Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

MIKROBIOLOGI
INDONESIA
Tersedia online di
http://jurnal.permi.or.id/index.php/mionline
ISSN 1978-3477, eISSN 2087-8575 DOI: 10.5454/mi.17.1.xx
Vol.17, No.1, Maret 2023, hal xx

Deteksi Cepat Bakteri Patogen Bawaan MakananVibrio parahaemolyticusdalam Makanan

Laut menggunakan GeneracunRdengan Metode Reaksi Berantai Polimerase Real-Time

ISMAYA KRISDAWATI1,2*, MUKTININGSIH NURJAYADI1,2, JEFFERSON LYNFORD DECLAN

1,2, GLADYS INDIRA PUTRI1,2, DANDY AKBAR JULIANSYAH1,2, MAHARANIAZKA

AZZAHRA1,2, IRWAN MAULANA1,2, IRMA RATNA KARTIKA1,2, VIRA SAAMIA3,DWI ANA

OKTAVIANI3, SAYA MEMBUAT WIRANATHA3, DAN HESHAM ALI EL-ENSHASY4,5,6
1Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Jakarta,
Gedung KH. Hasjim Asj'ari, Lantai 6, Jl. Rawamangun Muka, Jakarta Timur, 13220, Indonesia;
2 Pusat Penelitian Deteksi Bakteri Patogen, Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Kepada
Masyarakat, Universitas Negeri Jakarta, Jl. Rawamangun Muka, Jakarta Timur 13220, Indonesia;
3 Laboratorium Forensik Pusat Reserse Kriminal Kepolisian Negara Republik Indonesia,
Cipambuan Babakan Madang, Bogor, 1681, Indonesia;
4 Institut Pengembangan Bioproduk, Universiti Teknologi Malaysia (UTM), Skudai, Johor Bahru, Malaysia;
5Sekolah Teknik Kimia dan Energi, Fakultas Teknik, Universiti Teknologi Malaysia (UTM),
Skudai, Johor Bahru, Malaysia;
6Kota Riset Ilmiah dan Penerapan Teknologi, New Burg Al Arab, Alexandria, Mesir.

Kasus keracunan makanan seringkali terjadi akibat kontaminasi makanan yang disebabkan oleh bakteri patogen. Salah satu
bakteri patogen tersebut adalahVibrio parahaemolyticusyang ditemukan dalam makanan laut. Oleh karena itu, diperlukan metode
deteksi yang cepat, akurat dan spesifik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendeteksi dengan cepatVibrio parahaemolyticus
bakteri dalam sampel makanan laut menargetkanracunRgen menggunakan Real Time PCR. Dalam penelitian sebelumnya, PCR
gradien digunakan untuk mengoptimalkan rentang suhu anil ideal antara 53-62°C dan mengungkapkan bahwa 58°C memberikan
hasil terbaik untuk proses anil.racunRprimer dengan ukuran 171 pasangan basa. PCR Waktu Nyata digunakan untuk memperkuat,
menentukan, dan menguji sensitivitas dalam kondisi ideal dari Gradien PCR. Hasil konfirmasi menunjukkan bahwa pasangan primer
dapat teramplifikasiracunRdariVibrio parahaemolyticusdengan jumlah konsentrasi sebanyak 50 ng µL-1dengan Ct 10,69 dan 10,32
serta kurva leleh pada temperatur 82,18°C dan 82,23°C. Pasangan primer ini juga dapat membedakan bakteri nontarget dengan Ct
dan suhu kurva leleh yang berbeda. Uji sensitivitas primer ini dapat mengamplifikasi cetakan DNA pada konsentrasi 0,0032 ng µL-1.
Sampel udang yang terkontaminasi buatan masih dapat terdeteksi pada Ct 13.02 dan Ct 13.09. Berdasarkan hasil tersebut dapat
disimpulkan bahwa Real Time PCR denganracunR primer dapat diterapkan untuk mengembangkan kit deteksiVibrio
parahaemolyticusdalam makanan laut.

