Pendahuluan
Pseudomonas aeruginosa adalah ciprofloxacin dan atau levofloxacin) dan
salah satu dari enam bakteri patogen,
Enterococcus faecium, Staphylococcus
aureus, Klebsiella pneumoniae,
Acinetobacter baumannii, Pseudomonas
aeruginosa, dan Enterobacter sp., yang
umumnya terkait dengan resistensi
antimikroba, dan dilambangkan dengan
singkatan ESKAPE(Ciofu and Tolker-
Nielsen, 2019). Penyebab terjadinya
resistensi bakteri dikarenakan penggunaan
antibiotik yang tidak teratur(Kresken et al.,
2020). Multi Drug Resistant (MDR)
merupakan penyebab utama komplikasi
dalam terapi penyakit menular (El mekes et
al., 2020).
Definisi MDR menurut European
Center for Disease Prevention(ECDC) dan
Center for Disease Control and
Prevention(CDC) adalah ketidaksensitifan
suatu bakteri terhadap setidaknya satu agen
dengan tiga atau lebih kategori antibiotik
(BABCHINSKII, 1963). Pemeriksaan
laboratorium pada pasien dewasa klinik
paru, The Jordan University Hospital (JUH)
menunjukkan bahwa presentase P.
aeruginosa sebanyak 21,5% dari 284 sampel
diperiksa.(Al Dawodeyah et al., 2018).
Kasus MDR P.aeruginosa ditemukan pada
tahun 2015 sebanyak 52,5% di klinik paru
(Al Dawodeyah et al., 2018). P. aeruginosa
resistant terhadap salah satu golongan
antibiotic yaitu carbapenem yang dapat
menyebabkan infeksi penyakit pada manusia
( Stout and Malani, 2020)
Resistensi terhadap karbapenem
didefinisikan sebagai resistensi terhadap
imipenem dan atau meropenem. Pola
resistensi isolat resisten karbapenem
dievaluasi dengan mempertimbangkan
subkelas obat antibakteri tambahan sebagai
berikut: piperasilintazobaktam, seftazidim,
fluoroquinolon (resistansi terhadap
aminoglikosida (resistensi terhadap amikasin
dan atau tobramycin) (Kresken et al., 2020).
Pasien dengan infeksi yang disebabkan oleh
bakteri MDR memiliki resiko yang lebih
buruk karena sifatnya yang sulit pengobatan
dan kemungkinan kematian yang tinggi.
Diperlukan adanya solusi antibitotik
yang bersumber dari alam dengan daya
kerja optimal dan realtif lebih aman.
Memanfaatkan organisme laut yang
menjadi sumber produktif metabolit
sekunder dengan kandungan bioaktif yang
dapat digunakan sebagai rujukan dalam
pengembangan bidang farmasi(Madilana et
al., 2018). Jenis orgaisme laut yang banyak
dijumpai di Laut Indonesia adalah terumbu
karang. Salah satu jenisnya adalah Karang
Porites sp yang dapat ditemui di pantai
Gosong, Rembang Jawa Tengah.
Bakteri yang bersimbion dengan
Karang Porites sp memiliki senyawa aktif
yang dapat digunakan sebagai antimikroba
sama seperti di inangnya. Hal ini dapat
memberikan keuntungan karena selain tidak
mengeksploitasi ekosistem laut, bakteri yang
bersimbion dengan Karang Porites sp dapat
dimanfaatkan sebagai antimikroba. Karang
Porites sp yang diambil di Perairan Gunung
Kidul, Jawa Tengah dapat digunakan
sebagai antibakteri pathogen Sthapylococcus
aureus dan Escherichia coli(Madilana et al.,
2018).
