan dipanaskan, menunjukkan bahwa endapan tersebut masih bersifat sebagai protein, hanya saja telah terjadi perubahan struktur tersier ataupun kwartener sehingga protein tersebut mengendap. Perubahan struktur tersier albumin ini tidak dapat diubah kembali ke bentuk semula, ini bisa dilihat dari tidak larutnya endapan albumin itu dalam air.

6. Uji Denaturasi protein Protein akan terdenaturasi atau mengendap bila berada pada titik isoelektriknya, yaitu pH dimana jumlah muatan positif sama dengan jumlah muatan negatifnya. Pemanasan yang berlangsung selama 15 menit, pada ketiga tabung yang masingmasing berisi albumin dan pereaksinya berguna untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar, hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut.

Pada uji denaturasi, protein yang dilarutkan dalam buffer asetat pH 4,7 (tabung 3) dan dipanaskan selama 15 menit menunjukkan adanya banyak endapan. Protein yang ditambahkan HCl 0,1 M (tabung 1) dan dipanaskan selama 15 menit, masih menghasilkan endapan karena dengan penambahan HCl 0,1 M larutan jadi memiliki pH 1, masih mendekati titik isoelektrik albumin, sehingga albumin dapat mengendap atau terdenaturasi. Protein yang ditambahkan NaOH 0,1 M (tabung 2) dan dipanaskan selama 15 menit, tidak menghasilkan endapan karena pada penambahan NaOH 0,1 M, pH larutan jadi memiliki pH 13, sangat jauh dari titik isoelektrik albumin, sehingga albumin tidak mengendap. Setelah ditambahkan buffer asetat pH 4,7 dengan volume berlebih pada tabung 1 dan 2, terjadi perubahan. Endapan yang terdapat pada tabung yang 1 menjadi lebih banyak berisi endapan, sedangkan pada tabung 2 yang semula tidak ada endapan, dengan penambahan buffer asetat ini protein pun mengendap.
Penambahan buffer asetat dengan volume yang berlebih akan membentuk dan merubah albumin kepada titik isoelektriknya yaitu pH 4,7, hal ini menunjukkan bahwa protein

albumin mengendap pada titik isoelektriknya, yaitu sekitar pH 4,7. VII. Kesimpulan Pada uji biuret, pada larutan gelatin dan larutan albumin sama-sama menunjukkan hasil positif, ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada permukaan larutan setelah ditambahkan NaOH dan CuSO4 Pada uji Biuret, maksud ditambahkannya NaOH dalam larutan uji adalah untuk mengkondisikan suasana basa, sehingga Cu dapat bereaksi dengan larutan protein. Reaksi menghasilkan warna violet pada permukaan larutan protein yang menandakan terbentuknya senyawa kompleks Cu dengan gugus -CO dan -NH pada asam amino dalam protein.

 reaksi antara logam berat Hg dan Pb dengan albumin menghasilkan endapan berwarna putih susu, sedangkan reaksi pada gelatin dengan logam Hg dan Pb tidak membentuk endapan. Tidak terbentuknya endapan oleh logam Hg dan Pb pada gelatin mungkin disebabkan konsentrasi gelatin yang rendah, sehingga kalaupun ada endapan jumlahnya sangat sedikit, sehingga hampir tidak ada endapan Pada albumin, endapan yang lebih banyak dihasilkan adalah dari reaksi albumin dengan HgCl2 daripada dengan Pb asetat. Hal ini karena tetapan disosiasi Hg lebih tinggi daripada Pb, sehingga lebih banyak ion Hg2+ yang berada dalam bentuk bebas yang bereaksi dengan protein membentuk endapan Pada larutan albumin yang memiliki struktur lebih komplek daripada gelatin, maka pada saat uji pengendapan dengan garam amonium sulfat, endapan yang terbentuk lebih banyak. protein albumin mengandung tirosin sebagai salah satu asam amino penyusunnya, karena hasil reaksinya dengan reagent Millon positif, ditandai endapan berwarna kuning kemerahan Hasil positif uji filtrat albumin dan gelatin dengan reagent biuret menunjukkan bahwa masih ada protein yang belum terendapkan oleh garam amonium sulfat, sehingga masih ada protein yang memiliki ikatan peptida Alkohol merupakan pelarut organik yang akan mengubah (mengurangi) konstanta dielektrika dari air, sehingga terjadi daya tarik-menarik yang terjadi lebih besar antar molekul. Adanya alkohol memaksa gugus positif pada protein berikatan dengan ion positif lain pada larutan, sehingga kelarutan protein berkurang dan terjadi pengendapan Pada denaturasi, yang dirusak adalah ikatan hidrogen dan ikatan tiol, proses denaturasi ini kadang-kadang dapat berlangsung secara reversibel, kadang-kadang tidak Pada koagulasi, yang dirusak adalah ikatan peptida, dan perubahan protein irreversibel akibat dari pengaruh pemanasan. Jika suatu enzim terkoagulasi, maka enzim tersebut tidak dapat berfungsi lagi

VIII.

Daftar Pustaka Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI Press. Winarno, F. G., 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia: Jakarta.

Girindra, A. 1986. Biokimia I. Gramedia, Jakarta. Lehninger, A. 1988. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy

Thenawidjaya. Erlangga, Jakarta