BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Di bidang mikrobiologi, identifikasi mikroorganisme penyebab infeksi
memegang peranan yang sangat penting. Hal ini berkaitan dengan ketepatan
terapi, pencegahan transmisi, serta pencegahan terjadinya resistensi antimikroba.
Identifikasi mikroorganisme penyebab infeksi secara konvensional dilakukan
melalui metode pembiakan dan dilanjutkan dengan pemeriksaan karakteristik
fisiologis dan biokimia. Metode ini membutuhkan waktu yang lebih lama. Saat ini
dikembangkan metode identifikasi berbasis molekuler yang lebih cepat dengan
tingkat sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi, yaitu analisis sekuensing gen
16S rRNA atau Asam ribonukleat pengkode ribosom 16S, S menyatakan
Svedberg, yaitu satuan ukuran ribosom. Gen 16S rRNA juga sering disebut
sebagai 16S rDNA (Rinanda, 2011).
Hasil sekuensing gen 16S rRNA diolah menggunakan program BioEdit. Data
hasil BioEdit tiap isolat dianalisis dengan data di GenBank. Hasil perbandingan
sekuensing divisualisasikan dalam bentuk pohon filogenetik dengan
menggunakan program MEGA 6 yang dapat menunjukkan kekerabatan isolat
sampel dengan sekuen yang diperoleh. Data urutan basa gen penyandi 16S rRNA
digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetik yang dapat menunjukkan
nenek moyang dan hubungan kekerabatan organisme, tetapi yang sekerabat atau
identik berdasarkan parameter ini belum tentu memiliki kesamaan secara fisiologi
(Sepriana et al., 2017).

1.2. Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk memahami pentingnya bioinformatika di
bidang mikrobiologi. Memahami pentingnya urutan gen 16S rRNA untuk
identifikasi mikroorganisme. Dan menghargai pentingnya mengidentifikasi
mikroorganisme menggunakan Ribosom Database Project (RPD) secara on-line.

Universitas Sriwijaya
 BAB 2
TINJAUAN PUASTAKA

2.1. Pengertian Gen Pengkode RNA

Gen pengkode RNA ribosomal atau rRNA adalah gen yang paling lestari
conserved. Porsi sekuens rDNA dari tiap organisme yang secara genetik
berkorelasi umumnya adalah sama. Dengan demikian setiap organisme yang
memiliki jarak kekerabatan tertentu dapat disejajarkan sehingga lebih mudah
untuk menentukan perbedaan dalam sekuens yang menjadi ciri khas organisme
tersebut. Daerah yang lestari ini juga yang menyebabkan gen ini dapat digunakan
sebagai primer universal yang digunakan dalam Polymerase Chain Reaction atau
PCR serta dapat ditentukan urutan nukleotidanya melalui sekuensing
(Rinanda, 2011).

2.2. Pengertian Gen 16S rRNA

Gen 16S rRNA adalah salah satu gen yang telah dikarakterisasi dengan
baik sehingga digunakan dalam identifikasi mikroorganisme. Ribuan sekuens dari
berbagai isolat klinis dan dari lingkungan telah terkumpul di satu database yaitu
National Center for Biotechnology Information atau NCBI yang dapat diakses
pada www.ncbi.nlm.nih.gov, serta Ribosomal Database Project yang dapat
diakses pada website di internet. Database ini juga menyediakan aplikasi yang
dapat digunakan untuk membandingkan sekuens yang diperoleh dengan sekuens
yang telah terdaftar di database tersebut (Rinanda, 2011).

2.3. Amplifikasi Gen 16S rRNA

Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan menggunakan primer 63f atau 5’-CAG
GCCTAA CACATG CAA GTC-3’ dan 1387r 5’-GGG CGG WGT GTA
CAAGGC3’. Amplifikasi DNA dilakukan alat PCR My Cycler atau Bio Rad.
Kondisi awal atau pre PCR diatur pada suhu 94 oC selama 5 menit, selanjutnya
diikuti dengan 35 siklus PCR yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94 oC selama
30 detik, annealing pada suhu 55oC selama 30 detik dan extention pada suhu 72oC

Universitas Sriwijaya
selama 45 detik, setelah 35 siklus terlampaui, dilakukan post PCR pada suhu 72oC
selama 5 menit dan di simpan pada suhu 20oC (Sepriana et al., 2017).

