IDENTIFIKASI BAKTERI PRbg4 SIMBION Porites sp DAN

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP Carbapenem

Resistant Pseudomonas aeruginosa BERBASIS 16S rRNA

TUGAS AKHIR

Diajukan sebagai salah satu syarat utuk menyelesaikan

Pendidikan Diploma IV Kesehatan
Bidang Analis Kesehatan

Disusun Oleh:

Wiwit Setyowati
G1C017037

PROGRAM STUDI D-IV ANALIS KESEHATAN

FAKUTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG
2021
 HALAMAN PERSETUJUAN

Tugas Akhir dengan judul

IDENTIFIKASI BAKTERI PRbg4 SIMBION Porites sp DAN UJI

AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP Carbapenem Resistant
Pseudomonas aeruginosa BERBASIS 16S rRNA

Wiwit Setyowati
G1C17037

Telah disetujui oleh:

Pembimbing I Pembimbing II

Muhammad Evy Prastiyanto, M.Sc Aprilia Indra Kartika, S.Pd., M.Biotech

NIK.28.6.1026.297 NIK. 28.6.1026.354
Tanggal: 19-08-2021 Tanggal: 19-08-2021

Mengetahui,
Ketua Program Studi D IV Analis Kesehatan
Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan

Fandhi Andi Wardoyo, M.Sc

NIK: 28.6.1026.277

ii
 HALAMAN PENGESAHAN

Tugas Akhir ini telah diujikan pada sidang ujian jenjang Pendidikan Tinggi
Diploma IV Kesehatan Bidang Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan
Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang.

Tanggal Sidang: 12 Agustus 2021

Susunan Tim Penguji:

No Nama Nara Sumber Tanda Tanggal

Tangan
1. Dr. Sri Darmawati, M.Si Penguji I
NIK : 28.6.1026.040

2. Muhammad Evy Penguji II

Prastiyanto, M.Sc
NIK : 28.6.1926.297

3. Aprilia Indra Kartika, S.Pd.,

M.Biotech Penguji III
NIK : 28.6.1026.354

iii
 SURAT PERNYATAAN

Yang bertanda tangan di bawah ini menyatakan dengan sungguh-sungguh bahwa

Tugas Akhir ini adalah karya sendiri, disusun tanpa tindakan plagiarisme sesuai
dengan peraturan yang berlaku di Universitas Muhammadiyah Semarang.

Nama : Wiwit Setyowati

NIM : G1C017037
Fakultas : Ilmu Keperawatan dan Kesehatan
Program Studi : DIV Teknologi Laboratorium Medik
Judul : IDENTIFIKASI BAKTERI PRbg4 SIMBION Porites sp
DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP Carbapenem Resistant
Pseudomonas aeruginosa BERBASIS 16S rRNA

Jika dikemudian hari ternyata saya melakukan tindakan plagiarism, saya akan
bertanggungjawab sepenuhnya dan menerima sanksi yang dijatuhkan
Universitas Muhammadiyah Semarang kepada saya.

Semarang, 19 Agustus 2021

(Wiwit Setyowati)

iv
 Identifikasi Bakteri Prbg4 Simbion Porites Sp dan Uji Aktivitas
Antibakteri Terhadap Carbapenem Resistant Pseudomonas
Aeruginosa Berbasis 16S rRNA

Wiwit Setyowati1, Muhammad Evy Prastiyanto2, Aprilia Indra Kartika1,

Sri Darmawati3

1. Program Studi D IV Analis Kesehatan, Fakultas Ilmu Keperawatan dan

Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Semarang
2. Program Studi DIII Analis Kesehatan, Fakultas Ilmu Keperawatan dan
Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Semarang
3. Program Studi S2 Sains Laboratorium Medis, Fakultas Ilmu Keperawatan
dan Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Semarang

ABSTRAK

Pseudomonas aeruginosa adalah salah satu dari enam bakteri patogen,

Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,
Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, dan Enterobacter sp., yang
umumnya terkait dengan resistensi antimikroba, dan dilambangkan dengan
singkatan ESKAPE. Bakteri MDR masih menjadi permasalahan dunia
dikarenakan angka penyebabnya yang masih tinggi disetiap tahunnya. Kasus
MDR P.aeruginosa ditemukan pada tahun 2015 sebanyak 52,5% di klinik paru
The Jordan University Hospital (JUH). Pasien dengan infeksi yang disebabkan
oleh bakteri MDR memiliki resiko yang lebih buruk karena sifatnya yang sulit
pengobatan dan kemungkinan kematian yang tinggi. Sehingga dibutuhkan
pengganti antibiotik yang bersumber dari alam contohnya Karang Porites sp.
Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk mengetahui jenis spesies apakah
bakteri PRbg4 simbion Karang Porites sp dan uji aktivitas antibakteri PRbg4
tehadap CRPA. Berdasarkan hasil isolasi Karang Porites sp terdapat 1 isolat
murni PRbg4 yang dapat mengahmbat bakteri CRPA. Zona hambat bakteri
ditunjukkan adanya zona bening disekitar koloni dengan ukuran 15,25mm.
Kemudian dilakukan identifikasi molekuler untuk mengetahui genus isolat
PRbg4. Hasil menunjukkan bahwa isolat PRbg4 merupakan genus dari
Staphylococcus sp strain YNA 104-2 dengan tingkat kemiripan 91,82%.
Kesimpulannya isolat bakteri simbion Karang Porites sp yang memiliki potensi
sebagai antibakteri CRPA adalah Staphylococcus sp.
Kata kunci: Bakteri MDR, CRPA, Karang Porites sp, Staphylococcus sp strain
YNA 104-2

v
 Identification of Prbg4 Simbion Porites Sp Bacteria and
Antibacterial Activity Test Against Carbapenem Resistant
Pseudomonas aeruginosa Based 16S rRNA

