UJI KUANTITATIF BAKTERI METODE MPN

LAPORAN PRAKTIKUM
Untuk memenuhi tugas matakuliah Mikrobiologi yang dibimbing oleh
Dra. Sulistiastutik, M.Kes, I Komang Suwita, S.ST, MP, Retno Ikayanti, S.Farm, Apt,
Atik Kurniawati, S.Si

Disusun oleh:
Kelompok I / Kelas 2B
Dinar Novita Hutagalung (P17120193050)
Neta Destiana Fitrianingsih (P17120193054)
Melhida Najichah (P17120193056)
Nendy Dwi Musvita Rani (P17120194079)
Mochammad Reffieyanto A.K (P17120194080)
Shinta Firstly Nuzuliana (P17120194081)
Anke Afika Kontesa (P17120194082)
Ailsa Dwita Rifzikka (P17120194087)

POLTEKKES KEMENKES MALANG

JURUSAN GIZI
PRODI D3 ANAFARMA
APRIL 2021
 UJI KUANTITATIF BAKTERI METODE MPN

A. Topik : Uji kuantitatif bakteri metode MPN.

B. Tujuan : Untuk menghitung jumlah kuman E.coli dan Coliform dalam Sampel.

C. Tanggal praktikum : Rabu, 21 April 2021

D. Dasar teori
Mengkonsumsi produk pangan bermutu lebih menjamin keamanan pangan. Standar
mutu pangan yang dikeluarkan oleh SNI dapat membantu konsumen untuk menentukan
mutu produk pangan yang akan dibelinya. Standar mutu bahan pangan merupakan
pedoman yang dapat digunakan untuk berbagai kebutuhan, misalnya pemilihan bahan
pangan atau menghasilkan bahan pangan berdaya saing tinggi. Indonesia telah memiliki
standar mutu, yaitu standar yang dikeluarkan oleh Badan Standarisasi Nasional Indonesia
(SNI). Dengan penanganan yang tepat, Yaitu dengan menjaga higienitas ketika menangani
hati ayam, seperti selalu menjaga kebersihan kandang, memperhatikan kebersihan alat
pemotongan, membersihkan dan mencuci daging ayam hingga benar-benar bersih,
mencuci tangan sebelum dan sesudah menyentuh daging ayam, serta memasaknya hingga
benar-benar matang merata. Karena bakteri dapat mati dengan pemanasan diatas 60°C.
1. Bakteri
Istilah bakteri berasal dari kata : Bakterion (bahasa Yunani) yang berarti tongkat
atau batang. Kata bakteri ini sekarang banyak dipakai untuk tiap mikroba yang bersel
satu. Bakteri merupakan mikrobia uniseluler yang pada umumnya tidak mempunyai
klorofil. Mikrobia bersel satu ini ada beberapa yang fotosintetik dan reproduksi
aseksualnya secara pembelahan. Makhluk uniseluler ini tersebar luas di alam, di
dalam tanah, atmosfir, dalam endapan-endapan lumpur ; baik di laut maupun air,
pada sumber air panas, pada daerah antartika, tubuh hewan, manusia dan tanaman.
Kuman atau bakteri jumlahnya tergantung keadaan sekitar misalnya, jumlah bakteri
di dalam tanah tergantung jenis dan tingkat kesuburan tanah.
2. Bakteri Koliform
 Koliform adalah kelompok bakteri indikator untuk menentukan kualitas atau
mutu dari lingkungan air, tanah atau makanan. Kelompok bakteri ini berasal dari
sistem pencernaan binatang, termasuk manusia dan juga pada tinja. Makanan yang
kurang terjamin kebersihannya akan sangat mudah terkontaminasi. Kontaminasi
juga dapat terjadi jika penyimpanan makanan terlalu lama. Penyimpanan yang lama
akan menyebabkan tumbuhnya bakteri patogen seperti coliform. Bakteri coliform
merupakan mikroorganisme yang sering digunakan sebagai indikator untuk
menentukan suatu sumber air terkontaminasi patogen atau tidak. Bakteri coliform
dapat tumbuh dan berkembang biak pada suhu penyimpanan 7°C hingga 60°C
(Nurjanah, 2006). Bakteri koliform dapat dibedakan atas dua yaitu:
a. Koliform fekal, misalnya Escherichia coli. Escherichia coli merupakan bakteri
yang berasal dari kotoran hewan maupun manusia. Escherichia coli adalah grup
koliform yang mempunyai sifat dapat memfermentasi laktose dan memproduksi
asam dan gas pada suhu 37ºC maupun suhu 44,5ºC dalam waktu 48 jam.
Escherichia coli adalah bakteri yang termasuk dalam famili Enterobacteriaceae,
bersifat gram negatif, berbentuk batang dan tidak membentuk spora.