2.4. Elektroforesis dan Visualisasi gen 16S rRNA

DNA yang telah diamplifikasi, diseparasi dengan elektroforesis gel agarosa
1%, selanjutnya dilakukan visualisasi menggunakan pewarna etidium bromida
dan dideteksi dengan sinar UV pada UV-transiluminator. Sampel hasil PCR 5µl,
dicampur dengan loading dye 2 µl di atas kertas parafilm. Campuran sampel
dimasukkan ke dalam sumur gel agarose 1% ke dalam chamber elektroforesis
yang terendam larutan buffer TAE. Salah satu sumur diisi dengan marker NA
10.000 pb sebanyak 7 µl. Power supply dinyalakan selama 60 menit, 100 volt.
Hasil elektroforesis dilihat dengan menggunakan Gel Doc., foto dibawah sinar
UV. Pola ditentukan dari hasil foto (Tanumihardja et al., 2017).

2.5. Pemilihan gen 16S rDNA sebagai Target Sekuensing

Gen pengkode rRNA adalah gen yang mampu mempertahankan
kelestariannya selama jutaan tahun keanekaragaman evolusi. Sebagian besar
prokariot memiliki 3 jenis rRNA, yaitu 5S, 16S dan 23S. Gen 16S dan 23S rRNA
memiliki ukuran yang cukup untuk dianalisis. Gen 16S rRNA berukuran sekitar
1550 pasang basa dan sekitar 500 basa di bagian ujung sekuens merupakan daerah
yang disebut dengan hypervariable region. Daerah ini merupakan bagian yang
membedakan antar organisme (Rinanda, 2011).

2.6. Sekuensing dan Analisis Sekuen DNA

Sekuensing dilakukan dengan piranti Automated DNA Sequencer ABI
PRISM 377. Cycle sequencing DNA template dilakukan menggunakan kit BigDye
Ready Reaction Mix. Campuran cycle sequencing terdiri atas 1 µl atau 300-500 ng
DNA template, 3,2 pmol primer, 1 µl DMSO, 6 µl BigDye Ready Reaction Mix,
dan nuclease free water untuk menggenapkan volume menjadi 20 µl. Proses cycle
sequencing dilakukan pada mesin sequencer dengan kondisi pre-PCR pada suhu
94o C selama 5 menit (Aris et al., 2013).

Universitas Sriwijaya
 BAB 3
METODE PRAKTIKUM

3.1. Waktu danTempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 3 April 2018 pukul
10.00 WIB sampai dengan 12.00 WIB. Bertempat di Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Sriwijaya, Indralaya.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu komputer dan printer.
Sedangkan bahan yang digunakan yaitu web browser seperti Opera atau Internet
Explorer dan hasil sequensing gen 16S rRNA dalam format text.

3.3. Cara Kerja

Di buka Web Browser Anda pada komputer yang terhubung ke internet. Di
masuk ke Web berikut http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp . Klik kolom ungu yang
bertuliskan Sequence Match. Copy hasil sequnensing berupa urutan basa dari gen
16S-rRNA atau dalam format teks, dan paste pada kotak yang tersedia yang
berada di bawah tulisan Cut and paste sequence(s) (in Fasta, GenBank, or EMBL
format. Klik Submit tunggu proses berjalan dan beberapa saat akan muncul hasil
identifikasi berupa genus atau spesies mikroba yang mempunyai urutan basa gen
16S-rRNA yang diidentifikasi. Klik view selectable macthes untuk melihat
kekerabatan mikroba yang diidentifikasi dengan jenis-jenis yang ada pada
ribosomal database prohect (RDP). Angka yang diblok warna kuning
menunjukkan hubungan kekerabatan, angka 1 menunjukkan kesamaan 100%.