Wiwit Setyowati1, Muhammad Evy Prastiyanto2, Aprilia Indra Kartika1,

Sri Darmawati3

1. D IV health analyst study program, Faculty of Nursing and Health,

University of Muhammadiyah Semarang
2. D III health analyst study program, Faculty of Nursing and Health,
University of Muhammadiyah Semarang
3. Medical Science Masters Program in Medical Laboratory, Faculty of
Nursing and Health, University of Muhammadiyah Semarang

ABSTRACT

Pseudomonas aeruginosa is one of six pathogenic bacteria, Enterococcus

faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter
baumannii, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter sp. which are commonly
associated with antimicrobial resistance, and denoted by the acronym ESKAPE.
MDR bacteria are still a problem in the world because the number of causes is still
high every year. Cases of MDR P.aeruginosa were found in 2015 as much as
52.5% in pulmonary clinics The Jordan University Hospital (JUH). Patients with
infections caused by MDR bacteria are at greater risk due to their difficult
treatment and high likelihood of death. So it takes antibiotic substitutes sourced
from nature for example Coral Porites sp. The purpose of this research is to find
out what species species are bacteria PRbg4 simbion Karang Porites sp and test
antibacterial activity PRbg4 tehadap CRPA. Based on the results of isolation
Karang Porites sp there is 1 pure isolate PRbg4 that can inhibit CRPA bacteria.
Bacterial bland zones are shown in the presence of clear zones around the colony
with a size of 15.25mm. Then molecular identification was carried out to
determine the genus isolate PRbg4. Results showed that the isolate PRbg4 is a
genus of Staphylococcus sp strain YNA 104-2 with a similarity rate of 91.82%. In
conclusion isolate bacteria simbion Coral Porites sp that has the potential as an
antibacterial CRPA is Staphylococcus sp.

Keywords: Bacteria MDR, CRPA, Coral Porites sp, Staphylococcus sp strain

YNA 104-2

vi
 KATA PENGANTAR
Assalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh

Segala puji syukur kehadirat Allah SWT, yang telah melimpahkan rahmat,
nikmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan Tugas Akhir
yang berjudul “Identifikasi Bakteri PRbg4 Simbion Porites sp dan Uji Aktivitas
Antibakteri Terhadap Carbapenem Resistant Pseudomonas aeruginosa Berbasis
16S r RNA”

Penyusun Tugas Akhir ini merupakan salah satu syarat untuk

menyelesaikan pendidikan Diploma IV Analis Kesehatan, Fakultas Ilmu
Keperawatan dan Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Semarang.

Penulis menyadari bahwa terselesaikannya Proposal Tugas Akhir ini tidak

lepas dari bimbingan, dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu
pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih kepada:
1. Muhammad Evy Prastiyanto, M.Sc, Selaku Pembimbing pertama yang
telah memberikan arahan, motivasi dan kritik sehingga penulis dapat
menyelesaikan penyusunan tugas akhir ini.
2. Aprilia Indra Kartika, S.Pd., M.Biotech, Selaku Pembimbing kedua yang
dengan sabar, teliti, meluangkan waktu untuk bimbingan dan memberikan
saran serta koreksi yang dibutuhkan oleh penulis untuk menyelesaikan
tugas akhir ini.
3. Dr. Sri Darmawati, M.Si, Selaku Dosen Penguji yang telah memberikan
banyak saran dan arahan dalam penyusunan tugas akhir ini.
4. Fandhi Andi Wardoyo, M.Sc Selaku Ketua Program Studi yang telah
memberikan dukungan dan saran dalam penyusuan tugas akhir ini.
5. Seluruh Dosen dan Staff pengajar Jurusan Analis Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semarang yang telah mendidik dan membimbing penulis
dalam menyelesaikan tugas akhir ini.
6. Kedua orang tua saya serta sahabat tercinta yang senantiasa memberikan
do’a, bantuan dan dukungan secara moral maupun material.

vii
7. Rekan – rekan Diploma IV Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang angkatan 2017
Penulis menyadari masih banyak ketidak sempurnaan dan kekurangan
dalam penulisan Proposal Tugas Akhir ini. Kritik dan saran yang membangun
diharapkan dari para pembaca. Semoga Tugas Akhir ini dapat bermanfaat bagi
para pembaca.

Semarang, 19 Agustus 2021

Wiwit Setyowati
NIM. G1C017037

DAFTAR ISI

viii
HALAMAN PERSETUJUAN...........................................................................................ii
HALAMAN PENGESAHAN...........................................................................................iii
SURAT PERNYATAAN..................................................................................................iv
ABSTRAK.........................................................................................................................v
ABSTRACT.....................................................................................................................vi
KATA PENGANTAR.....................................................................................................vii
DAFTAR ISI.....................................................................................................................ix
DAFTAR TABEL............................................................................................................xii
DAFTAR GAMBAR......................................................................................................xiii
BAB I.................................................................................................................................1
PENDAHULUAN.............................................................................................................1
1.1 Latar Belakang...................................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah..............................................................................................4
1.3 Tujuan Penlitian.................................................................................................4
1.4 Manfaat Penelitian..............................................................................................5
1.4.1 Bagi Ilmu Pengetahuan...............................................................................5
1.4.2 Bagi Peneliti...............................................................................................5
1.4.3 Bagi Institusi..............................................................................................5
1.4.4 Bagi Masyarakat.........................................................................................5
1.5 Originalitas Penelitian........................................................................................6
BAB II...............................................................................................................................8
TINJAUAN PUSTAKA.....................................................................................................8
2.1 Pseudomonas aeruginosa...................................................................................8
2.2 Carbapenem Resistant Pseudomonas aeruginosa (CRPA)................................9
2.3 Karang Porites sp...............................................................................................9
2.4 Isolasi Bakteri dari Karang Porites sp.............................................................10
2.5 Uji Aktivitas Antibakteri..................................................................................10
2.6 Polymerase Chain Reaction(PCR)...................................................................11
2.7 Tahapan Proses PCR........................................................................................12
2.8 Sekuensing Gen 16S rRNA..............................................................................12
2.9 Kerangka Teori.................................................................................................15
2.10 Kerangka Konsep.............................................................................................16
BAB III............................................................................................................................17