b. Koliform non fekal, misalnya Enterobacter aerogenes. Enterobacter aerogenes
biasanya ditemukan pada hewan atau tanaman-tanaman yang sudah mati.
Enterobacter aerogenes tidak dapat membentuk laktose pada suhu 44,5ºC.
(Syahputri, 2016).
3. Metode Most Probable Number (MPN)
Metode Most Probable Number (MPN) adalah suatu metode untuk menaksir
populasi mikrobial di lahan, perairan dan produk agrikultur. Metode ini digunakan
untuk menaksir populasi mikroba berdasarkan pada ukuran kualitatif spesifik dari
jasad renik yang sedang terhitung. Menetapkan adanya bakteri koliform dalam
contoh air dan memperoleh indeks berdasarkan tabel MPN untuk menyatakan
perkiraan jumlah koliform dalam sampel.
Metode Most Probable Number (MPN), merupakan metode perhitungan sel
terutama untuk perhitungan bakteri coliform berdasarkan jumlah perkiraan terdekat.
Perkiraan terdekat yaitu perhitungan dalam range tertentu. Dihitung sebagai nilai
duga dekat secara statistik dengan merujuk pada tabel MPN (Most Probable
Number) (Hartanti, 2015).
Metode Most Probable Number (MPN) menggunakan pendekatan
“pengenceran berganda hingga punah” telah dibuktikan sangat baik untuk
memperkirakan populasi mikroba, terutama jika mikroba ada dalam jumlah yang
sangat sedikit dalam makanan atau sampel air. Metode MPN didasarkan pada
pembagian sampel menjadi tiga macam pengenceran. Akurasi dari satu kali
pengujian tergantung dari jumlah tabung yang digunakan untuk tiap pengenceran.
Lazimnya, digunakan sistem 5 tabung atau 3 tabung untuk setiap pengenceran.
Informasi yang sangat memuaskan akan diperoleh apabila semua tabung dengan
pengenceran rendah menunjukkan pertumbuhan dan tabung-tabung dengan
pengenceran tinggi menunjukkan tidak adanya pertumbuhan.
Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam
contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh padat
dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut. Grup mikroba
yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium
yang digunakan untuk pertumbuhan. Metode MPN dapat digunakan untuk
menghitung jumlah mikroba jenis tertentu yang terdapat di antara mikroba-mikroba
lainnya. Sebagai contoh penggunaan Lactose Broth dan tabung Durham dapat
digunakan untuk menghitung jumlah bakteri yang dapat memfermentasi laktosa
membentuk gas, misalnya bakteri koliform. Prinsip dari metode ini adalah
fermentasi laktosa selama 24 jam oleh bakteri koliform yang akan menghasilkan
asam dan gas yang tertangkap oleh tabung Durham dalam tabung uji.
Metode MPN dilakukan dengan tahapan-tahapan sebagai berikut, yaitu:
a. Uji Pendugaan (Presumptive Test)
Medium yang digunakan adalah kaldu laktosa. Baketri koliform
menggunakan laktosa sebagai sumber karbonnya. Tes ini dikatakan positif jika
setelah diinkubasi pada suhu 37ºC selama 48 jam laktosa yang telah
difermentasi akan berubah warna dan terbentuk gas yang diletakkan terbalik.
b. Uji Penguat (Confirmed Test)
Merupakan tes lanjutan dari tes pendugaan. Dari tabung yang positif
pada tes pendugaan, dilakukan tes menggunakan medium BGLB (Brilliant
Green Lactose Broth) yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram
postif dan sebaliknya, yaitu menstimulasi pertumbuhan bakteri Gram negatif
seperti koliform.
c. Uji Penentu atau Pelengkap (Completed Test)
Untuk menentukan hasil benar-benar positif, maka mikroba dari hasil
tes konfirmasi/penguat yang positif diinokulasikan pada kaldu laktosa kembali.
 Selain itu ditumbuhkan pada agar miring. Jika timbul gas pada kaldu laktosa,
maka tes penentu dinyatakan positif. Jumlah koliform dapat dihitung dengan
menggunkan tabel MPN (Most Probable Number). (Syahputri, 2016)
hasilnya kemudian disamakan dengan data berikut :