Universitas Sriwijaya
 BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil sebagai
berikut.

Universitas Sriwijaya
4.2. Pembahasan
Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan mengenai sekuensing gen
16S-rRNA didapatkan hasil bahwa praktikkan kelompok tiga mendapatkan
spesies bakteri berupa Klebsiella pneumonia. Percobaan ini dilakukan dua kali
menggunakan dua situs website diantaranya http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp dan
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Namun untuk mencari sequensing yang di
duga spesies jamur lebih disarankan menggunakan website
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Sebab, dapat lebih akurat daripada
menggunakan website yang pertama, persentase yang paling besar adalah 50%
dimana spesies yang didapatkan pun berbeda dengan hasil dari website kedua.
Bakteri Klebsiella pneumoniae memiliki enzim urease dan enzim sitrat
permiase. Klebsiella juga mampu memproduksi enzim ESBL atau Extended
Spektrum Beta Lactamase yang dapat melumpuhkan kerja berbagai jenis
antibiotik. Hal ini menyebabkan bakteri kebal dan sulit dilumpuhkan.
Klebsiella pneumoniae dapat menyebabkan pneumonia. Menurut
Elfidasari et al. (2013), Klebsiella pneumonia terdapat dalam feses dan saluran
napas sebanyak 5% pada orang normal. Klebsiella pneumonia merupakan salah
satu bakteri gram negative.
Gen 16S rRNA berupa RNA ribosomal yang paling banyak digunakan untuk
mempelajari keanekaragaman mikroorganisme. Terdapat tiga jenis RNA
ribosomal, 5S, 16S, dan 23S rRNA. Menurut Pangastuti (2006), 16S rRNA
sebagai penanda molekuler bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada
seluruh organisme sehingga dapat dirancang suatu primer yang universal untuk
seluruh kelompok. Molekul ini juga dapat berubah sesuai jarak evolusinya,
sehingga dapat digunakan sebagai kronometer evolusi yang baik. Berbeda dengan
5S-rRNA yang memiliki urutan basa terlalu pendek sehingga tidak ideal dari segi
analisis statistika, sementara molekul 23S-rRNA memiliki struktur sekunder dan
tersier yang cukup panjang sehingga menyulitkan analisis.
Berdasarkan praktikum yang dilakukan, software yang digunakan berupa
Ribosomal Database Project atau RDP dan juga NCBI yang dapat diakses melalui
link yang telah diberikan. Hasil dari sekuens DNA disesuaikan dan dicocokkan
dengan database yang tesimpan dalam software. Menurut Rinanda (2011), ribuan

Universitas Sriwijaya
sekuens dari berbagai isolat klinis dan dari lingkungan telah terkumpul di satu
database yaitu National Center for Biotechnology Information atau NCBI dan
Ribosomal Database Project atau RDP. Database ini juga menyediakan aplikasi
yang dapat digunakan untuk membandingkan sekuens yang diperoleh dengan
sekuens yang telah terdaftar di database tersebut.
Gen yang mengkode 16S rRNA disebut juga sebagai 16S rDNA dan
digunakan dalam merekonstruksi filogeni. 16s rRNA merupakan salah satu
penyusun subunit 30S, yang penting untuk translasi, dan terdiri dari 1542
pasangan basa. Menurut Nurkanto dan Andria (2015), gen 16S rRNA bersifat
multi copy karena terdapat sekitar 150-300 copy di dalam genom.gen 16S rRNA
adalah gen non fungsional dan bersifat lebih konservatif karena evolusi berjalan
lambat.
Database yang dapat digunakan untuk membandingkan sekuens 16S rRNA
selain RDP dan NCBI antara lain Ribosomal Database Project European
Molecular Biology Laboratory, Smart Gene IDNS dan Ribosomal Differentiation
of Medical Microorganisms. Menurut Rinanda (2011), beberapa database yang
dapat digunakan untuk membandingkan sekuens 16S rRNA antara lain GenBank
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, Ribosomal Database Project atau RDP-II
http://rdp.cme.msu.edu/html/, Ribosomal Database Project European Molecular
Biology Laboratory atau http://www.ebi.ac.uk/embl/, Smart Gene IDNS atau
http://www.smartgene.ch dan Ribosomal Differentiation of Medical
Microorganisms atau RIDOM dan atau http://www.ridom.com/.
Aplikasi yang digunakan untuk melakukan komputasi data untuk menyimpan,
mengolah, menganalisis, serta menyebarkan informsi biologi disebut dengan
bioinformatika. Bioinformatika sangat penting karena menyimpan data gen dari
DNA. Menurut Utama (2003), dengan adanaya bioinformatika, data-data yang
dihasilkan dari genome project untuk berbagai keperluan, baik keperluan
penelitian maupun keperluan di bidang medis dapat disimpan dengan teratur
dalam waktu singkat dan akurasi yang tinggi serta sekaligus dianalisa dengan
program-program yang dibuat untuk tujuan tertentu. Bioinformatika juga
mempercepat penyelesaian genome project karena bioinformatika mensuplai
program-program yang diperlukan untuk proses pembacaan genom.

