Nama : Ilham Muslim Mursalin

NPM : 230110160075

SOAL UJIAN AKHIR SEMESTER GANJIL 2018/2019

Mata Kuliah : Bioteknologi Perikanan
Kelas : B

Jawablah soal di bawah dengan uraian teori dan interprestasi dengan Gambar !

1. Pembuatan ikan transgenik memerlukan tahapan panjang, dimulai dari isolasi RNA gen
yang akan disisipkan, pemilihan vektor kloning dan vektor ekspresi, penyisipan gen yang
diinginkan, kloning pada sel kompeten, isolasi vektor yang mengandung konstruksi gen
yang disisipkan, hingga transfer gen tersebut menggunakan sperma sebagai mediator
transfer gen. Coba anda jelaskan :
a. Rincian skema gambar urutan pembuatan ikan transgenik, misalnya mengandung gen
hormon pertumbuhan (growth hormone/GH) secara utuh !
b. Masing-masing tahapan yang dijelaskan diatas, anda uraikan dengan penjelasan
gambar.
c. Gambarkan prinsip dasar tahapan kloning gen hingga diperoleh gen yang fungsional.
d. Mekanisme ligasi dan transformasi selalu terlibat dalam proses kloning vektor
ekspresi, jelaskan secara detail kedua mekanisme tersebut, dan uraikan mengapa
kedua mekanisme tersebut harus ada!
e. Apa yang dimaksud dengan sel kompeten? Berikan contohnya, dan bagaimana
mekanisme sel kompeten dapat digunakan untuk keperluan kloning gen.
2. Penggunaan teknologi transgenesis dalam perakitan ikan lele transgenik-GH memerlukan
primer yang cocok untuk memverifikasi apakah gen GH dapat terintegrasi dalam genom
ikan tersebut. Coba saudara selesaikan beberapa pertanyaan di bawah ini :
a. Uraikan secara garis besar bagaimana anda mendesain primer gen GH untuk membuat
ikan lele transgenik? Gunakan software secara on-line, gambarkan tahapannya!
b. Bagaimana anda mengidentifikasi GH endogen pada ikan lele non-transgenik dan GH
eksogen pada ikan lele transgenik? Gambarkan dengan teknik apa anda akan
mendeteksi GH endogen dan GH eksogen, serta urutan tahap tersebut.
 c. Gambarkan dengan sketsa, bagaimana anda menginterprestasikan bahwa pada genom
ikan lele transgenik terdapat dua gen (GH endogen dan GH eksogen) serta kontrol
positif yang digunakan untuk memverifikasi gen GH eksogen?
d. Apa yang dimaksud dengan over-ekspresi gen? Pengaturan ekspresi gen diatur oleh
apa? Jelaskan secara prinsip, bagaimana gen yang disisipkan terekspresi sehingga
dapat meningkatkan performa fenotip ikan sebagai akibat over ekspresi gen!
3. Gambarkan secara garis besar teknik elektroporasi sperma sebagai salah satu teknologi
transgenesis, yang dimulai dengan perlakuan kejut elektrik menggunakan elektroporator!
Dan gambarkan secara garis besar, bagaimana produksi galur keturunan ikan transgenik
pada setiap generasi yang dihasilkan dan sistem deteksi ikan transgenik!
Jawab :
Soal 1.
a) Rincian skema gambar urutan pembuatan ikan transgenik, misalnya mengandung gen
hormon pertumbuhan (growth hormone/GH) secara utuh !