4. Uji IMVIC (Indole, Methyl Red, Voges Praskauer, dan Citrat)

Uji IMViC merupakan sebuah uji biokimia yang berguna dalam
mengidentifikasi bakteri enterobacteriaceae. Dalam reaksi ini metabolisme
yang terjadi pada medium agar akan menjadi indikator positif atau negatifnya
suatu reaksi yang akan diintepretasikan sesuai dengan sifat biokimia bakteri
sehingga akan membantu dalam menentukan klasifikasi dari bakteri yang
diidentifikasi tersebut. IMViC sendiri terdiri dari Indole, Methyl Red, Voges
Praskauer, dan Citrat. Keempatnya menjadi standar baku dalam menentukan
sifat biokimiawi bakteri koliform.
5. Pewarnaan gram
Pewarnaan Gram membedakan bakteri dengan sifat kimia dan fisika dari
dinding sel mereka dengan mendeteksi peptidoglikan, yang hadir dalam dinding
sel bakteri Gram-positif. bakteri gram positif mempertahankan pewarna kristal
violet, dan dengan demikian violet patri, sedangkan bakteri Gram-negatif tidak;
 setelah mencuci, counterstain ditambahkan (umumnya safranin atau fuchsine)
yang akan mewarnai bakteri Gram-negatif ini warna merah. Kedua bakteri
Gram-positif dan bakteri Gram negatif mengambil counterstain tersebut.
Counterstain tak terlihat pada bakteri Gram-positif karena gelap dari warna
kristal violet (John G. Holt., et al., 1994).
E. Media
- Lactose Broth Tunggal
- Lactose Broth Ganda
- Media Brillian Green Lactose Bile Broth (BGLBB)
- Eosin metilena biru (EMB)
- SIM Medium
- NAS
F. Pereaksi
- Pewarna gram
- Metil red
- Indol
- Voges-Proslauer
- Sitrat

G. Alat
- Tabung reaksi
- Tabung durham
- Cawan Petri
- Ose bulat
- Ose jarum
- Bunsen
- Rak tabung
- Incubator
- Beaker glass
- Pipet tetes
- Mikroskop
- Pipet ukur
- Autoklaf
- Objek glass
 - BSC
- Laminar air flow

H. Prosedur
1. Pembuatan media
1.1.Lactose Broth (LB)
Cara kerja :
Ditimbang media Lactose Broth sebanyak 0,65 gram, lalu dimasukkan ke
dalam erlenmeyer 100 mL yang sudah dibelabel. Dilarutkan dengan air suling
sebanyak ± 50 mL. Dicek pH, bila terlalu basa ditambahkan HCl dan bila
terlalu asam ditambahkan NaOH. Dimasukkan 5 mL ke dalam tabung reaksi
yang telah berisi tabung durham. Disterilkan ke dalam autoklaf dengan
tekanan 15 Past pada suhu 121ºC selama 15 menit.

1.2. Lactose Broth Double Strength (Lactose Broth Ganda/LBDS)

Komposisi :
- Ekstrak daging sapi 3 g
- Pepton 5 g
- Laktosa 10 g
- Bromotimol biru (0,02%)
Cara Kerja :
- Ditimbang media Lactose Broth sebanyak 39 gram
- Lalu, masukkan ke dalam Erlenmeyer, Lalu ukur pH 7,0
- Kemudian, ditambahkan aquadest sebanyak 1 liter
- Dipanaskan sampai larut sempurna diatas Hot Plate
- Kemudian, dimasukkan kedalam tabung reaksi 16 x 160 mm
sebanyak 5 ml (lengkap dengan tabung durham)
- Lalu disterilkan pada autoclave dengan suhu 121℃ selama 15-20
menit.