Kata kunci:Kit deteksi, penyakit bawaan makanan, PCR Real-Time,racunR,Vibrio parahaemolyticus

Kasus keracunan makanan sering terjadi karena kontaminasi makanan yang disebabkan oleh bakteri patogen.
Salah satu bakteri patogen adalahVibrio parahaemolyticusyang banyak ditemukan pada makanan laut. Oleh karena
itu, diperlukan metode pendeteksian yang cepat, akurat dan spesifik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mendeteksi bakteri secara cepatVibrio parahaemolyticuspada sampel makanan laut yang menargetkan gen racunR
menggunakan PCR Waktu Nyata. Dalam penelitian sebelumnya, gradien PCR digunakan untuk mengoptimalkan
suhu annealing ideal antara 53-62°C dan mengungkapkan bahwa 58°C menghasilkan hasil terbaik untuk primer
racunRdengan ukuran 171 pasang basa. PCR Real-Time digunakan untuk memperkuat, menentukan, dan menguji
sensitivitas di bawah kondisi ideal dari Gradien PCR. Hasil konfirmasi menunjukkan bahwa pasangan primer dapat
mengamplifikasiToxR Vibrio parahaemolyticusdengan jumlah konsentrasi sebanyak 50 ng µL-1dengan Ct 10,69 dan
10,32 dan kurva leleh pada suhu 82,18°C dan 82,23° C. Pasangan primer ini juga dapat membedakan bakteri non-
target dengan Ct dan suhu kurva leleh yang berbeda. Uji sensitivitas untuk primer ini dapat mengamplifikasi DNA
template pada konsentrasi 0,0032 ng µL-1. Sampel udang yang tercemar buatan masih dapat dideteksi pada Ct 13,02
dan Ct 13,09. Berdasarkan hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa Real Time PCR dengan primerracunRdapat
diterapkan untuk mengembangkan kit deteksi Vibrio parahaemolyticus pada makanan laut.

Kata kunci:Keracunan Pangan, Kit Deteksi,PCR Waktu Nyata, ToxR, Vibrio parahaemolyticus