Secara umum, tahap pembuatan ikan transgenik digambarkan skematis sebagai berikut :
b) Masing-masing tahapan yang dijelaskan diatas, anda uraikan dengan penjelasan
gambar.
Gen penyandi hormon pertumbuhan ikan pada umumnya, terdiri atas 5-6 ekson dengan
intron 5, dan pada setiap ikan air tawar dan laut terdapat perbedaan jumlah ekson, dimana jumlah
ekson ikan laut 6 sedangkan ikan air tawar 5.
Bagian sekuen gen penyandi yang paling fungsional digunakan dalam rancangan desain
primer untuk mengkopi bagian coding sequence gen adalah bagian open reading frame (ORF),
yang merupakan urutan yang dibaca oleh DNA polymerase saat proses transkripsi, dan
ditranslasikan menjadi sekuen asam amino penyandi protein GH. Bagian ORF pada kelompok
ikan catfish tersusun atas 603 bp nucleotide atau 200 asam amino fungsional GH.
Isolasi gen idealnya dilakukan dalam bentuk akhir cDNA (complementary DNA) untuk
meniadakan intron, karena dapat menginterupsi proses transkripsi gen yang disisipkan dalam
kultur E.coli. Isolasi gen hormon pertumbuhan ikan, diambil dari kelenjar hipofisis merupakan
sumber RNA yang selanjutnya diubah menjadi cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase.
Pada proses penggandaan, yang digunakan adalah untai pertama (first strand) daric DNA
GH ikan, ORF untuk hormon pertumbuhan ikan tersebut dapat diamplifikasi menggunakan fll
length cDNA sebagai template dengan PCR memakai primer catfish GH (cGH forward dan
reverse). Promotor untuk PCR degenerate (dinamakan G1 dan G2) dirancang mengikuti strategi
dari Lemaire et al. Primer lain yang dinamakan G4 dirancang mengikuti strategi conserved
domain.
Kloning gen adalah teknik untuk memperbanyak gen dengan perantaraan siklus sel
bakteri, sehingga diperoleh klon-klon, suatu kelompok sel-sel yang identik. Kloning gen
penyandi dalam vektor ekspresi dan transfer vektor ekspresi yang mengandung gen hormon
pertumbuhan lele dumbo ke DNA genom sperma ikan lele mutiara melalui teknik elektroforasi
sperma (SMGT). Setelah gen penyandi hormon GH ikan lele dumbo dengan genom ikan inang
(lele mutiara) terintegrasi, selanjutnya melihat pertumbuhan dari benih ikan lele mutiara yang
dihasilkan, ekspresi gen pada inang akan tampak setelah 1-2 bulan, dapat diidentifikasi dengan
metode PCR. Produksi ikan transenik dapat dilakukan secara reproduksi dengan perkawinan
antara F1 ikan transgenik dengan F0 ikan lele normal nontransgenik. Dan untuk memproduksi
kan transgenik yang stabil, dilakukan perkawinan antara F2 ikan transgenik dengan Ikan normal
non transgenik.
c) Gambarkan prinsip dasar tahapan kloning gen hingga diperoleh gen yang fungsional.
Pada proses kloning, DNA, melibatkan 4 proses utama, yaitu digestion, ligase,
transformasi dan screening. Prinsip dasar tahapan kloning gen digambarkan sebagai berikut:

Digestion merupakan proses pemotongan suatu untai ganda DNA, baik vector maupun
tergetnya dengan menggunakan satu atau lebih enzim restriksi yang sama atau berbeda jenisnya
(Crut et al., 2008). Enzim restriksi mampu mengenali dan memotong sekuens palindromik
sehingga hasil potongannya bersifat simetris. Enzim ini dapat menghasilkan dua jenis sisi
potongan, yaitu protrunding end dan blunt end (Glick dan Pasternak, 2003).
Ligasi adalah suatu proses penggabungan fragmen DNA yang saling berlinier dengan
menggunakan ikatan kovalen. Ikatan kovalen yang dimaksud adalah ikatan fosfodiester antara
ujung 3’ dari fragmen yang satu dan ujung 5’ dari fragmen yang lain (Anonymous, 1999). Proses
ligasi ini dilakukan oleh enzim DNA ligase dengan bantuan dari ATP. Proses ligasi ini
merupakan salah satu teknik penting yang diperlukan dalam melakukan rekombinan DNA,
termasuk protein untuk menghasilkan konstruksi DNA yang diinginkan (Powell dan Gannon,
2001). Screening merupakan proses untuk mengetahui koloni host yang telah dimasuki oleh
DNA asing (DNA target) menggunakan proses antibiotic screening atau blue white screening.
Selanjutnya positive recombinant DNA dikloning pada vector ekspresi untuk mengekspresikan
gen-gen yang dikloning dalam sel bakteri (Oliner et al., 1993). Sehingga DNA asing yang akan
digunakan pada ikan atau organisme target dapat selalu tersedia dan siap diinjeksikan ke target.
d) Mekanisme ligasi dan transformasi selalu terlibat dalam proses kloning vektor ekspresi,
jelaskan secara detail kedua mekanisme tersebut, dan uraikan mengapa kedua
mekanisme tersebut harus ada!
Mekanisme ligase adalah suatu proses penggabungan fragmen DNA yang saling berlinier
dengan menggunakan ikatan kovalen. Ikatan kovalen yang dimaksud adalah ikatan fosfodiester
antara ujung 3’ dari fragmen yang satu dan ujung 5’ dari fragmen yang lain.
Proses ligasi ini dilakukan baik pada ujung-ujung sticky end maupun blunt end, namun
proses ligase antara ujung-ujung blunt end memerlukan konsentrasi enzim DNA ligase yang lebih
tinggi daripada ujung-ujung sticky end. Proses ligase ini merupakan salah satu teknik penting
yang diperlukan dalam melakukan rekombinasi DNA, termasuk protein, untuk menghasilkan
konstruksi DNA yang diinginkan.
Enzim DNA ligase ini akan menyambungkan ujung 3’ –OH dengan ujung 5’ –PO4
melalui tiga tahapan kimia, yaitu :
 Ligase beraksi dengan ATP (atau NAD-) untuk membentuk suatu covalent ligase-
adenylate intermediate, dimana AMP akan berkaitan dengan gugus N- dari asam
amino lisin yang terdapat dalam enzim melalui suatu ikatan fosfoamida (P-N).
 AMP dipindahkan dari ligase menuju ujung 5-PO4 untuk membentuk suatu DNA-
adenylate intermediate (AppDNA).
 Ligase mengkatalis penyerangan 3-OH terhadap ujung dari AppDNA untuk
membentuk suatu ikatan fosfodiester dan melepaskan AMP. Berikut erupakan gambar
skematis reaksi ligase.
Transformasi merupakan teknik dasar dalam biologi molekuler yang bertujuan untuk
memasukkan DNA asing kedalam host, dan selanjutnya menggunakan host tersebut untuk
memperbanyak jumlah plasmid secara in vivo. Metode transformasi kimiawi lebih sering
digunakan dalam pengerjaan kloning gen, namun dalam perkembangan bioteknologi terakhir,
sperma dapat digunakan sebagai mediator dalam transfer gen ke dalam genom suatu spesies
hewan. Selama dekadeterakhir, spermatozoa pada ikan telah banyak diteliti peranannya dan dapat
bertindak sebagai vector untuk transfer gen asing dalam teknologi ikan transgenic yang dikenal
sebagai transfer gen yang diperantarai sperma (SMGT = sperm mediated gene transfer). Secara
alami, hewan akuatik memprodukse sejumlah besar sel-sel sperma yang sangat menguntungkan
bagia aplikasi teknik SMGT tersebut. Hasil penelitian collares et al. (2010) menggunakan sperma
American catfish (Rhamdia quelen) yang disisipi konstruk gen EGFT (Enhanced Green
Flourescience Protein), dan difertilisasikan padatelur catfish tersebut, transmisi transgen
terdeteksi pada larva ikan dengan efisiensi ekspresi transgen sebersar 25%.
Mekanisme ligase dan transformasi harus ada pada proses kloning vektor ekspresi karena
pada kloning dna, ligase dan transformasi merupakan salah satu dari 4 proses utama, prosedur ini
memiliki tujuan untuk mengisolasi sekuens DNA tertentu dan memperbanyak sekuens tersebut.
e) Apa yang dimaksud dengan sel kompeten? Berikan contohnya, dan bagaimana
mekanisme sel kompeten dapat digunakan untuk keperluan kloning gen.
Sel kompeten merupakan sel yang dapat dengan mudah diubah dinding selnya sehingga
DNA asing dapat dengan mudah masuk kedalam sel, dalam hal ini adalah sel E. coli
(Anonymous, 2005b).
Sel bakteri yang telah mengalami suatu perlakuan fisik sehingga dapat memperoleh kemampuan
untuk mengambil DNA asing adalah sel kompeten (Brown, 2010). Selain itu, sel kompeten ini
juga dapat mengambil DNA plasmid sirkuler. Sel biasa hanya dapat melakukan transformasi
DNA linier (Sword, 2003).
Salah satu metode sederhana untuk membuat sel menjadi kompeten (siap untuk
ditransformasi) dengan cara merendam sel bakteri ke dalam larutan garam dalam kondisi dingin,
contohnya kalsium klorida (CaCl2). Larutan garam ini dapat mengikat DNA dan komponen
lipopolisakarida dari dinding sel bakteri yang bermuatan negatif, sehinga DNA terikat dengan
dinding sel bakteri. Selain itu, larutan lain yang dapat digunakan untuk pembuatan sel kompeten
adalah polietilene glikol (Sword, 2003).
Soal 2.
a. Uraikan secara garis besar bagaimana anda mendesain primer gen GH untuk membuat
ikan lele transgenik? Gunakan software secara on-line, gambarkan tahapannya!
Membuka website NCBI (national
center for biotechnology
information)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov

All database diubah menjadi

Nucleotide. Ketik nama spesies ikan
& gen penyandi. Ikan yang dipilih
adalah Growth hormon (GH) dari
ikan Lele (Clarias gariepinus).

Setelah data mengenai GH ikan lele

keluar, Lalu, klik FASTA dan data
sequence gen akan keluar.

Seluruh sequence di block, lalu di

copy untuk mendapatkan produk
amplicon.
Lalu, buka website IDTDNA
(integrated DNA technologies), klik
tombol Primer Quest Tool untuk
mendesain primer yang kita
inginkan.

Paste sequence yang telah dicopy

dari ncbi di kolom Sequence Entry
yang telah disediakan. Ubah nama
Sequence sesuai dengan pengerjaan
yang dilakukan.
Dinamakan CgGH. Huruf Cg
diambil dari nama ikan lele, dan GH
dari gen penyandi growth hormone

Ubah Amplicon size, disesuaikan

dengan jumlah pasang basa (bp) gen
penyandi. Karena ACTB ikan
Rainbow trout berjumlah 603 bp,
diambil nilai minimum amplicon
size 500bp dan nilai maksimum 600
bp

Setelah hasil desain keluar, pilih

salah satu desain yang memiliki
panjang amplicon (amplicon length)
yang paling besar. Desain primer
yang dipilih panjang amplicon 554.
Lalu, klik view assay detail, untuk
melihat sequence dari primer yang di
desain.
Setelah amplicon produk didapat,
copy sequence dari amplicon produk
tadi (dimulai dari sequence pertama
Primer Forward sampai sequence
terakhir Primer Reverse

untuk BLAST data, klik pada kotak

Nucleotide BLAST.

Paste Sequence produk amplicon

pada kolom yang disediakan di menu
blast. Tuliskan Job Title dan ketik
nama spesies untuk identifikasi.
Setelah hal tersebut diisi, klik
BLAST di bawah website.
 Primer ikan Clarias gariepinus
Growth Hormone (CcGH) identik
91% dengan yang ada di gene bank

b. Bagaimana anda mengidentifikasi GH endogen pada ikan lele non-transgenik dan GH

eksogen pada ikan lele transgenik? Gambarkan dengan teknik apa anda akan
mendeteksi GH endogen dan GH eksogen, serta urutan tahap tersebut.
Untuk mengidentifikasi GH endogen pada ikan lele non-transgenik dan eksogen pada
ikan lele transgenik, dapat menggunakan teknik elektroforesis, yang sebelumnya dilakukan
amplifikasi DNA dulu dari sampel gen yang sudah diisolasi pada ikan lele tersebut. Fragmen
DNA yang terpsah akibat muatan listrik, dapat menunjukkan apakah ikan tersebut merupakan
ikan yang non-transgenik atau transgenik, dan ukuran sekuen dapat diidentifikasi pula.. Tujuan
pengerjaan elektroforesis pada dasarnya untuk visualisasi digunakan dengan tujuanuntuk
mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein.
Urutan tahapan pengerjaan elektroforesis digambarkan sebagai berikut :
c. Gambarkan dengan sketsa, bagaimana anda menginterprestasikan bahwa pada genom
ikan lele transgenik terdapat dua gen (GH endogen dan GH eksogen) serta kontrol
positif yang digunakan untuk memverifikasi gen GH eksogen?
Pada sampel nomor 1, didapatkan hasil ikan yang merupakan non transgenik, dapat
terlihat dari jumlah sekuen yang berjumlah 3015bp, yang merupakan gen endogen dari ikan itu
sendiri. Pada sampel nomor 2 dan 3, dapat disimpulka bahwa ikan tersebut merupakan ikan
transgenik yang memiliki jumlah sekuen 3618bp pada sampel no 2, sedangkan sampel nomor 3
telah dipecah fragmen sekuen nya, sehingga terdapat 2 sekuen yang mewakili gen endogen dan
eksogen. (3015bp merupakan gen endogen, 603bp merupakan gen eksogen).