1.3.Media Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB)

Komposisi :
- Pepton 10 g
 - Laktosa 10 g
- Oxgall 20 g
- Hijau Brilliant 0,0133 g
- Air Destilasi 1000 mL
Cara Kerja :
Ditimbang media Brilliant Green Lactose Broth sebanyak 40 gram lalu
dimasukkan ke dalam beaker glass. Dilarutkan dalam 1 liter akuades.
Dimasukkan magnetic stirrer. Dipanaskan diatas hot plate sampai larut.
Dimasukkan 10 mL ke dalam tabung reaksi yang telah berisi tabung Durham.
Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit.
1.4. Eosin Methylen Blue (EMB)
Komposisi :
- Gelatin 10 g
- Laktosa 5 g
- Sukrosa 5 g
- Dipotasium fosfat 2 g
- Eosin Y 0,4 g

Cara kerja :

Ditimbang sebanyak 37,5 gram bubuk media Eosin Methylen Blue (EMB).
Dimasukkan ke dalam beaker glass. Dilarutkan dengan aquades sebanyak 1
liter, dimasukkan magnetic stirrer. Dilakukan pemanasan hingga mendidih
untuk melarutkan media. Disterilkan dalam autoclave pada suhu 121℃ selama
15 menit. Menunggu hingga suhu hangat dan tidak terlalu panas (45℃-50℃),
kemudian dihomogenkan. Dituang ke dalam cawan petri steril.

1.5.Nutrient Agar (NA)

Komposisi :
- Ekstrak daging sapi 3 g
- Pepton 5 g
- Agar 12 g

Cara kerja :
 Media NA (Nutrient Agar) sebanyak 28 gram dilarutkan ke dalam 1 liter akuades,
kemudian diaduk dan dipanaskan menggunakan magnetic stirrer, setelah itu
dimasukkan ke tabung reaksi ditutup menggunakan kapas, diletakkan miring,
kemudian disterilkan dengan autoclave dengan suhu 121 ºC selama 15-20 menit.

1.6. MR-VP ( Metil red – Voges Proscauer )

Medium MR-VP dibuat dengan cara menimbang 3,5 gram polipepton, 2,5 gram
glukosa, dan 2,5 gram KH2PO4. Medium dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer
dan tambahkan aquades steril 500 ml. Medium diaduk hingga homogen dan
dipanaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi
sebanyak 5 ml dan tutup dengan sumbat. Medium disterilkan menggunakan
autoclave pada suhu 121 ºC tekanan 2 atm selama 15-20 menit.
1.7. Simmons Citrate Agar (SCA)
Larutkan 24.28 gram media pada 1000 ml akuades, panaskan hingga mendidih
untuk melarutkan media, kemudian diamkan hingga benar-benar dingin hingga 45-
50 ° C. Aduk rata dan distribusikan dalam tabung atau serpihan sesuai keinginan.
sterilkan dengan autoklaf pada tekanan 15 bs (121 ° C) selama 15 menit.

2. Prosedur
2.1.Uji pendugaan : Menginokulasi sampel ke LB
- Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
- Mensterilkan Laminar Air Flow menggunakan alcohol
- Memasukkan 10 mL sampel ke dalam masing-masing 9 mL LB
ganda sebanyak 3 tabung
- Memasukkan 1 mL sampel ke dalam masing-masing 9 mL LB
tunggal sebanyak 3 tabung
- Memasukkan 0,1 mL sampel ke dalam masing-masing 9 mL LB
tunggal sebanyak 3 tabung
- Tabung diberi label sesuai jumlah sampel
- Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37℃
- Setelah inkubasi diamati.

2.2.Uji konfirmasi : Menginokulasi bakteri dari LB ke BGLB

- Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
- Mensterilisasi Laminar Air Flow menggunakan alcohol
 - Menyalakan bunsen untuk sterilisasi jarum ose
- Mensterilkan jarum ose bulat dengan cara dibakar pada Bunsen hingga
memijar
- Mendinginkan jarum ose
- Membuka penutup tabung LB
- Memanaskan mulut tabung LB
- Memasukkan jarum ose kedalam tabung hingga mendekati tabung
durham
- Memanaskan mulut tabung LB
- Menutup kembali tabung LB
- Membuka penutup tabung BGLB
- Memanaskan mulut tabung BGLB
- Menginokulasikan bakteri dari LB ke BGLB
- Memanaskan kembali mulut tabung BGLB
- Menutup tabung BGLB
- Menginkubasi bakteri pada incubator dengan suhu 37ºC dan 44ºC
selama 24 jam