Isolat bakteri yang berasosiasi dengan
Karang Porites sp yang dapat berpotensi
sebagai antibakteri Carbapenem Resistant
Pseudomonas aeruginosa (CRPA) maka
dilanjutkan dengan proses Polymerase
Chain Reaction (PCR). PCR 16S rRNA
digunakan untuk memberikan gambaran
mengenai bakteri simbion karang untuk
mengestimasi keanekaragaman genetik
bakteri karang, serta mengetahui hubungan
 kekerabatan filogenetik bakteri yang
berpotensi sebagai antibakteri (Madilana et
al., 2018) Analisi gen penyandi 16S rRNA
digunakan sebagai penanda molekuler
karena bersifat ulkubitus (keadaan yang
selalu dipertahankan dalam kondisi
apapun) dengan fungsi identik pada semua
bakteri. Gen 16S rRNA memiliki daerah
urutan basa yang konservatif dan juga ada
yang variatif. Perbandingan urutan basa
bagian konservatif digunakan untuk
mengkonstruksi pohon filogenetik
universal, sedangkan urutan basa variatif
digunakan untuk melacak keanekaragaman
dan menempatkan berbagai strain dalam
satu spesies (Friskayanti et al., 2018;
Saputra, 2019) .
Penelitian ini merupakan peneltian
mengenai keanekaragaman laut yang
masih jarang dieksplorasi oleh manusia
sebagai alternatif antibiotik penyebab
terjadinya resistensi pada P. aeruginosa
yang dapat menimbulkan masalah yang
lebih besar bahkan dapat menyebabkan
tingkat kematian yang tinggi. Sehingga
perlu dilakukannya penelitian untuk
mengetahui potensi bakteri simbion
Karang Porites sp sebagai antibakteri
(CRPA).
Bahan danMetode
Jenis penelitian merupakan penelitian
deskriptif eksperimental yang didukung
dengan studi pustaka. Penelitian dilakukan
dengan pelaksanaan isolasi bakteri yang
berasosiasi dengan Karang Porites sp dan uji
aktivitas antibakteri dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi, sedangkan
pelaksanaan isolasi DNA genom bakteri dan
PCR dilakukan di Laboratorium Biologi
Molekuler Analis Kesehatan Fakultas Ilmu
Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang.
Peralatan yang digunakan untuk uji
antibakteri adalah autoclave (HMC
Hirayama HICLAVE HVE-50), inkubator
(WTC Binder), Laminar air flow cabinet
(Labconco Purifier Class II Biosafety
Cabinet), lemari es (Sharp). Tabung reaksi,
cork borer (10 mm), ose, neraca analitik, rak
tabung, beaker glass, mortar, erlenmayer,
mikropipet, tip, cawan petri, spirtus, korek
api, wrap, spektrofotometer (nanodrop),
sentrifuge, vortex, mesin
PCR(thermalcycler), elektroforesis
chamber, UV transluminator.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah Karang Porites sp, subjek uji dalam
penelitian ini adalah bakteri P.aerugionosa.
Bahan yang digunakan untuk kultur bakteri
adalah media ZoBell 2216E, media uji
aktivitas antibakteri dan MHB (Mueller
Hinton Broth), media penyubur BHI (Brain
Heart Infusion), MC (Mac Conkey), standart
McFarland, dan NaCl fisiologi, Antibiotik
Vancominym dan Oxacilin sebagai control.
Bahan yang digunakan untuk isolasi DNA
isolat PRbg3 dan PRbg4 adalah ddH2O, Kit
Presto TM Mini gDNA Bacteria. Bahan
yang dibutuhkan saat proses PCR adalah
Master Mix (dNTPs, Taq Polymerase,
MgCl2, buffer PCR), Forward 27F, primer
Reverse 1492R. Bahan yang digunakan saat
elektroforesis gel adalah agarose 2%, marker
1500bp, Phospate Buffer Saline (PBS),
biology molecular agarose marker, loading
dye, fluorescence, buffer Tris-Acid EDTA
(TAE), Nuclease-Free water (ddH2O).
Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Isolasi bakteri simbion Porites sp dilakukan
dengan pengenceran betingkat yaitu
pengeceran 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dengan
menggunakan air laut steril. Tujuan
dilakukan pengenceran untuk mengurangi
kepadatan saat mikroorganisme
ditumbuhkan pada media Zobell 2216E.
hasil pengenceran kemudian disebar pada
pada media Zobell 2216E dan di inkubasi
suhu 35 ±2°C selama 48 jam untuk
mendapatkan biakan bakteri yang
berasosiasi dengan Karang Porites sp.