ix
METODE PENELITIAN.................................................................................................17
3.1 Jenis Penelitian.................................................................................................17
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian...........................................................................17
3.2.1 Tempat......................................................................................................17
3.2.2 Waktu.......................................................................................................17
3.3 Variabel Penelitian...........................................................................................17
3.3.1 Variabel Bebas.........................................................................................17
3.3.2 Variabel Terikat........................................................................................17
3.4 Definisi operasional..........................................................................................18
3.5 Obyek Penelitian/ Populasi dan Sampel...........................................................18
3.6 Alat dan Bahan.......................................................................................................19
3.6.1 Alat.................................................................................................................19
3.6.2 Bahan..............................................................................................................19
3.7 Prosedur Penelitian................................................................................................20
3.7.1 Sterilisasi Alat................................................................................................20
3.7.2 Koleksi karang Porites sp................................................................................20
3.7.3 Isolasi bakteri Karang Porites sp..............................................................20
3.8 Uji Aktivitas Antibakteri........................................................................................21
3.8.1 Persiapan Bakteri Uji CRPA...........................................................................21
3.8.2 Uji Daya Hambat.............................................................................................21
3.9 Analisis Molekuler 16S rRNA..........................................................................22
3.9.1 Isolasi DNA Genom Bakteri.....................................................................22
3.9.1.1 Preparasi Sampel Bakteri Gram Positif....................................................22
3.9.1.2 Pelisisan Sel..............................................................................................22
3.9.1.3 Pengikatan DNA.......................................................................................23
3.9.1.4 Pencucian DNA........................................................................................23
3.9.1.5 Elusi.........................................................................................................23
3.9.2 Kuantitas Ekstrak DNA............................................................................23
3.9.3 Amplifikasi DNA dengan Primer Gen 16S rRNA....................................24
3.9.4 Analisis Sekuensing..................................................................................25
3.10 Alur Penelitian.....................................................................................................26
3.11 Teknik Pengumpulan Data...............................................................................27
BAB IV............................................................................................................................28

x
HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................................................28
4.1 Hasil Penelitian......................................................................................................28
4.1.1 Gambaran Sampel...........................................................................................28
4.1.2 Isolasi dan Identifikasi Koloni Bakteri............................................................28
4.1.3 Identifikasi Isolat Bakteri dengan Pewarnaan Gram........................................30
4.1.4 Uji Daya Hambat.............................................................................................32
4.1.5 Isolasi DNA Bakteri Penghambat CRPA........................................................34
4.1.6 Hasil Kemurian Ekstrak DNA Bakteri............................................................34
4.1.7 Amplifikasi PCR Gen 16S rRNA....................................................................35
4.1.8 Gel Elektroforesis 2%......................................................................................35
4.1.9 Sekuensing Gen 16S rRNA.............................................................................35
4.2 Pembahasan............................................................................................................36
BAB V.............................................................................................................................41
PENUTUP.......................................................................................................................41
5.1 Kesimpulan............................................................................................................41
5.2 Saran......................................................................................................................41
DAFTAR PUSTAKA......................................................................................................42
LAMPIRAN.....................................................................................................................46
LAMPIRAN 1 PEMBUATAN MEDIA......................................................................46
LAMPIRAN 2 KEGIATAN PENELITIAN.................................................................50
LAMPIRAN 3 HASIL SEKUENSING........................................................................52

DAFTAR TABEL
1.Originalitas Penelitian................................................................................6
2.Definisi Operasional...................................................................................18
3. Morfologi Koloni Bakteri..........................................................................30

xi
4. Pengecatan Gram Koloni Bakteri..............................................................30
5. Uji aktivitas antibakteri isolat Porites sp terhadap CRPA........................33
6. Standar Pengujian Antibiotik Terhadap CRPA (CLSI, 2011)...................34
7. Hasil Kemurnian DNA Bakteri..................................................................34

DAFTAR GAMBAR
1.Kerangka Teori...................................................................................................15
2.Kerangka Konsep...............................................................................................16
3. Lokasi Pengambilan Sampel Karang Porites sp di Pantai Gosong...................20
4.Alur Penelitian....................................................................................................26

xii
5. Karang Porites sp..............................................................................................28
6. Hasil isolatkKarang Porites sp..........................................................................29
7. Hasil pewarnaan Gram......................................................................................31
8. Hasil Zona hambat isolat Karang Porites sp terhadap CRPA dan kontrol......33
9. Hasil Amplifikasi gen 16S rRNA terhadap PRbg4...........................................35
10. Similritas isolat PRbg4....................................................................................36

xiii
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri patogen oportunistik yang