2.3.Uji kelengkapan : Menginokulasi bakteri dari BGLB ke media EMB dan NA

- Menyiapkan alat dan bahan yang digunakan
- Mensterilisasi Laminar Air Flow menggunakan alcohol
- Menyalakan bunsen untuk sterilisasi jarum ose
- Mensterilkan jarum ose lurus dengan cara dibakar pada Bunsen hingga
memijar
- Mendinginkan jarum ose
- Membuka penutup kapas pada tabung BGLB
- Memanaskan mulut tabung BGLB
- Memasukkan jarum ose kedalam tabung hingga mendekati tabung
durham
- Memanaskan mulut tabung BGLB
- Menutup kembali tabung BGLB
- Membuka penutup cawan petri media EMB
- Menginokulasikan bakteri pada media EMB dengan menggoreskan ose
- Menutup kembali cawan petri media EMB
 - Menginkubasi bakteri pada incubator dengan suhu 37ºC dan 44ºC
selama 24 jam
- Untuk menginokulasikan bakteri ke dalam media NAS dilakukan
penyiapan alat dan bahan
- Mensterilkan jarum ose lurus dengan cara dibakar pada Bunsen hingga
memijar
- Mendinginkan jarum ose
- Membuka penutup kapas pada tabung BGLB
- Memanaskan mulut tabung BGLB
- Memasukkan jarum ose kedalam tabung hingga mendekati tabung
durham
- Memanaskan mulut tabung BGLB
- Menutup kembali tabung BGLB
- Membuka penutup kapas media NA
- Memanaskan mulut tabung NA
- Menginokulasikan bakteri dari media BGLB pada media NA dengan
menggoreskan ose
- Memanaskan kembali mulut tabung NA
- Menutup kembali tabung media NA
- Menginkubasi bakteri pada incubator dengan suhu 37ºC dan 44ºC
selama 24 jam

2.4. Uji IMVIC

1. Indole
- Menginokulasi secara tusuk tegak (stab) biakan bakteri E.coli pada
mediumSIM secara duplo
- Menginkubasi pada suhu 37ºC selama 48 jam.
- Menambahkan 5 tetes reagen kovac’s ke dalam 2 tabung.
- Mengkocok secara perlahan dan biarkan tabung dalam posisi tegak
- Mengamati permukaan medium. Terbentuknya cincin merah tua
padapermuakaan medium menunjukkan indol positif
2. Methyl Red
- Menginokulasi secara tusuk tegak (stab) biakan bakteri E.coli pada
mediumMR-VP secara duplo
 - Menginkubasi pada suhu 37ºC selama 48 jam.
- Menambahkan 3 tetes reagen methyl-red ke dalam 2 tabung
- Mengkocok secara perlahan dan biarkan tabung dalam posisi tegak.
- Mengamati permukaan medium. Terbentuknya warna merah
menunjukka n uji Methyl-Red positif.
3. Voges-Proskauer
- Menginokulasi secara tusuk tegak (stab) biakan bakteri E.coli pada
mediumMR-VP secara duplo
- Menginkubasi pada suhu 37ºC selama 48 jam
- Menambahkan 0,6 mL reagen α naftol 5% dan 0,5 mL KOH 40%
kedalam 2tabung
- Mengkocok secara perlahan dan biarkan tabung dalam posisi tegak
- Mengamati permukaan medium. Terbentuknya warna merah tua
padapermuakaan medium menunjukkan uji positif.
4. Citrate
- Menginokulasi secara tusuk tegak (stab) biakan bakteri E.coli pada
mediumSCA secara duplo
- Menginkubasi pada suhu 37ºC selama 48 jam
- Mengamati pertumbuhan mikroba. Perubahan medium dari hijau
menjadibiru menunjukkan uji Citrate positif.
2.5.Pewarnaan gram
- Membekar jarum ose yang akan digunakan hingga membara
- Mendiamkan hingga dingin
- Menetesi kaca objek dengan aquades secukupnya
- Mengambil bakteri pada biakan dan diletakkan di kaca objek dengan
cara memutar searah jarum jam
- Melakukan fiksasi agar bakteri menempel pada kaca objektif
sebanyak 3 kali pergerakan
- Meneteskan larutan crystal violet pada kaca objek, didiamkan selama
1 menit, kemudian dibilas dengan akuades
- Menetesi dengan larutan iodin ke kaca objek, ditunggu selama 1
menit. Kemudian dibilas dengan akuades
- Kembali meneteskan dengan alcohol pada kaca objek, ditunggu
selama 30 detik, kemudian dibilas dengan akuades
- Terakhir meneteskan dengan larutan safranin pada kaca objek,
kemudian dibilas dengan akuades mengalir
- Mengeringkan kaca objek dengan tisu
- Dilakukan pengamatan menggunakan mikroskop
 3. Skema kerja MPN

sampel

Vol. Sampel 10ml Vol. Sampel 1ml Vol. Sampel 0,1ml Hari ke 1

LB Ganda 10ml LB Tunggal 10ml LB Tunggal 10ml

Inkubasi 37oC 24 jam

Jumlah tabung yang positif ditandai adanya gas diinokulasikan ke media BGLB (volume 9 ml) sebanyak 3-5
mata ose, Inkubasi suhu 37oC (Coliform) dan 44oC (E.coli) selama 24 jam