Penyakit bawaan makanan merupakan salah satu tantangan
kesehatan masyarakat yang menyebabkan kematian setiap tahunnya
* Penulis koresponden: Telepon:+62-81517249667; Faks: +62-
21-4894909; Surel:muktiningsih@unj.ac.id
dunia. Penyakit ini berasal dari konsumsi makanan yang
terkontaminasi. Setiap orang berisiko terkena penyakit bawaan
makanan. Namun, beberapa orang mungkin berisiko lebih
besar mengalami gejala serius atau bahkan kematian (Bari dan
Ukuku 2016). 52,4% dari 208 kasus keracunan makanan
x KRSDAWATIDAN AL.
dilaporkan ke DKI Jakarta pada tahun 2016 disebabkan oleh
asupan makanan laut. (Mabruroh dan Ciptaningtyas 2018).
Vibrio parahaemolyticusmerupakan salah satu bakteri
patogen yang dapat menyebabkan penyakit bawaan makanan
pada makanan laut. Di lingkungan muara dan laut di seluruh
dunia, Vibrio parahaemolyticusmerupakan bagian alami dari
komunitas mikroba dan merupakan penyebab utama penyakit
bakteri yang terkait dengan konsumsi makanan laut. (Newton
dkk.2012). Metode budaya adalah salah satu dari beberapa
pendekatan yang telah diusulkan untuk diidentifikasi
V. parahaemolyticus(Duan dan Su 2005).Penting untuk
merancang cara baru yang cepat, sensitif, dan tepat
sasaran untuk mengidentifikasiVibrio parahaemolyticus
karena metode kultur mempunyai waktu pelaksanaan yang
lama dan sulit untuk menentukan batas sampel pada
konsentrasi rendah (Dorak 2006). Identifikasi bakteri pada
konsentrasi terendah dapat dilakukan dengan Real-Time
Polymerase Chain Reaction. Selain itu, hanya
membutuhkan waktu 2,5 jam, atau jika dipadukan dengan
persiapan sampel, PCR real-time dapat selesai dalam waktu
sekitar 5 jam. (Nurjayadidkk.2019).
ASalmonella typhikit deteksi denganfilm- C gen, yang
panjang produknya adalah 95 pasangan basa, berhasil
dikembangkan dalam penelitian sebelumnya.(Nurjayadi
dkk. 2017).Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
menciptakan alat deteksi yang tepat, perseptif, dan cepat
Vibrio parahaemolyticusdenganracunRgen menggunakan
PCR Real-Time. Suhu anil yang idealracunRgen telah
dioptimalkan pada suhu 58°C dengan ukuran 171
pasangan basa (Nurjayadidkk.2022). Berdasarkan
pengalaman sebelumnya dan tinjauan literatur, metode
deteksiVibrio parahaemolyticuss sebagai alat pendeteksi
yang cepat, sensitif, dan spesifik diharapkan dapat
dikembangkan.
BAHAN DAN METODE
Persiapan Sampel Kultur.Vibrio parahaemolyticus
ATCC 17802 di KWIK-STIK (Ahli Mikrobiologi, Minnesota)
dipekerjakan dalam penelitian ini.V. parahaemolyticus
selanjutnya dikultur dalam Thiosulfate Citrate Bile Sucrose
(TCBS)Agar (Merck) pada suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah
inkubasi, satu koloni diinokulasi ke Tryptic Soy Broth (TSB)+
NaCl 2,5% dan diinkubasi dalam inkubasi shaker (YIHDER
LM-400D) pada suhu 37ºC selama 24 jam dan 150 rpm.
Untuk sampel makanan yang terkontaminasi secara
artifisial,Vibrio parahaemolyticus inokulum kemudian
diencerkan pada suhu 10-1-10-7pengenceran dengan NaCl
0,85%. Media TCBS (Merck) digunakan untuk
menumbuhkan satu mL larutan 10 menggunakan spread plate
-10 pengenceran
-5 -7
metode dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam untuk menentukan
Mikrobiol Indonesia
jumlah koloni yang terkontaminasi sampel makanan.
Hasil koloni yang digunakan untuk kontaminasi buatan
adalah pengenceran sampel yang membentuk 30-300
koloni berdasarkan standar plate count FDA BAM (Food
and Drug Administration Bacteriological Analytical
Manual). CFU mL-1kemudian ditentukan berdasarkan
jumlah koloni.
Makanan Laut Terkontaminasi Secara Buatan dengan
Vibrio parahaemolyticus.Pertama, udangsampel direbus.
Sampel yang telah direbus kemudian digiling hingga halus
dalam plastik steril. Sampel dimasukkan ke dalam cawan petri
dan disinari sinar UV selama setengah jam. Setelah itu sampel
udang dipindahkan ke dalam labu Erlenmeyer steril dan
diinfeksi dengan suspensiVibrio parahaemolyticusdengan
perbandingan volume 8:2. Kontrol positif yang digunakan
berupa suspensi bakteri yang tidak encer untuk diinokulasikan
pada sampel udang, sampel pakan yang tidak terkontaminasi
digunakan sebagai kontrol negatif. Pada kecepatan 150 rpm,
inkubator pengocok orbital dari seri LM (Yihder Co. Ltd.)
digunakan untuk menginkubasi setiap sampel selama 24 jam
pada suhu 37ºC.
Isolasi DNA.SebelumIsolasi DNA, 1,5 mlVibrio
parahaemolyticuskultur bakteri dari TSB + NaCl 2,5%
disentrifugasi dengan kecepatan 5000 xg selama 10
menit. Kit Pemurnian DNA Genomic GeneJET Thermo
Scientific (ThermoFisher, 2012) dan Sistem Miniprep
Ekstraksi DNA Genomic Geno Plus (Viogene) digunakan
untuk mengisolasi DNA. Konsentrasi DNA hasil isolasi
ditentukan dengan menggunakanNanodrop (Nanovue
Plus), kemudian dikonfirmasi olehelektroforesis pada
gel agarosa 0,7% (NZYTech) dan diperiksa dengan
transilluminator UV (Vilber Lourmat).
Suhu Annealing OptimasiracunR Pasangan
Primer:Pasangan primer hasil sintesis kemudian
dioptimasi menggunakan Gradient PCR dengan
panjang suhu 53-62°C. Koktail PCR berisi Campuran
Master Tak Berwarna (NZYTaq),V. parahaemolyticus
genom sebagai templat DNA, Air Bebas Nuklease
TM