Selanjutnya dilakukan identifikasi morfologi primer 27F sebanyak (2ul) dan primer
koloni, purifikasi bakteri pada media Zobell 1492R sebanyak (2ul), template DNA (1ul),
2216E baru dan pewarnaan Gram. dan ddH2O (7,5ul). Kemudian dimasukkan
Prosespurifikasi bakteri sebaiknya dilakukan kedalam tabung ependrof. . Tahapan awal
minimal 3 kalisehingga menghasilkan jenis pada proses PCR dengan alat thermal cycler
koloni bakteri yang konsisten dan tidak adalah tahap denaturasi memerlukan suhu
bercampur dengan kolni bakteri lain yang tinggi yaitu 94oC selama 30 detik,
(Safitri,2018). annealing dengan suhu 55oC selama 30
detik, ekstensi awal memerlukan waktu 1
Uji Aktivitas Antibakteri PRbg4 menit dengan suhu 72oC, ekstensi akhir
Terhadap CRPA dengan waktu 5 menit pada suhu 72oC, pada
tahap cooling down memerlukan suhu 4oC.
Uji aktivitas antibakteri
Siklus amplifikasi terjadi sebanyak 35 siklus
menggunakan metode overlay (Radjasa dan
(Ethica et al., 2018). Ekstrak DNA genom
Sabdono, 2006). Setiap satu ose bakteri
diamplifikasi menggunakan PCR
simbion laut ditanam pada cawan petri
berdasarkan gen 16S rRNA. Hasil
(berisi media zobell 2216E) dalam setiap
amplifikasi PCR kemudian dilakukan
cawan petri dibentuk 2-5 bulatan kecil.
elektroforesis menggunakan gel agarose
Kemudian cawan petri di inkubasi selama 24
2%. Tangki elektroforesis yang sudah diisi
jam, penanaman bakteri uji CRPA dilakukan
dengan larutan TAE 1X kemudian
satu hari sebelum overlay, bakteri uji CRPA
dimasukkan gel agarose 2% kedalam tangki.
sebelumnya di lakukan penanaman pada
Pipet loading dye sebanyak 1ul dan
media MC di inkubasi selama 24 jam,
tambahkan 4ul sampel kemudian resuspensi.
setelah bakteri uji tumbuh dalam waktu 24
Pipet seluruh campuran larutan tersebut
jam dibuat suspensi standar McFarland (0,5
dengan menggunakan mikropipet lalu
x 10⁸ cfu/ml) diambil 1 mL (1% dari total
masukkan kedalam well pada gel agarose
volume soft agar) dan dimasukkan ke dalam
2%. Pipet marker 5ul lalu masukkan pada
9 mL soft agar media MHB (Muller Hinton
well agarose 2%. Hubungkan tangki
Broth) kemudian di tuang pada cawan petri
elektroforesis dengan power supply, lakukan
yang berisi biakan isolat bakteri simbion
running dengan tegangan 100 volt. Tunggu
laut, kemudian diinkubasi selama 24 jam
selama ± 1 jam kemudian lakukan
dan diamati perkembangan aktivitas bakteri
pembacaan pada UV transluminator.
yang menghambat berbentuk zona bening.
PCR 16S rRNA dan elektroforesis Gel Sekuensing
2%
Produk hasil gen 16S rRNA
Isolat bakteri PRbg4 yang telah
dilanjutkan proses skeunsing. Hasil
diisolasi DNA genom bakteri dilakukan
sekuensing DNA bakteri dianalisis dan
proses Polymerase Chain Reaction (PCR)
dicocokkan dengan data yang tersedia pada
untuk melakukan sintesis dan amplifikasi
Gen Bank Basic Lokal Aligment Search Tool
DNA secara in vitro. Primer yang digunakan
(BLAST) pada NCBI.