d. Apa yang dimaksud dengan over-ekspresi gen? Pengaturan ekspresi gen diatur oleh apa?
Jelaskan secara prinsip, bagaimana gen yang disisipkan terekspresi sehingga dapat
meningkatkan performa fenotip ikan sebagai akibat over ekspresi gen!
Over-ekspresi gen merupakan pengungkapan untuk menunjukkn ekspresi yang berlebih
dari suatu gen.Teknik overekspresi juga merupakan salah satu cara untuk mempelajari atau
mengeksplorasi fungsi sebuah gen. Teknik ini dipakaiilmuwan untuk menjawab pertanyaan
“Apakah akibat yang ditimbulkan ketika suatu gen berada dalam kondisi berlebih?” dan “Apakah
kondisi tersebut memiliki efek terhadapgen lainnya dan berpengaruh terhadap produk yang
dihasilkan?” Teknik over-ekspresi dilakukan dengan cara mengisolasi (kloning) sebuah gen yang
sudah diketahui fungsinya, dan kemudian ditransformasikan ke organisme tujuan.
Pengaturan ekspresi gen diatur oleh 3 vektor
ekspresi gen. Vektor ekspresi gen yang
digunakan untuk mengekspresi gen-gen
yang dikloning dalam sel bakteri dikelommpokkan
menjadi 3 golongan, yaitu vektor-vektor yang
berbasis plasmid sederhana yang tidak mengandung
replicon eukariotik, vektor plasmid kompleks yang
menyatukan elemen-elemen dari genom virus
eukariotik untuk meningkatkan jumlah kopi DNA dan vektor-vektor yang dirancang untuk
mempermudah amplifikasi urut-urutan yang ditransformasikan dan telah terintegrasi ke dalam
genom inang.
Soal 3.
Elektroporasi adalah sebuah metode sel-sel dalam jaringan budaya dan menundukkan
melibatkan sel untuk ledakan pendek impuls listrik. Keuntungan utama dari elektroporasi adalah
tidak perlu menangani dan memanipulasi telur secara individual. Elektroporasi telah dicoba pada
telur ikan, tetapi kesulitan adalah bahwa telur cukup besar dan memiliki korion. Prinsip metode
ini adalah penggunaan secara singkat dan cepat rangsangan listrik untuk menembus membrane
sel, sehingga memungkinkan masuknya molekul DNA ke dalam embrio. Pulsa listrik yang
dipergunakan untuk elektroporasi ini sangat berpengaruh terhadap keberhasilan penyisipan
plasmid dan vektor kedalam DNA ikan. Kekuatan pulsa yang tinggi, akan membuka membrane
sel sperma lebih lebar, sehingga frekuensi kejutan yang dilakukan lebih sedikit, ketika pulsa yang
diberikan lebih rendah, maka membrane sel sperma yang terbuka akan lebih sempit, sehingga
frekuensi kejutan yang dilakukan lebih banyak. Pulsa >200 volt, akan merusak membrane sel
sperma.
Secara garis besar, produksi galur keturunan ikan transgenik pada setiap generasi yang
dihasilkan, melalui reproduksi atau perkawinan antara induk ika transgenik dengan ikan normal,
sehingga menghasilkan ikan transgenik yang stabil (Stable transgenic strain), yang biasanya
terdapat pada keturunan F2 atau F3. Digambarkan pada diagram berikut ini :

Sistem deteksi ikan transgenik dapat menggunakan Elektroforesis (pemisahan fragmen

DNA dengan muatan listrik) yang sebelumnya dilakukan amplifikasi terlebih dahulu
menggunakan metode PCR. Namun, selain itu juga ada cara lain dalam mendeteksi ikan
transgenik, yaitu dengan cara reporter gene. Dalam penggunaan reporter gene untuk mendeteksi
ikan transgenik, terdapat 3 macam :
1. RFP (Red Flourescent Protein)
2. GFP (Green Flourescent Protein)
3. YFP (Yellow Flourescent Protein)
Dengan metode reporter gene, larva ikan transgenik yang berumur 2 hari sudah dapat
dideteksi dan dipisahkan dari ikan lain yang nontransgenik.