Hitung jumlah tabung positif ditandai dengan adanya gas dalam tabung Durham dan di baca dengan Hari ke 2

Tabel MPN 555. Kemudian dilanjutkan identifikasi dengan skema berikut:

Hari ke 3
EMBA

Nutrien Agar Slant Hari ke 4

4. Skema pewarnaan gram

1 Koloni 1-2 tetes Aquadest

-diletakkan pada
-Diambil 1 ose steril
object

Sediaan kering 2-3 tetes Kristal

violet

-Ditambahkan

-Didiamkan 1 menit

-Sisa kristal violet dibuang

-Dibilas dengan aquadest

2-3 tetes alkohol sediaan

95%

-Ditambahkan

-Didiamkan 30 detik

Sisa alkohol 95% dibuang

-Dibilas dengan aquadest

Sediaan 2-3 tetes safranin

 -Ditambahkan

-Didiamkan 30 detik

Sisa alkohol 95% dibuang

-Dibilas dengan aquadest

-Dikeringkan dengan kertas penghisap

Sediaan

Hasil

5. Uji IMVIC
I. Hasil/data
- Uji Pendugaan (jumlah tabung positif-urut)
Suhu 37℃ : 3 3 3
- Uji Konfirmasi (jumlah tabung positif-urut)
Suhu 37℃ : 3 3 3
Suhu 44℃ : 3 3 3
- Uji identifikasi :
EMB Bentuk koloni : Bulat
Warna : Metalik
NAS Bentuk koloni: Bulat dengan tepi koloni convex
Warna : Putih susu
- Uji Kelengkapan
Suhu 37℃: 1. Indol = positif 3. VP = negatif
2. MR = negatif 4. Citrat = negatif

Suhu 44℃: 1. Indol = negatif 3. VP = negatif

2. MR = negatif 4. Citrat = positif
- Pewarnaan Gram:

Suhu 37℃: 1. Bentuk bakteri: batang pendek (coccobasil)

2. Susunan: protein

3. Warna : merah

4. Sifat : gram negatif

5. Gambar/ foto:

Suhu 44℃: 1. Bentuk bakteri: batang

2. Susunan: protein
 3. Warna : biru violet

4. Sifat : gram negatif

5. Gambar/ foto:

- Uji IMVIC
Karakter pengujian Sampel 37℃ Sampel 44℃
Indole + -
MR + -
VP - -
Sitrat - +