(Qiagen), racunR-f (primer maju) danracunR-r
(reverse primer) dengan total volume reaksi tunggal
25µL. Hasil optimasi dilanjutkan dengan 40 siklus
pada kondisi reaksi 95ºC selama 3 menit (denaturasi
awal), 95ºC selama 10 detik (denaturasi), suhu
annealing 53-62ºC selama 30 detik, 72 ºC selama 30
detik (ekstensi), dan 72 ºC untuk 7 menit
(perpanjangan terakhir) (SMOBIO 2017).
Vi brioparaha emo lyticus Ke x Ruji konfirmasi
gen.Uji konfirmasi darigetaran parahaemolyticus
dijalankan dalam Magnetic Induction Cycler qPCR
(sistem bio molekuler). Koktail PCR berisi qPCR
Master Mix dengan pewarna hijau SYBR
Jilid 17, 2023
Tabel 1 Desain percobaan fermentasi biji kakao
Sampel
V. parahaemolyticus DNA diisolasi
(Jalur 1 & 2)
V. parahaemolyticus DNA diisolasi
(Jalur 3 & 4)
(smobio),Vibrio parahaemolyticusgenom sebagai
templat DNA, Air Bebas Nuklease (Qiagen),racunR-f dan
racunR-r dengan volume total reaksi tunggal adalah
20µL. Untuk memverifikasi sinyal fluoresensi tidak
terkontaminasi oleh kontaminan apa pun; kontrol
negatif atau non-templat juga dijalankan. Sebagai
kontrol negatif, campuran PCR tidak mengandung
templat DNA apa pun. Kontrol positif adalah Salmonella
typhidenganfilmCprimer yang telah dipelajari
sebelumnya (Nurjayadidkk.2019). Kondisi siklus PCR
dilanjutkan dengan 40 siklus pada kondisi reaksi 95ºC
selama 3 menit (denaturasi awal), 95ºC selama 10 detik
(denaturasi), suhu annealing 58 ºC selama 30 detik, 72ºC
selama 30 detik (ekstensi), dan 72ºC selama 7 detik.
menit (perpanjangan terakhir) (UUdkk.2015).
Uji spesifisitas dan sensitivitas.Uji spesifisitas
pasangan primerracunR-f danracunR-r diuji dengan
bakteri non-target, seperti,Vibrio alginolyticus,
Cronobacter sakazakii, Listeria monocytogenes,
Yersinia enterocolitica, Salmonella typhi, Klebsiella
pneumoniae, Staphylococcus aureus. Sedangkan
untuk uji sensitivitas,Vibrio parahaemolyticusstok
kultur diencerkan untuk menetapkan batas deteksi
pasangan primer PCR Real-Time (LOD). Dengan
membuat grafik nilai Ct (Cycle ambang batas)
terhadap nomor salinan DNA plasmid, kurva standar
untukVibrio parahaemolyticusnomor salinan dibuat. (
Mirasoli 2011). Kondisi siklus PCR dijelaskan di atas.
Uji konfirmasi sampel makanan laut.Sebanyak 10
miligram udang terkontaminasi secara artifisial oleh
Vibrio parahaemolyticusbakteri digunakan sebagai
sampel cetakan DNA dalam campuran PCR; sedangkan
kontrol positif dari pengujian ini adalah Genom DNA
dari stok kulturVibrio parahaemolyticusbakteri hasil non
encer, dan kontrol negatif berupa cetakan DNA dari
udang yang tidak terkontaminasi sebagai sampel.
Campuran PCR dan kondisi siklusnya sama seperti
dijelaskan di atas.
HASIL
BudidayaV. parahaemolyticus.Bakteri aktif
Mikrobiol Indonesia x
Konsentrasi (ng µL-1) Kemurnian (A260/A280)
50 1,92
47 1,85
media selektifAgar Tiosulfat Sitrat Bile Sukrosa
(TCBS).menunjukkan terbentuknya koloni hijau pada
permukaan media TCBS (Gambar 1). Dalam suspensi
bakteri 10-6mencapai FDABAM (Panduan Analisis
Bakteriologis Administrasi Makanan dan Obat) -
koloni yang direkomendasikan. Dilaporkan ada 88
koloniV. parahaemolyticusmembentuk.
Analisis DNA Kualitatif dan Kuantitatif.
Kemurnian dan konsentrasi DNA diukur menggunakan
nanodrop (Nanovue plus) dengan hasil seperti
dijelaskan pada Tabel 1.Vibrio parahaemolyticusbakteri
berhasil diisolasi, seperti ditunjukkan pada Gambar 2.
Berdasarkan analisis elektroforesis isolat DNA,Vibrio
parahaemolyticus-Pita DNA spesifik terlihat di bagian
atas, lebih tinggi dari ukuran penanda 1 kb.
OptimalisasiracunRpasangan primer Suhu
Annealing.Sebelum pengujian Real-Time PCR, pasangan
primer dioptimalkan dalam kisaran suhu annealing
53ºC-62ºC. Hasil Gradient PCR kemudian divisualisasikan
menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa 2%. Optimasi ini
ditunjukkan pada Gambar 3, sedangkan kontrol positifnya
adalahCronobacter sakazakii, yang menghasilkan 151
pasangan basa. Pita amplifikasi dariracunRpasangan
primer berada pada suhu 171 bp, dan hasil suhu annealing
optimum berada pada suhu 58ºC.
Amplifikasi PCR Waktu Nyata.Uji konfirmasi dihasilkan
dari ituToxR-fDanToxR-rpasangan primer dapat menguatkan
Vibrio parahaemolyticusDNA pada Ct 10.32 dan 10.69, seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 4. Kurva leleh (Gambar 5) dari
Vibrio parahaemolyticusberada pada suhu 82,18ºC dan
82,23ºC. Kontrol non template diperkuat ct 33.11 dengan
perbedaan 23 siklus dan kurva leleh yang berbeda dengan
puncak rendah pada 82.34 ºC.
KekhususanDanUji Sensitivitas.Vibrio parahaemolyticus
isolat diencerkan sebanyak lima kali pengenceran. Pengujian ini
memberikan hasil bahwaVibrio parahaemolyticusTemplat DNA
masih dapat mendeteksi pada konsentrasi yang lebih rendah yaitu
0,0032 ng µL-1pada28.60(Gambar 6 dan Tabel 2) Kurva standar
memiliki nilai regresi R = 0,9969 dan persamaan y = -4.194 x +
2
18.68.racunR pasangan primer diuji dengan bakteri non-target
seperti yang disebutkan sebelumnya dan menunjukkan hasil yang
baik seperti ditunjukkan pada Gambar 7. Pasangan primer dapat
melakukan amplifikasi ke bakteri non-target
x KRSDAWATIDAN AL. Mikrobiol Indonesia