Universitas Sriwijaya
 BAB 5
KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan diperoleh kesimpulan

sebagai berikut.
1. Hasil yang didapatkan dari kedua website yang diuji coba berbeda tingkat
persentasenya.
2. Spesies yang didapatkan dari hasil sekuensing gen ini berupa bakteri
Klebsiella pneumonia.
3. Karakterisasi DNA termasuk dalam tahap identifikasi karena masing-masing
bakteri memiliki karakter yang berbeda-beda.
4. Gen 16S rRNA penting digunakan karena memiliki sifat yang universal serta
kestabilan yang tinggi.
5. Penggunaan RDP secara online penting karena dapat mempermudah
identifikasi.

Universitas Sriwijaya
 DAFTAR PUSTAKA

Aris, M., Sukenda, Enang H. , M. Fatuhcri S. , Munti Y. 2013. Identifikasi

molekular bakteri patogen dan desain primer PCR (Molecular identification
of pathogenic bacteria and PCR specific primer design). Budidaya
Perairan. 1(3): 43-50.

Elfidasari, D., Nita, N., Anita, M., Aishah, F. dan Siti, F. C. 2013. Deteksi Bakteri
Klebsiella pneumonia pada Beberapa jenis Rokok Konsumsi Masyarakat.
Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains dan Teknologi. 1(2): 41-47.

Nurkanto, A dan Andria, A. 2015. Identifikasi Molekular dan Karakterisasi

Morfo-Fisiologi Actinomycetes Penghasil Senyawa Antimikroba. Jurnal
Biologi Indonesia. 11(2): 195-203.

Pangastuti, A. 2006. Definisi Spesies Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa Gen

Penyandi 16S rRNA dan Gen Penyandi Protein. Biodiversitas.
7(3): 292-296.

Rinanda, T. 2011. Analisis Sekuensing 16s Rrna Di Bidang Mikrobiologi. Jurnal

Kedokteran Syiah Kuala. 11(3): 172-177.

Sepriana, C., Dwi S. D. J., Lalu Z. 2017. Bakteri Endofit Kulit Batang Tanaman
Cengkeh (Syzygium Aromaticum L.) Dan Kemampuannya Sebagai
Antibakteri. Jurnal Penelitian Pendidikan Ipa (Jppipa). 3(2): 52-59.

Tanumihardja, C. A. N., Billy K., Widhi B. 2017. Identifikasi Bakteri Resisten

Merkuri Menggunakan Metode 16SrRNA terhadap Plak Gigi pada Pasien
Pengguna Tumpatan Amalgam. Jurnal e-Biomedik. 5(2): 1-7.

Utama, A. 2003. Peranan Bioinformatika dalam Dunia Kedokteran. Artikel

Populer Ilmu Komputer. ISBN: 978-602-61599-6-0.

Universitas Sriwijaya
 LAMPIRAN

(Sumber : Dokumen Pribadi 2018)

(Sumber : Dokumen Pribadi 2018)

Universitas Sriwijaya