J. Pembahasan
Pada praktikum ini sampel yang digunakan adalah air cucian hati ayam yang didapatkan
dari salah satu penjual daging ayam dimana tempat penjualanya dinilai kurang bersih
sehingga diperkirakan terkontaminasi cemaran mikroba. Kemudian dilakukan identifikasi
bakteri Eschericia coli dan coliform pada sampel tersebut menggunakan metode MPN dan
dilanjutkan dengan uji pewarnaan gram serta diuji dengan pereaksi IMVIC. Pertama pada
metode MPN Uji pendugaan (presumtive test) bertujuan untuk mendeteksi sifat
fermentatif coliform dalam sampel. Pada tahap ini keberadaap coliform masih dalam
tingkat probabilitas rendah, masih dalam dugaan. Sehingga hasil positif pada sampel
ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi kuning dan terdapat gas pada tabung
reaksi. Pada uji ini sampel dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi media LB, prosedur
ini dilakukan dalam laminar air flow (LAF) untuk menghindari kontaminasi dengan udara
maupun yang lainnya.
Setelah dilakukannya uji penduga, tabung-tabung yang positif dilanjutkan ke tahap uji
penegasan yang bertujuan untuk menegaskan ada atau tidaknya bakteri Coliform didalam
tabung-tabung yang positif. Uji ini menggunakan media Brilliant Green Lactose Bile 2 %
Broth (BGLBB) yang selektif sebagai tes konfirmasi yang lebih spesifik, karena media ini
mengandung garam empedu yang hanya menumbuhkan bakteri Coliform dan
menghambat pertumbuhan bakteri selain Coliform. Pemeriksaan ini digunakan jarum ose
untuk mengambil sampel yang positif dan dicampurkan ke dalam tabung reaksi yang telah
berisi 10 ml Brilliant Green Lactose Bile 2 % Broth (BGLBB) dan tabung durham,
inkubasi kembali dalam suhu 37℃ dan 44℃ selama 24 jam, karena bakteri dalam suhu
dan waktu tersebut akan berkembang biak dengan baik.
Uji konfirmasi dilakukan untuk mengetahui nilai MPN pada seluruh sampel. Nilai MPN
ditentukan dengan melihat jumlah tabung positif setelah diinkubasi dan hasil dilihat dari
tabel MPN Coliform. Untuk mengetahui jumlah koliform digunakan metode MPN (Most
Probable Number) dimana bakteri koliform akan memfermentasi laktosa selama 24 jam
yang akan menghasilkan asam dan gas yang tertangkap oleh tabung Durham dalam tabung
uji. Hasil menunjukkan bahwa ketiga tabung positif, maka dari itu indeks MPN nya adalah
1100. Uji kelengkapan (completed test) bertujuan untuk melengkapi hasil tes uji
konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentative serta pengamatan bakteri coliform. Pada
uji kelengkapan didapatkan hasil pada media EMB koloni bakteri berbentuk bulat dengan
warna metalik, sedangkan pada media NA didapatkan hasil berbentuk bulat dengan tepi
convex berwarna putih susu/pucat.
Pada uji IMVIC menggunakan empat reagen yang terdiri dari Indole, Methyl Red,
Voges Praskauer, dan Citrat. Uji indol bertujuan mengidentifikasi kemampuan bakteri
menghasilkan indol dengan menggunakan enzim tryptophanase. Produksi indol di dalam
media dimungkinkan karena adanya tryptophan. Tryptophan adalah asam amino esensial,
yang teroksidasi oleh beberapa bakteri yang mengakibatkan pembentukan indol, asam
piruvat, dan ammonia(Hemraj, V., 2013.). uji Indol pada bakteri Escherichia coli adalah
positif yang ditunjukan adanya cincin merah pada bagian atas, hal ini disebabkan karena
indol bereaksi dengan aldehid. 25 Namun karena cincin mudah memudar oleh gerakan
yang tiba-tiba, cincin menjadi pecah dan menghasilkan warna merah muda. Uji Methyl
Red (MR), bertujuan untuk mendeteksi kemampuan organisme dalam memproduksi dan
mempertahankan produk akhir asam stabil dari fermentasi glukosa. Methyl red adalah
indikator pH, yang tetap berwarna merah pada pH 4,4 atau kurang. Hasil pengamatan
untuk uji MR pada isolate bakteri Escherichia coli adalah positif yang ditunjukkan dengan
larutan berwarna merah. Uji Voges Proskauer (VP) adalah tes yang digunakan untuk
mendeteksi acetonin dalam kultur cair bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan
menambahakan alphanaftol dan kalium hidroksida dengan kaldu voges Proskauer yang
telah diinokulasi dengan bakteri. Warna merah menunjukkan hasil yang positif, sedangkan
warna kuningcoklat atau tidak berwarna merupakan hasil negative. 25 Uji ini negatif untuk
Escherichia coli karena Escherichia coli memfermentasikan karbohidrat menjadi produk
asam dan tidak menghasilkan produk netral seperti asetonin. Uji sitrat bertujuan