Gambar 1Vibrio parahaemolyticushasil budaya di TCBSAgar.

Gambar 2 Gel Elektroforesis Hasil Isolat DNAV. parahaemolyticus. Jalur 1. DNAMarker 1 kb Tangga. Jalur
2, 3, 4, 5. GenomVibrio parahaemolyticusBakteri.

Gambar 3 OptimasiVibrio parahaemolyticus ToxRfragmen gen dengan kisaran suhu anil 53-
62°C (1) DNAMarker 100 pasangan basa; (2) NFW+MM (Kontrol Negatif); (3) tidak; (4) Kontrol positif
grxB Cronobacter sakazakii; (5) Fragmen DNA pada suhu 53ºC; (6) Fragmen DNA pada suhu 54ºC;
(7) Fragmen DNA pada suhu 55ºC; (8) Fragmen DNA pada suhu 56ºC; (9) Fragmen DNA pada suhu
57ºC; (10) Fragmen DNA pada suhu 58ºC; (11) Fragmen DNA pada suhu 59ºC; (12) Fragmen DNA
pada suhu 60ºC; (13) Fragmen DNA pada suhu 61ºC; (14) Fragmen DNA pada suhu 62ºC; (15)
Tangga DNA 100 bp.

dengan selisih rentang jumlah of 17-21 siklus.DNA dan non- Uji Konfirmasi Sampel Makanan Laut. Sampel
target, bakteri memiliki kurva leleh yang berbeda (Gambar udang terkontaminasi buatan dan sampel udang
8 dan Tabel 3). kontrol negatif tidak terkontaminasi diperiksa
Jilid 17, 2023 Mikrobiol Indonesia x

Gambar 4 Kurva amplifikasi dari konsentrasi 50 ng DNA yang ditemplatV. parahaemolyticuskultur stok bakteri,
Kontrol positifSalmonella typhi, dan kontrol negatif NTC, NFW+MM.

Gambar 5V. parahaemolyticuskurva peleburan kultur stok dengan templat DNA 50 ng.

Gambar 3 Uji sensitivitas dan kurva amplifikasi untukToxR Vibrio parahaemolyticusgen.

kemudian dibandingkan dengan kontrol positif non-encer warna kehijauan pada media TCBS. Pada 10 koloni
pengenceran
-6

(Gambar 9).racunRpasangan primer dapat memperkuat bakteri terdapat 88 koloni, sehingga diperoleh jumlah
sampel udang diKt 13,02 dan Kt 13,09.Kurva Leleh pada kultur bakteri dalam satu mililiter : 88 x 10 CFU mL. Hasil
5