mempengaruhi pasien immunocompromised. Pseudomonas aeruginosa dikenal

sebagai penyebab utama morbiditas dan mortalitas pada pasien Cystic Fibrosis

(CF) dan sebagai salah satu penyebab utama infeksi nosokomial(Moradali et al.,

2017). P. aeruginosa menyebabkan infeksi kronis pada paru-paru pasien dengan

fibrosis kistik dan penyakit paru obstruktif kronik, serta infeksi saluran kemih

kronis pada pasien dengan kateter kandung kemih permanen, dan pneumonia

terkait ventilator pada pasien yang diintubasi, dan juga merupakan patogen

utama dalam luka kronis. Pseudomonas aeruginosa adalah salah satu dari enam

bakteri patogen, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella

pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, dan

Enterobacter sp., yang umumnya terkait dengan resistensi antimikroba, dan

dilambangkan dengan singkatan ESKAPE(Ciofu and Tolker-Nielsen, 2019).

Penyebab terjadinya resistensi bakteri dikarenakan penggunaan antibiotik yang

tidak teratur(Kresken et al., 2020). Multi Drug Resistant (MDR) merupakan

penyebab utama komplikasi dalam terapi penyakit menular (El mekes et al.,

2020).

Definisi MDR menurut European Center for Disease

Prevention(ECDC) dan Center for Disease Control and Prevention(CDC)

adalah ketidaksensitifan suatu bakteri terhadap setidaknya satu agen

1
 2

dengan tiga atau lebih kategori antibiotik (BABCHINSKII, 1963). Bakteri

MDR masih menjadi permasalahan dunia dikarenakan angka penyebabnya

yang masih tinggi disetiap tahunnya (Prastiyanto et al., 2020). Penelitian

yang dilakukan Pusat Rumah Sakit Universitas Marakesh- Maroko dengan

pemeriksaan sampel sebanyak 479 pasien, terdapat 305 bakteri yang di

isolasi dan diidentifikasi sebagai Acinobacter bau-mannii(31%),

Enterobacterceae sp (30%), Staphylococcus (24%), Pseudomonas

aeruginosa (10%) dan strain bakteri lainnya (5%) (El mekes et al., 2020).

Pemeriksaan laboratorium pada pasien dewasa klinik paru, The Jordan

University Hospital (JUH) menunjukkan bahwa presentase P. aeruginosa

sebanyak 21,5% dari 284 sampel diperiksa.(Al Dawodeyah et al., 2018).

Kasus MDR P.aeruginosa ditemukan pada tahun 2015 sebanyak 52,5% di

klinik paru (Al Dawodeyah et al., 2018). Karbapenem anti pseudomonal

adalah salah satu agen antimikroba yang umum digunakan untuk

mengobati infeksi P. aeruginosa.(Kresken et al., 2020).

Resistensi terhadap karbapenem didefinisikan sebagai resistensi terhadap

imipenem dan atau meropenem. Pola resistensi isolat resisten karbapenem

dievaluasi dengan mempertimbangkan subkelas obat antibakteri tambahan

sebagai berikut: piperasilintazobaktam, seftazidim, fluoroquinolon (resistansi

terhadap ciprofloxacin dan atau levofloxacin) dan aminoglikosida (resistensi

terhadap amikasin dan atau tobramycin) (Kresken et al., 2020). Pasien dengan

infeksi yang disebabkan oleh bakteri MDR memiliki resiko yang lebih buruk

karena sifatnya yang sulit pengobatan dan kemungkinan kematian yang tinggi.
 3

Infeksi yang diisebabkan oleh bakteri MDR juga menghabiskan lebih banyak

biaya perawatan kesehatan dibandingkan pasien yang terinfeksi nonresistant

strain dari bakteri yang sama.( Woldr Health Organization, 2018).

Diperlukan adanya solusi antibitotik yang bersumber dari alam dengan daya

kerja optimal dan realtif lebih aman. Memanfaatkan organisme laut yang

menjadi sumber produktif metabolit sekunder dengan kandungan bioaktif yang

dapat digunakan sebagai rujukan dalam pengembangan bidang farmasi(Madilana

et al., 2018). Jenis orgaisme laut yang banyak dijumpai di Laut Indonesia adalah

terumbu karang. Salah satu jenisnya adalah Karang Porites sp yang dapat

ditemui di pantai Gosong, Rembang Jawa Tengah.

Bakteri yang bersimbion dengan Karang Porites sp memiliki senyawa aktif

yang dapat digunakan sebagai antimikroba sama seperti di inangnya. Hal ini

dapat memberikan keuntungan karena selain tidak mengeksploitasi ekosistem

laut, bakteri yang bersimbion dengan Karang Porites sp dapat dimanfaatkan

sebagai antimikroba. Karang Porites sp yang diambil di Perairan Gunung Kidul,

Jawa Tengah dapat digunakan sebagai antibakteri pathogen Sthapylococcus

aureus dan Escherichia coli(Madilana et al., 2018). Isolat bakteri yang

berasosiasi dengan Karang Porites sp yang dapat berpotensi sebagai antibakteri

Carbapenem Resistant Pseudomonas aeruginosa (CRPA) maka dilanjutkan

dengan proses Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR 16S rRNA digunakan

untuk memberikan gambaran mengenai bakteri simbion karang untuk

mengestimasi keanekaragaman genetik bakteri karang, serta mengetahui

hubungan kekerabatan filogenetik bakteri yang berpotensi sebagai antibakteri

 4

(Madilana et al., 2018) Analisi gen penyandi 16S rRNA digunakan sebagai

penanda molekuler karena bersifat ulkubitus (keadaan yang selalu dipertahankan

dalam kondisi apapun) dengan fungsi identik pada semua bakteri. Gen 16S

rRNA memiliki daerah urutan basa yang konservatif dan juga ada yang variatif.