mendeteksi kemampuan suatu organisme untuk memanfaatkan sebagai satu-satunya
sumber karbon dan energi. Jika bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai sumber
karbonnya maka akan menaikan pH dan mengubah warna medium biakan dari hijau
menjadi biru. Hasil pengamatan untuk uji sitrat adalah negatif pada Escherichia coli yang
ditujukan tidak adanya perubahan warna pada media uji sitrat. Escherichia coli merupakan
salah satu bakteri yang tidak menggunakan sitrat sebagai sumber karbon dilingkungan.
(Sunarjo, 1994)
Pengujian ini dilakukan pada dua sampel yang memiliki suhu inkubasi berbeda yaitu
37ºC dan 44 ºC. Pada tiap-tiap sampel ditetesi dengan reagen Indole, Methyl red, Voger
praskauer. Kecuali pada Citrat dilakukan inkubasi selama 24 jam. Dan hasil yang didapat
pada sampel dengan suhu inkubasi 37ºC yaitu, uji indole positif, uji methyl red negatif,
voges praskeur negatif, & citrat negatif. Sedangkan pada sampel dengan suhu inkubasi
44ºC yaitu, uji indole negatif, uji methyl red negatif, voges praskeur negatig, & citrat
positif.
Pada uji pewarnaan gram bakteri yang telah diinokulasikan pada NAS diambil
kemudian diletakkan pada kaca objek yang telah ditetesi akuades dengan cara diputas
searah jarum jam. Selanjutnya dilakukan fiksasi sehingga bakteri tersebut dapat menempel
pada kaca objek. Kemudian ditetesi dengan peraksi kristal violet, iodin, alcohol dan
safranin, larutan pereaksi diteteskan secukupnya sehingga cukup untuk menutupi bagian
bakteri yang telah diletakkan.. setiap setelah pemberian larutan pereaksi didiamkan
terlebih dahulu dan kemudian dicuci dengan akuades, pencucian ini harus diperhatikan
sehingga warna dari larutan pereaksi tidak tertinggal yang akan mempengaruhi ketika
diidentifikasi dengan mikroskop.
Hasil identifikasi menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100x didapatkan bakteri
berwarna merah yang berbentuk seperti butiran butiran dinyatakan positif Eschericia coli
yaitu pada sampel yang dioven dengan suhu 37℃. Karena Eschericia coli merupakan
bakteri yang memiliki gram negative maka ketika dilakukan pewarnaan gram akan
mempertahankan warna merah dari safranin. Sedangkan untuk hasil yang kedua
didapatkan hasil negative karena tidak memperlihatkan bakteri-bakteri yang berwarna
merah, melainkan berwarna ungu pudar dan masih terlihat sisa-sisa larutan pereaksi kristal
 violet, sehingga bukan merupakan bakteri Eschericia coli maupun coliform yang memiliki
gram negatif.
K. Kesimpulan
Identifikasi yang telah dilakukan dengan metode MPN, uji pendugaan didapatkan hasil
bahwa ketiga tabung pada suhu 37 derajat celsius positif, uji konfirmasi didapatkan hasil
bahwa ketiga tabung suhu 37 dan 44 deratat Celcius positif, maka dari itu indeks MPN nya
adalah 1100, dan uji kelengkapan didapatkan hasil koloni pada media EMB berbentuk
bulat dengan pusat kehitaman, dan berwarna metalik. Sedangkan pada media NA
didapatkan hasil berbentuk bulat dengan tepi koloni convex berwarna putih susu/putih
pucat.
Sedangkan pada pewarnaan gram didapatkan hasil positif pada sampel yang telah
dilakukan pemanasan pada suhu 37℃ dengan menunjukan hasil berwarna merah dan
berbentuk batang pendek (coccobasil). Sehingga disimpulkan bahwa sampel air cucian
hati ayam positif mengandung bakteri Eschericia coli. Pada uji IMVIC hasil menunjukkan
positif bakteri Eschericia coli pada suhu 37℃.

L. Daftar Pustaka
Nurjanah, S. 2006. Kajian sumber cemaran mikrobiologis pangan pada beberapa rumah di
lingkar kampus IPB Darmaga. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia.
Novaliano, R., Netti, S., Amir, A., 2016. Jurnal Kesehatan Andalas. Fakultas Kedokteran
Unversitas Andalas Padang.
Syahputri, F. A. (2016). PROGRAM STUDI DIPLOMA III ANALIS FARMASI DAN
MAKANAN FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN 2016. 36.
Hartanti, A., S. 2015. Mikrobiologi kesehatan. Yogyakarta: CV. Andi Offset.
John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath; James T. Staley; Stanley T. Williams
(1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams
& Wilkins. p. 11. ISBN 0-683-00603-7.
Sunarjo, 1994. Penyehatan Air dalam Program Penyediaan dan Pengolahan Air Bersih.
Jakarta
Hemraj, V., 2013. A review on Commonly Used Biochemical Test For Bacteria. India:
Departement of Pharmacy, L R Intitute of Pharmacy, Solan (H.P).
M. LAMPIRAN