Gambar 10 menunjukkan bahwa kedua sampel memiliki suhu
leleh yang sama yaitu 82,28ºC dan 82,22ºC.
DISKUSI
BudidayaV. parahaemolyticus.Menurut (Bi
shadkk.2012) hasilnyaVibr io parahaemolyticus
koloni sesuai dengan memiliki ukuran bulat
dengan diameter 2-3 mm dan
-1
perhitungan ini akan digunakan untuk mengetahui
jumlah koloni bakteri yang terbentuk pada uji
konfirmasi menggunakan sampel makanan laut.
Analisis DNA Kualitatif dan Kuantitatif.
Syarat kemurnian isolat DNA yang baik adalah
1,8-2,0. Jika kurang dari 1,8 berarti masih terdapat
pengotor berupa RNA, dan jika lebih dari 2,0
berarti masih terdapat pengotor berupa RNA.
x KRSDAWATIDAN AL. Mikrobiol Indonesia

Tabel 2 Komponen fitokimia dari ekstrak etanol biji kakao fermentasi

Tabel 3 Temuan dari analisisracunRgenV. parahaemolyticusspesifisitas primer.

Gambar 7 Kurva amplifikasi untukVibrio parahaemolyticus ToxRspesifisitas primer gen.

protein (Wasdili dan Gartinah 2018). Pengukuran
konsentrasi dan kemurnian isolat kultur murni Vibrio
parahaemolyticusDNA menunjukkan hasil yang baik.
Vibrio parahaemolyticus- terlihat pita DNA spesifik
pada bagian atas, lebih tinggi dari ukuran penanda 1
kb, menunjukkan hasil sesuai dengan data ukuran
genom yaitu 3.288.558 bp (Markinodkk. 2003).
OptimalisasiracunRpasangan primer Annealing
Suhu.Faktor penting dalam Real-Time PCR adalah
optimasi suhu annealing untuk desain pasangan primer
(Green dan Sambrook 2019) Suhu annealing diatur
berdasarkan ± 5 ºC dariToxR-fDan ToxR-rHasil teoritis
pasangan primer yaitu ± 5 dari suhu 58 ºC dan juga 0 C
kurva leleh ini dapat dihitung dengan memasukkan
jumlah kandungan nukleotida pada rumus Tm= 4(G+C)
+ 2(A+T) (Innis 1997). Hasil Gradient PCR kemudian
divisualisasikan menggunakan 2%
Jilid 17, 2023 Mikrobiol Indonesia x

Gambar 8 Kurva leleh spesifisitas primerVibrio parahaemolyticus ToxRgen.

Gambar 9 Kurva amplifikasi dalam evaluasi konfirmasiracunRDasarVibrio parahaemolyticusdengan

sampel udang.

Gambar 10 Kurva Melting pada evaluasi konfirmasiracunRDasarVibrio parahaemolyticusdengan udang

sampel.