Perbandingan urutan basa bagian konservatif digunakan untuk mengkonstruksi

pohon filogenetik universal, sedangkan urutan basa variatif digunakan untuk

melacak keanekaragaman dan menempatkan berbagai strain dalam satu spesies

(Friskayanti et al., 2018; Saputra, 2019) .

Penelitian ini merupakan peneltian mengenai keanekaragaman laut yang

masih jarang dieksplorasi oleh manusia sebagai alternatif antibiotik penyebab

terjadinya resistensi pada P. aeruginosa yang dapat menimbulkan masalah yang

lebih besar bahkan dapat menyebabkan tingkat kematian yang tinggi. Sehingga

perlu dilakukannya penelitian untuk mengetahui potensi bakteri simbion Karang

Porites sp sebagai antibakteri (CRPA).

1.2 Rumusan Masalah

Bagaimanakah identifikasi bakteri PRbg4 simbion Karang Porites sp

dan Bagaimanakah uji aktivitas antibakteri PRbg4 terhadap CRPA.

1.3 Tujuan Penlitian

Untuk mengetahui jenis spesies apakah bakteri PRbg4 simbion Karang

Porites sp dan uji aktivitas antibakteri PRbg4 tehadap CRPA.

 5

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Bagi Ilmu Pengetahuan

Penelitian ini untuk menambah wawasan pada ilmu pengetahuan

tentang aktivitas antibakteri, isolat bakteri yang berasosiasi dengan

Porites sp terhadap CRPA.

1.4.2 Bagi Peneliti

1. Mengetahui aktivitas antibakteri, isolat bakteri yang berasosiasi dengan

Porites sp yang potensial terhadap CRPA.

2. Mengetahui aktivitas bakteri yang terdapat dalam Isolat bakteri yang

berasosiasi dengan karang laut untuk daya hambat terhadap bakteri CRPA

3. Mengetahui nama isolat bakteri yang berasosiasi dengan karang laut

Porites sp yang berpotensial terhadap CRPA.

1.4.3 Bagi Institusi

1. Dapat menambah referensi untuk Tugas Akhir selanjutnya.

2. Menambah wawasan dan ilmu pengetahuan bagi mahasiswa Universitas

Muhammadiyah Semarang tentang aktivitas antibakteri, isolat bakteri yang

berasosiasi dengan karang laut terhadap CRPA.

1.4.4 Bagi Masyarakat

1. Masyarakat dapat memanfaatkan karang laut Porites sp sebagai senyawa

bioaktif yang berasal dari bahan alami dari sumber laut untuk

menggantikan antibiotic terhadap CRPA.

 6

2. Menambah informasi tentang aktivitas antibakteri, isolat bakteri yang

berasosiasi dengan karang laut Porites sp sebagai penghambat bakteri

CRPA.

3. Menambah informasi jenis isolat bakteri yang berasosiasi dengan Karang

laut Porites sp sebagai penghambat bakteri CRPA.

1.5 Originalitas Penelitian

Tabel 1. Originalitas Penelitian
No Nama Peneliti Judul Peneliti Hasil Peneliti
1. Hasil penelitian
Rivan Novianto Bakteri Simbion menunjukkan dari isolasi
Madilana, Diah Karang Porites dari bakteri yang berasosiasi
Permata Wijayanti, Perairan dengan Porites sp
Agus Sabdono (2018) Gunungkidul, menunjukkan aktivitas
Yogyakarta dan bakteri dapat menghambat
Aktivitas bakteri Gram negative
Antibakteri (Eschericia coli )bakteri
terhadap Bakteri Gram positif
Patogen (Staphylococcus aureus)
Staphylococcus dan hasil aktivitas
aureus dan antibakteri paling tinggi
Escherichia coli terhadap mikroorganisme
yang di uji seperti Bacillus
pumilus dan Vibrio
natriegens
2. Penelitian bryozoan
Meezan Ardhanu Bacterial isolates Pleurocodonellina sp hasil
Asagabaldan, Gilles from bryozoan isolasi bakteri simbion laut
Bedoux, Nathalie Pleurocodonellina menunjukkan aktivitas
Bourgougnon, Rhesi sp.: penghambat terhadap
Kristiana, Diah Diversity and bakteri MDR.
Ayuningrum, Agus antimicrobial Pseudomonas aeruginoas
Sabdono, Agus potential against 59%, Klebsiella
Trianto, Ocky Karna pathogenic bacteria Pneuomoniae 12%,
Radjasa (2019) Escherichia coli 53%, dan
Acinobacter baumanii
18%

Berdasarkan Tabel 1, menujukkan bahwa penelitian yang

dilakukan oleh Rivan Novianto adalah isolasi bakteri Karang Porites sp

 7

dari perairan Gunungkidul, Yogyakarta terhadap bakteri Staphylococcus

aureus dan Escherichia coli dan pada penelitian Meezan Ardhanu isolasi

bakteri bryozoan Peurocodonellina sp terhadap bakteri MDR. Perbedaan

antara penelitian ini dengan kedua penelitian tersebut adalah pada

penggunaan bakteri patogen dan letak pengambilan sampel yang berbeda

yaitu isolat bakteri Karang Porites sp dari Pantai Gosong, Rembang

sebagai antibakteri CRPA.

 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa termasuk dalam family Pseudomonadaceae.