adalah primer universal 27F (5’-
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) dan Hasil
Reserve(5’- Preparasi Sampel
CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’). Reaksi
PCR yang digunakan pada penelitian ini Pada penelitian ini dilakukan
adalah Go Taq Green Master Mix (12,5ul), pencucian sampel Karang Porites sp dengan
menggunakan air laut steril, agar pengotor 27F dan primer Reverse 1492R dengan
pada Karang dapat dihilangkan. Kemudian besaran produk sebesar 1500bp. Hasil
dilakukan pengeceran pada sampel, dengan amplifikasi dari PCR dilakukan proses
tingkat pengenceran 10-1-10-4 dituang hasil elektroforesis gel 2%. Hasil yang didapatkan
pengenceran dari sampel Karang Porites sp memiliki ukuran marker sebesar 1437bp.
yang ditanam pada media Zobell 2216E.
Berikut Hasil Elektroforesis Gel 2%:
Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Sekuensing
Hasil isolasi dan identifikasi bakteri
diperoleh 8 koloni yang berbeda yaitu Proses sekuensing dilakukan oleh
dengan kode PRbg1, PRbg2, PRbg3, PT. Genetika Science Indonesia berlokasi di
PRbg4, PRbg5, PRbg6, PRbg7, PRbg8. Tangerang. Program yang digunakan untuk
menganalisa bioinformatika adalah Basic
Tabel 1. Hasil Identifikasi Morfologi Sel Local Aligment Search Tool (BLAST)
Bakteri dengan consesnsus sekuens Forward dan
Reverse. Hasil pemetaan pasang basa
No Kode Sampel Pengecatan
selanjutnya dianalisis pada Gen Bank
1. PRbg1 Coccus Gram- Positive
2. PRbg2 Bacill Gram- Negative menggunakan BLAST. Hasil hubungan
3. PRbg3 Bacill Gram- Negative kemiripan terdekat dengan isolat PRbg4
4. PRbg4 Coccus Gram- Positive dapat dilihat pada Gambar 10 sebagai
5. PRbg5 Coccus Gram- Positive berikut:
6. PRbg6 Coccus Gram- Positive
7. PRbg7 Bacill Gram- Negative Urutan basa nitrogen yang diperoleh
8. PRbg8 Bacill Gram- Negative memiliki tingkat kemiripan 91,82% dengan

Uji Aktivitas Antibakteri

Tabel 2. Zona Bening Aktivitas Antibakteri
Kode Isolat Gambar Indeks
PRbg4

fragmen gen 16S ribosomal RNA isolat

Isolat bakteri PRbg4 pada uji
aktivitas antibakteri dengan media Zobell
2216E terdapat zona bening disekitar koloni
sebesar 15,25mm. Termasuk dalam kategori
kuat.
PCR 16s rRNA dan Elektroforesis Gel
2%
DNA Genom bakteri yang telah dilakukan
isolasi dilakukan proses amplifikasi PCR
gen 16S rRNA sebagai DNA template.
Primer yang digunakan adalah primer
universal gen 16S rRNA primer Forward
bakteri Staphylococcus sp strain YNA 104-
2( Genbank kode akses: JQ071517.1).
Diskusi
Penelitian diawal dengan isolasi
bakteri simbion Karang Porites sp
menggunakan media Zobell Marine Agar
2216E sehingga menghasilkan isolat bakteri
murni dengan kode PRbg1, PRbg2, PRbg3,
PRbg4, PRbg5, PRbg6, PRbg7, PRbg8.
Dilakukan pengamatan karakteristik
morfologi koloni bakteri dengan melihat
bentuk, ukuran, warna, tepian, elevasi, dan
konsistensi pada koloni, kemudian dilakukan
uji aktivitas antibakteri dengan
menggunakan metode overlay. Isolat bakteri
ditumbuhkan pada media Zobell Marine
Agar 2216E sebanyak 4 isolat pada satu
cawan petri, kemudian di inkubasi selama 48
jam dengan suhu ±35oC. Komposisi utama
Zobell Marine Agar 2216E adalah 0,5%
pepton, 0,1% ekstrak ragi, 0,01% besi fosfat
dan 3% NaCl, dalam 1L media terkandung
NaCL sebanyak 35g/L(Asagabaldan et al.,
2019). Media Zobell Marine Agar 2216E
digunakan pada penelitian ini karena adanya
kandungan mineral dan garam yang meniru
komposisi air laut (Guria et al., 2020).