Elektroforesis Gel Agarosa. Optimasi ini menunjukkan hasil yang
baik seperti terlihat pada Gambar 2. Pita amplifikasi pasangan
primer ToxR berada pada 171 bp, dan hasil temperatur annealing
optimum berada pada 58 ºC. Pita tersebut umumnya memiliki
ketebalan pita yang konstan bila dianil pada suhu antara 53-62 ºC.
Berdasarkan pita paling terang, paling stabil, dan tunggal yang
muncul, yaitu pita primer
suhu annealing yang ideal dapat mengamplifikasi template
pada proses PCR antara 58-62 derajat celcius. Oleh karena
itu, jika digunakan bersamaan dengan analisis in silico,
maka suhu annealing yang paling ideal untuk prosedur PCR
adalah 58 derajat Celcius (Nurjayadidkk. 2022).
Amplifikasi PCR Waktu Nyata.Konfirmasi
x KRSDAWATIDAN AL.
pengujian dihasilkan dari ituToxR-fDanToxR-rpasangan primer
dapat menguatkanVibrio parahaemolyticus. semakin sedikit
jumlah siklus yang memerlukan sinyal fluoresen pertama kali
dicatat sebagai signifikan secara statistik di atas latar belakang
dan dengan demikian menurunkan nilai Ct. Hasil kurva leleh
menunjukkan tidak terjadi mis-priming yang berarti primer
hanya mengamplifikasi DNA target yang ditunjukkan dengan
terbentuknya satu puncak (Biorad 2006).
KekhususanDanUji Sensitivitas. Uji sensitivitas
memberikan hasil seperti ituVibrio parahaemolyticus Templat
DNA masih dapat mendeteksi pada konsentrasi yang lebih
rendah yaitu 0,0032 ng µL-1dengan LoD 0,00396 CFU mL-1di Ct
28.60(Gambar 6 dan Tabel 2). Kurva standar dapat
ditentukan dengan memanjangkan kurva amplifikasi
sebesar nilai sumbu x, dimana nilai sumbu y merupakan
konsentrasi sampel. Koneksi dan konsentrasi Ct kurva
dibuat. Kurva standar memiliki nilai regresi R = 0,9969 dan
2
persamaan y = -4.194 x + 18.68 atau nilai regresi yang
memiliki linearitas luar biasa (Dorak 2006).racunRpasangan
primer diuji dengan bakteri nontarget seperti yang
disebutkan sebelumnya dan menunjukkan hasil yang baik
seperti ditunjukkan pada Gambar 7. Pasangan primer
dapat melakukan amplifikasi ke bakteri nontarget dengan
rentang selisih jumlah of 17-21 siklus.yang dapat dianggap
sebagai kontrol negatif yang menyatakan bahwa jika siklus
antara bakteri target dan non target memiliki rentang 10
siklus yang berbeda, maka pasangan primer dianggap
dapat mengamplifikasi bakteri non target.(Nurjayadidkk.
2017). DNA dan nontarget, bakteri memiliki kurva leleh
yang berbeda (Gambar 8 dan Tabel 3). sehingga hasil kurva
leleh ini dapat menjadi acuan bahwa DNA non target dapat
dianggap sebagai kontrol negatif.
Uji Konfirmasi Sampel Makanan Laut.Hasil
penghitungan lempeng menunjukkan bahwa 10 sampel -6
pengenceran mempunyai 88 koloni. Hasil ini dipilih karena
mengikuti rekomendasi FDA BAM. Jadi, yang non-bakteri encer
yang terkontaminasi secara buatan dalam sampel makanan
adalah 88x10 CFUml-1. Sampel udang terkontaminasi buatan
dan sampel udang tidak terkontaminasi kontrol negatif
diperiksa kemudian dibandingkan dengan kontrol positif non-
encer (Gambar 9).racunRpasangan primer dapat memperkuat
sampel udang diBab 13.02 dan Bab 13.09.Kurva Leleh pada
Gambar 10, menunjukkan bahwa kedua sampel memiliki suhu
leleh yang sama dibandingkan dengan non-encer pada82,28ºC
dan 82,22ºC. Jadi, dapat dinyatakan bahwa konsentrasi Vibrio
parahaemolyticusterkontaminasi pada sampel udang2,04x10
-1
-1
CFU mL. Hasil ini dapat dinyatakan bahwa metode ini dapat
dikembangkan sebagai model alat deteksi untuk menentukan
bakteri patogen secara cepat, sensitif, dan spesifik serta
menunjukkan hasil yang akurat.
Mikrobiol Indonesia
PENGAKUAN
Penelitian ini didanai oleh Kemendikbudristek melalui
skema PDUPT berdasarkan perjanjian nomor kontrak 1/
PG.02.00.PT/LPPM/V/2022. Selain itu kami juga mengucapkan
terima kasih kepada PT Sinergi Indomitra Pratama yang telah
menyediakan instrumen untuk penelitian ini, Pusat
Laboratorium Forensik Kepolisian Negara Republik Indonesia