Bakteri ini merupakan bakteri gram negatif, mempunyai flagel tunggal yang

bersifat polar atau terkadang terdiri atas 2-3 flagel, berbentuk batang dan

mempunyai ukuran 0,5-1 μm x 3-4 μm. Bila ditumbuhkan pada perbenihan

tanpa sukrosa, bakteri P. aeruginosa dapat memproduksi lapisan lendir

polisakarida ekstraseluler. Pseudomonas aeruginosa yang diisolasi dari bahan

klinik sering kali mempunyai pili yang berperan penting dalam pelekatan pada

permukaan sel dan resistensi bakteri terhadap fagositosis(Dr Maksum Radji,

2013)

Pseudomons aeruginosa merupakan bacillus gram negative yang motil dan

hidup dalam suasana aerob. Pseudomonas aeruginosa terdapat pada lingkungan,

tetapi jarang terdapat pada flora orang yang sehat. Jumlah pembawa meningkat

dengan perawatan inap di rumah sakit. Lingkungan yang lembab merupakan

tempat hidup P. aureginosa, seperti bak cuci, keran air dan disinfektan yang

digunakan lebih dari 24 jam(Irianto, 2013).

Klasifikasi P. aeruginosa menurut (Salle, 1961):

Kingdom : Prokariota
Divisi : Protophyta
Kelas : Schizomycetes
Bangsa : Pseudomonadales
Suku : Pseudomonadaceae
Marga : Pseudomonas
Jenis : Pseudomonas aeruginosa

8
 9

Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri patogen oportunistik Gram-negatif

yang mampu menginfeksi manusia dengan pertahanan alami yang terganggu dan

menyebabkan penyakit paru yang parah. Ini adalah salah satu yang terdepan

patogen yang terkait dengan infeksi nosokomial(Alhazmi, 2015).

2.2 Carbapenem Resistant Pseudomonas aeruginosa (CRPA)

Penyebab terjadinya resistensi bakteri dikarenakan penggunaan antibiotik

yang tidak teratur. Karbapenem anti pseudomonal adalah salah satu agen

antimikroba yang digunakan untuk mengobati infeksi P.aeruginosa, tetapi

beberapa mekanisme resistensi, termasuk produksi Carbapenemase , dapat

mengganggu kemanjuran klinisnya.(Kresken et al., 2020)

Resistensi terhadap karbapenem didefinisikan sebagai resistensi terhadap

imipenem dan atau meropenem. Pola resistensi isolat resisten karbapenem

dievaluasi dengan mempertimbangkan subkelas obat antibakteri tambahan

sebagai berikut: piperasilintazobaktam, seftazidim, fluoroquinolon (resistansi

terhadap ciprofloxacin dan atau levofloxacin) dan aminoglikosida (resistensi

terhadap amikasin dan atau tobramycin) (Kresken et al., 2020).

2.3 Karang Porites sp

Struktur terumbu karang didominasi endapan batu kapur yang bersifat masif

dan mengandung kalsium karbonat (CaCO3) hasil dari metabolisme laut

(zooxanthellae) mensekresikan kapur dan alga melaui proses klasifikasinya. Salah

satu karang yang keras (hard coral) yaitu Porites sp dengan bentuk yang hampir

membulat dan berukuran besar(Mellawati and Bachtiar, 2011).

 10

Klasifikasi Porites sp menurut (Porites Link,1807)

Kingdom :Animalia
Phylum :Cnidaria
Kelas :Anthozoa
Sub Kelas :Hexacorallia
Family :Poritidae
Genus :Porites
2.4 Isolasi Bakteri dari Karang Porites sp

Isolasi bakteri simbion Karang Porites sp bertujuan agar dapat memisahkan

antara jenis bakteri, dilakukan dengan mengkultur pada media Zobell

2216E( media agar laut) dengan pengambilan secara steril menggunakan zipplock

dan disimpan dengan coolbag untuk sementara waktu. Karang Porites sp

disterilkan menggunakan air laut steril dan dihaluskan menggunakan mortar steril.

Kemudian dihomogenisasi secara serial dan diencerkan 10-1 sampai 10-4 dan

disebar pada media Zobell 2216E, diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam.

2.5 Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri yang digunakan adalah menggunakan metode

overlay(Radjasa, O.K., S.I.O. Salasia, A. Sabdono, J. Weise, J.F. Imhoff, 2007).

Setiap satu cawan petri yang berisikan media Zobell 2216E ditanam 4 jenis isolat

bakteri simbion Karang Porites sp yang berbeda , kemudian dilakukan inkubasi

selama 48jam. Bakteri patogen CRPA ditanam pada media MC dan diinkubasi

selama 24 jam, seteah proses inkubasi bakteri CRPA dibuat suspensi sesuai

dengan standar MCFarland(0,5 x 10⁸ cfu/ml) diambil sebanyak 1mL(1% dari total

volume soft agar) lalu dimasukkan kedalam 9mL soft agar media MHB(Muller

Hinton Broth) kemudian tuang kedalam media yang berisi isolat bakteri simbion
 11

karang laut, inkubasi selama 24 jam dan amati aktivitas bakteri yang dapat

menghambat bakteri patogen CRPA akan terbentuk zona bening disekitar koloni.

2.6 Polymerase Chain Reaction(PCR)

Polymerase Chain Reaction merupakan metode enzimatis untuk melakukan

sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro.Teknik PCR pertama kali ditemukan

oleh Mullis pada tahun 1985. PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi

segmen DNA dengan jumlah hingga jutaan dalam waktu beberapa jam (Handoyo

& Rudiretna, 2010). Dalam proses memperbanyak segmen DNA diperlukan

adanya enzim yaitu enzim polimerase. Enzim polimerase adalah enzim yang

menggabungkan DNA cetakan tunggal yang akan membentuk untaian molekul

DNA yang panjang. Enzim polymerase membutuhkan primer atau cetakan DNA

seperti nukleotida yang terdiri atas: Adenin (A), Tymine (T), Guanin (G) dan

Cytosine(C).