Media soft agar yaitu pencampuran MHB
dan agar-agar digunakan untuk uji aktivitas
antibakteri. Peremajaan bakteri progen pada
media MC, kemudian dibuat suspensi
bakteri sesuai standar Mc Farland sebanyak
1 mL dengan menggunakan NaCl Fisiologis.
Suspensi bakteri dimasukkan kedalam media
Media MHB yang bervolume 9mL,
kemudian dituang pada media Zobell Marine
Agar 2216E yang berisi isolat murni.
Inkubasi selama 24 jam pada suhu ±35oC.
Terdapat 4 kriteria daya hambat antibakteri
yaitu: menghambat lemah (<5 mm), sedang
(5-10 mm), kuat (10-20 mm) dan sangat
kuat (>20 mm) (Nugraheni et al., 2021).
Terbentuk zona bening di sekitar koloni
pada isolat bakteri PRbg4 sebesar 15,25mm
menujukkan bahwa isolat bakteri PRbg4
berpotensi sebagai antibakteri CRPA dengan
daya hambat kuat. Isolat bakteri PRbg4
dilakukan tahap selanjutnya yaitu proses
isolasi DNA dan identifikasi berbasis
molekuler
Isolasi DNA isolat bakteri PRbg4
menggunakan kit prosedur Presto tm Mini
GDNA Bacteria sehingga diperoleh DNA
bakteri yang kemudian diukur tingkat
kemurniannya dengan Spektrofotometer
Nanodrop. Berdasarkan hasil pengukuran
konsentrasi DNA PRbg4 yang diperoleh
mempunyai konsentrasi 1,86 ng/ul. Rasio
OD 260/280nm kurang dari 1,8
menunjukkan adanya kemungkinan ekstrak
DNA yang terkontaminasi protein.
Sedangkan tingkat kemurnian diatas 2,0
menunjukkan bahwa sampel DNA tidak
murni yang disebabkan oleh adanya sisa
ethanol atau sisa kandungan metabolit
sekunder bakteri (Fatchiyah et al., 2011).
Hasil ini menujukkan bahwa tidak terdapat
kontaminasi protein atau fenol dalam larutan
atau DNA yang didapat sudah murni.
Isolat DNA bakteri PRbg4 kemudian
dilakukan proses PCR untuk memperbanyak
segmen DNA. Konsentrasi DNA template
yang baik untuk dilakukan PCR adalah
150ng/ul (Mulyani and Purwanto, 2011).
Konsentrasi isolat DNA PRbg4 yang
diperoleh adalah 461.173ng/ul, maka perlu
dilakukan pengenceran sampel atau
pengurangan volume penggunaan DNA
template untuk PCR. setelah dilakukan
proses PCR untuk mengetahui besaran
produk yang dihasilkan sesuai dengan
marker yang digunakan dilakukan
Elektroforesis Gel 2%. Hasil amplifikasi
isolat DNA genom bakteri meunjukkan pita
DNA sejajar dengan marker pada nilai
±1500bp. Hasil amplifikasi yang diperoleh
kemudian dilakukan tahap sekuensing, dan
dianalisis secara bioinformatika pada situs
NCBI menggunakan BLAST.