(Puslabfor Polri), Sentul Bogor Indonesia, yang telah
mendukung penelitian ini berdasarkan MOU antara UNJ dan
Puslabfor, serta seluruh tim Salmonella di Pusat Unggulan
Deteksi Bakteri Patogen (PUI Pendeteksi Bakteri Patogen)
LPPM UNJ atas kerja keras dan kontribusinya. Apresiasi kami
juga disampaikan kepada mitra internasional kami, IBD-UTM,
yang dukungannya sangat penting bagi seluruh upaya
kolaboratif.
REFERENSI
Bari L, Ukuku LAKUKAN. 2016. Patogen Bawaan Makanan dan Makanan
Keamanan. Di dalamPers CRC.
Bio-Rad. 2006. Panduan Aplikasi PCR Real-Time. Bio-
Laboratorium R dan L, I nc, hal. 1 1 . Alamat :
10.1016/j.mod.2004.07.009.
Dorak T. 2006. PCR Waktu Nyata. Di dalamTaylor dan Fransiskus
Kelompok(Jil.112). doi: 10.1016/B978-0-12-405914-
6.00003-2.
Duan J, Su YC. 2005. Perbandingan kromogenik
media dengan agar tiosulfat-sitrat-garam empedu-sukrosa
untuk mendeteksiVibrio parahaemolyticus. J Ilmu Makanan.
70(2):M125-M128.
Green MR, Sambrook J. 2019. Analisis DNA dengan agarosa
elektroforesis gel. Protokol Cold Spring Harbor,
2019(1), 6–15. Doi: 10.1101/pdb.top100388.
Innis MA. 1997. Optimalisasi PCR. Sains. Akademik
Pers, Inc, New York.
5
Hukum JW, Ab Mutalib NS, Chan KG, Lee LH. 2015. Ulasan.
Metode cepat untuk mendeteksi bakteri patogen bawaan
makanan: prinsip, aplikasi, kelebihan dan keterbatasan.
Perbatasan dalam Mikrobiologi. Jil. 5, 770. doi: 10.3389/
fmicb.2014.00770.
Mabruroh F, Ciptaningtyas R. 2018.Analisis Makanan
Keracunan di DKI Jakarta 2016 (Badan
Pengawasan Obat dan Makanan RI).9(PHICo
2017):28–35. Doi: 10.2991/phico-17.2018.23.
Makino K, Oshima K, Kurokawa K, Yokoyama K, Uda T,
Tagomori K, Iijima Y, Najima M, Nakano M,
Yamashita A, Kubota Y, Kimura S, Yasunaga T,
Honda T, Shinagawa H, Hattori M, Iida T. 2003.
Urutan genom Vibrio parahaemolyticus: patogen
Jilid 17, 2023
mekanisme yang berbeda dari V cholerae.
Lancet, 361(9359):743–749. doi:10.1016/s0140-
6736(03)12659-1.
Mirasoli, M. 2011. Ericka A. Pestana, Sandor Belak, Adama
Diallo, John R. Crowther dan Gerrit J. Viljoen (Eds.):
Diagnostik molekuler hewan yang dini, cepat dan
sensitif—aplikasi PCR waktu nyata. Kimia Analitik
dan Bioanalitik, 400(10), 3187–3188. doi: 10.1007/
s00216-011-4918-2.
Newton A, Kendall M, Vugia DJ, Henao OL, Mahon BE.
2012. Peningkatan angka vibriosis di Amerika
Serikat, 1996-2010: Review data surveilans dari 2
sistem.Penyakit Menular Klinis,54(SUPPL.5), 391–
395. Doi: 10.1093/cid/cis243.
Nurjayadi M, Krisdawati I, Putri GI, Declan JL, Juliansyah
DA, Azzahra M, Maulana I, Rahmawati AN, Kartika IR,
Kurniadewi F, Sukmawati D, Rahayu S, Saamia V,
Saputro DAO, Wiranatha IM, Enshay HE. 2022. Potensi
Gen ToxR Sebagai Alat Deteksi Vibrio
parahaemolyticusdalam Makanan Laut. Di: SMIC 2022.
Nurjayadi M, Pertiwi YP, Islami N, Azizah N, Efrianti UR,
Saamia V, Wiranatha IM, Nastassya L, El-Enshasye
Mikrobiol Indonesia x
HA. 2019. Deteksi bakteri Salmonella typhi pada telur yang
terkontaminasi menggunakan PCR real-time untuk
mengembangkan deteksi cepat bakteri keracunan makanan.
Biokatalisis dan Bioteknologi Pertanian,20. Doi: 10.1016/
j.bcab. 2019.101214.
Nurjayadi M, Santoso I, Kartika IR, Kurniadewi F, Saamia
V, Jadifihan W, Nurkhasanah D. 2017. Isolasi, Ampli
fikation dan Karakterisasi Gen Bakteri Penyakit
Patogen Makanan untuk Pengembangan Rapid Kit
Test. Dalam: Prosiding Konferensi AIP 1862 030077.
doi: 10.1063/1.4991181.
SMOBIO. 2017. Informasi Produk ExcelTaq Seri 2X
Campuran Utama Q-PCR (SYBR, ROX). Diterima dari.
www.smobio.com.
termofisher. 2012. Nomor Katalog Kit Isolasi DNA
761001D. Diterima dari.www.thermofisher.com.
Wasdili FAQ, Gartinah T. 2018. Penentuan Kualitas Isolasi
DNASalmonella Typhimuriumdengan Metode
Spektrofotometri dan Elektroforesis. Prosiding
Pertemuan Ilmiah Nasional Penelitian & Pengabdian
Masyarakat (PINLITMAS 1), 1(1), 578–583.