Komponen utama dalam proses PCR banyak digunakan:

DNA template yang akan digandakan, enzim DNA Polimerase, Oligonukletida

primer, merupakan suatu sekuen oligonukleotida pendek (18-28 basa nukleotida)

digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA, Deoksiribonukleat trifosfat

(dNTP) mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi efektif ion yang

diperlukan untuk polimerisasi, kovaktor MgCl2, larutan buffer (penyangga)

mengandung 10-50mM Tris-HCl pH 8,8 suhu 20 oC, 50mM KCl 0,1% gelati atau

Bouvine Saline Albumin (BSA) dan tween 20 sebanyak 0,01% (Budiarto, 2015).
 12

2.7 Tahapan Proses PCR

Tahapan yang penting pada PCR yang berlangsung cepat dan selalu berulang 30-

40 siklus terdapat 3 tahap:

a. Denaturasi

Proses denaturasi merupakan proses awal pada proses PCR merupakan

proses pembukaan untai ganda DNAmenjadi untai tunggal yang terjadi sebelum

ditambahkannya enzim taq polimerase. Proses denaturasi biasanya terjadi selama

3 menit dengan suhu 94-98oC.

b. Annealing/ Penempelan primer

Proses annealing merupakan proses penempelan oligonukleotida ke DNA

untai tunggal, sehingga primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan

cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Proses

ini berlangsung selama 30-45 detik dengan suhu 50-68oC. Jika primer semakin

panjang maka suhu yang diperlukan juga semakin tinggi.

c. Elongation/ Pemanjangan primer

Proses elongation merupakan proses pemanjangan atau ekstensi fragmen

DNA dengan enzim polimerase dan primer dengan suhu 70-78oC dan meghasilkan

copy an DNA yang berfungsi sebagai DNA cetakan pada siklus selanjutnya

(Hewajuli and Dharmayanti, 2014).

2.8 Sekuensing Gen 16S rRNA

Identifikasi berbasis molekuler dengan sensitifitas dan spesifitas tinggi yaitu

dengan analisis gen 16S rRNA ( 16S Ribosomal Ribonucleic Acid/ Ribonukleat

pengkode ribosom 16S, S menyatakan Svedberg, yaitu satuan ukuran ribosom)

 13

(Inayatul et al., 2018). Urutan Ribosomal RNA (rRNA), baik 16S rRNA untuk

Archaea, bakteri dan kloroplas atau 18S rRNA untuk eukariota, adalah standar

yang digunakan untuk mengidentifikasi anggota komunitas mikroba campuran

dan menentukan keragaman mikroba secara keseluruhan di lingkungan.

Pengurutan jenis berikutnya telah membuka pendekatan untuk menganalisis

komunitas mikroba dengan sangat rinci (Thompson et al., 2017). Sekuen gen

penyandi 16S rRNA merupakan molekul yang sempurna karena memiliki daerah

conserved (dipertahankan) dan fungsi yang konstan pada tiap organisme, tersebar

secara universal, dan mempunyai urutan sekuen yang terkonservasi dengan baik

diantara anggota filogenetik yang luas( Madigan et al., 2015).

Urutan gen 16S rRNA akan memberikan hasil terbaik untuk karakterisasi

taksonomi, namun keterbatasan teknologi pada panjang urutan pembacaan saat ini

membatasi pendekatan ini pada bagian gen (Cruaud et al., 2014). Pemilihan

wilayah variabel dan primer diperlukan untuk memperkuat hasil, sehingga bias

yang mengakibatkan representasi kurang atau berlebihan dari berbagai taksa dan

dari keragaman dan kekayaan komunitas dapat di minimalisir (Yu and Morrison,

2004). Set primer untuk wilayah variabel V1-V2 untuk mengklasifikasikan

fitoplankton dari SSU kloroplas rRNA(Choi et al., 2017) , sedangkan V3-V4 dan

V6-V8 telah digunakan sebelumnya untuk studi bakterioplankton Arktik (Comeau

et al., 2017). Survei mikrobioma laut global yang dilakukan dalam ekspedisi Tara

menggunakan wilayah variabel V9 selain sekuensing metagenom ekstensif

( Sunagawa et al., 2015). desain primer universal untuk amplifikasi wilayah V4-
 14

V5 menghasilkan kemampuan untuk menargetkan Archaea dan bakteri dalam satu

amplikon (Willis et al., 2019).

Primer yang digunakan yaitu primer universal 27F (Forward) dan primer

1492R (Reverse) dengan hasil produk PCR 1500bp. Urutan nukleotida primer 27F

dimulai dari 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’, sedangkan urutan primer

1492R dimulai dari 5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’.

 15

2.9 Kerangka Teori

Bakteri patogen P.
aeruginosa

Penyebab infeksi paru 21,5%

dan penyebab MDR

Penggunaan antibiotik dengan dosis yang tidak tepat

Meropenem,Ampicilin, Methicilin

Carbapenem Resistant Pseudomonas aeruginosa

(CRPA)

Mencari pengganti antibiotik penyebab resitensi bakteri

dengan bahan yang bersumber dari alam terutama berasal
dari organisme laut yang jarang ter eksplore dan relatif
lebih aman

Karang Laut (Porites sp)

Bakteri Simbion Karang Porites sp

Gambar 1. Kerangka Teori

 16

2.10 Kerangka Konsep

Isolat bakteri Porites sp digunakan untuk menghambat pertumbuhan

bakteri CRPA. Uraian tersebut dapat dilihat pada skema dibawah ini.