Produk hasil sekuensing disebut
dengan basa anukleotida ditelurusi
kecocokannya dengan gen 16S rRNA yang
dimiliki oleh bakteri lain pada Gen Bank
Basic Local Alignment Search Tools
(BLAST). Hasil program BLAST
menunjukkan bahwa isolat PRbg4 memiliki
kemiripan dengan Staphylococcus sp strain
YNA 104-2 sebesar 91,82%. klasifikasi
bakteri Staphylococcus sp sebagai berikut:
Klasifikasi Staphylococcus sp menurut
(Rosebanch, 1884):
Kingdom :Bacteria
Phylum :Firmicutes
Class :Bacilli
Order :Bacillales
Genus : Staphylococaceae
Staphylococcus sp merupakan Genus
Bacillus, gram positif, bentuk sel bulat dan
motil. Hasil uji katalase positif dan oksidase
negatif, mampu memfermentasi laktosa dan
sukrosa, dan tumbuh optimum pada
temperatur 37ºC. Staphylococcus sp adalah
organisme anaerob fakultatif (mampu
tumbuh baik secara aerob maupun anaerob)
(Yulvizar, 2013). Staphylococcus bersifat
patogen melalui kemampuannya
berkembang biak dan menyebar secara luas
dalam jaringan. Bakteri patogen pada
dasarnya tidak bersifat toksik, akan tetapi
dapat menghasilkan berbagai enzim yang
bersifat toksik dan berperan dalam proses
infeksi (Sandycho, 2020). Staphylococcus sp
yang ditemukan pada sampel air laut yang
dikumpulkan dari area pelabuhan kapal dari
Pelabuhan Vizhinjam, Thiruvananthapuram
dan digunakan sebagai antifouling( bahan
pembersih dari tanaman/ hewan laut pada
bawah kapal) dengan kandungan metabolit
sekunder (Josphine et al., 2021).
Pada rumput laut Corallina
officinalisL.(Corallinaceae) ditemukan
adanya bakteri Staphylococcus sp yang
dapat mengambat pertumbuhan bakteri
Staphylococcus aureus (±11mm),
Escheriachia coli (±14mm), Schizo-
phyllumcommune (±13mm) (Khedr et al.,
2015). Staphylococcus sp ditemukan juga
pada sedimen laut dalam yang berasal dari
Teluk Benggala, India dan berpotensi
sebagai antimikroba dengan kandungan
metabolit sekunder. Stapylocccus strain
MB30 ditemukan sebagai spektrum luas
terhadap berbagai bakteri patogen manusia.
Metabolit bioaktif murni secara struktural
dijelaskan sebagai pirol (1, 2, a) pirazin 1,
4,dion, heksahidro 3-(2-metil propil)
(PPDHMP). Berat molekul PPDHMP
ditentukan sebagai 211(MH) dengan rumus
empiris pada C11H18N2O2. PPDHMP
ditemukan sebagai turunan peptida dari
cyclicdipeptide dan diketopiperazine.
Turunan peptida ini dilaporkan menghambat
produksi metabolit sekunder (aflatoksin)
yang sangat beracun, karsinogenik dan
teratogenik dari Aspergillus flavus dan
Aspergillus para-sitius (Lalitha et al., 2016)
Sehingga diharapkan kemampuan bakteri
genus Staphylococcus sp yang memiliki
metabolit sekunder dan dapat berpotensi
sebagai antibateri dapat dikembangkan lebih
baik di masa yang akan datang dan
dimanfaatkan dalam skala besar sebagai
sumber antibakteri.
Daftar Pustaka
Kresken, M., Körber-Irrgang, B., Korte-
Berwanger, M., Pfennigwerth, N.,
Gatermann, S.G., Seifert, H., 2020.
Dissemination of carbapenem-resistant
Pseudomonas aeruginosa isolates and
their susceptibilities to ceftolozane-
tazobactam in Germany. Int. J.
Antimicrob. Agents 55, 105959.
https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.20
20.105959
Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., 2019.
Tolerance and resistance of
pseudomonas aeruginosabiofilms to
antimicrobial agents-how P.
aeruginosaCan escape antibiotics.
Front. Microbiol. 10.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.009
13
El mekes, A., Zahlane, K., Ait said, L.,
Tadlaoui Ouafi, A., Barakate, M., 2020.
The clinical and epidemiological risk
factors of infections due to multi-drug
resistant bacteria in an adult intensive
care unit of University Hospital Center
in Marrakesh-Morocco. J. Infect. Public
Health 13, 637–643.
https://doi.org/10.1016/j.jiph.2019.08.0
12
BABCHINSKII, F. V., 1963. Osobennosti
Narusheni I Rechi Pri Dykhanii Pod
Izbytochnym Davleniem. Vestn.
Otorinolaringol. 25, 10–14.