Aktivitas antibakteri simbion Karang

Bakteri simbion Karang
Porites sp Aktivitas sp
Porites berdasarkan
antibakteri zonaPorites
Karang hambatspdan
Bakteri simbion Karang identifikasi
berdasarkan zonabakteri
hambatsecara molekuker
dan identifikasi
Porites sp dengan PCR berdasarkan sekuen
molekuler dngan PCR berdasarkan gen 16S
sekuen genrRNA
16S rRNA

Gambar 2. Kerangka Konsep

 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksperimental yang didukung

studi pustaka.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

3.2.1 Tempat

Penelitian dilakukan dengan pelaksanaan isolat bakteri yang berasosiasi

dengan Karang Porites sp dan uji aktivitas antibakteri dilakukan di Laboratorium

Mikrobiologi, sedangkan pelaksanaan PCR dilakukan di Laboratorium Biologi

Molekuler Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Semarang.

3.2.2 Waktu

Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2020 – Januari 2021.

3.3 Variabel Penelitian

3.3.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dari penelitian ini adalah isolat bakteri yang berasosiasi

dengan Porites sp.

3.3.2 Variabel Terikat

Variabel terikat dari penelitian ini adalah hasil zona hambat isolasi bakteri

Karang Porites sp terhadap CRPA dan identifikasi molekuler isolat bakteri Karang

Porites sp berbasis 16S rRNA.

17
 18

3.4 Definisi operasional

Tabel 2. Definisi operasional
NO Variabel Definisi Operasional
1. Karang Porites sp Karang Porites sp diperoleh dari Pulau
Gosong, Rembang, Jawa tengah.
Pengambilan Karang .Porites sp dengan
alat snorkling dan menggunakan teknik
sampling pada kedalaman 1-5m, Karang
Porites sp yang sudah didapatkan
dimasukkan kedalam zipplock dan
disimpan dengan coolbag. Kemudian
sampel dikirim ke upt lab terpadu
universitas diponegoro untuk dilakukan
identifikasi jenis karang laut. Saat
dilakukan penelitian Karang Porites sp
disterilisasi dengan menggunakan air laut
steril.

3. Aktivitas antibakteri Aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan

adanya zona bening disekitar koloni,
dilakukan pengukuran menggunakan
jangka sorong untuk mengetahui
diameter zona hambat dalam
menghambat CRPA.
4. Sekuen gen 16S rRNA
Mengetahui jenis bakteri simbion Karang
Porites sp yang berpotensi sebagai
antibakteri CRPA berdasarkan sekuen
gen 16S rRNA menggunakan metode
PCR. Dengan primer Forward 27F (5’-
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)
primer Reverse 1492R (5’-
CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)
dengan ukuran produk sebesar 1500bp

3.5 Obyek Penelitian/ Populasi dan Sampel

Objek dalam penelitian ini adalah Karang Porites sp yang didapat dari Pulau

Gosong, Rembang, Jawa Tengah. Karang Porites sp dihaluskan dengan mortar

lalu dilakukan pengenceran serial dan disebar pada media Zobell 2216E lalu di
 19

inkubasi 48 jam, didapat isolat bakteri uji. Kemudian, diujikan dengan bakeri

CRPA dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi Universitas Muhammadiyah

Semarang.

3.6 Alat dan Bahan

3.6.1 Alat
Alat yang digunakan untuk uji antibakteri adalah autoclave (HMC

Hirayama HICLAVE HVE-50), inkubator (WTC Binder), Laminar air flow

cabinet (Labconco Purifier Class II Biosafety Cabinet), lemari es (Sharp). Tabung

reaksi, cork borer (10 mm), ose, neraca analitik, rak tabung, beaker glass, mortar,

erlenmayer, mikropipet, tip, cawan petri, spirtus, korek api, wrap,

spektrofotometer (nanodrop), centrifuge, vortex, mesin PCR(thermalcycler),

elektroforesis chamber, UV transluminator.

3.6.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Karang Porites sp,

subjek uji dalam penelitian ini adalah bakteri P.aerugionosa. Bahan yang

digunakan untuk kultur bakteri adalah media ZoBell 2216E, media uji aktivitas

antibakteri dan MHB (Mueller Hinton Broth), media penyubur BHI (Brain Heart

Infusion), MC (Mac Conkey), standart McFarland, dan NaCl fisiologi, Antibiotik

Meropenem dan Amikasin sebagai control. Bahan yang digunakan untuk isolasi

DNA isolat PRbg4 adalah ddH2O, Kit Presto TM Mini gDNA Bacteria. Bahan

yang dibutuhkan saat proses PCR adalah Master Mix (dNTPs, Taq Polymerase,

MgCl2, buffer PCR), Forward 27F, primer Reverse 1492R. Bahan yang digunakan

saat elektroforesis gel adalah agarose 2%, marker 1500bp, Phospate Buffer Saline
 20

(PBS), biology molecular agarose marker, loading dye, fluorescence, buffer Tris-

Acid EDTA (TAE), Nuclease-Free water (ddH2O).

3.7 Prosedur Penelitian

3.7.1 Sterilisasi Alat
Alat-alat yang akan digunakan dicuci bersih kemudian disterilkan, untuk

alat-alat gelas ditutup mulutnya dengan kapas dan dibungkus dengan kertas,

untuk cawan petri dibungkus kertas, kemudian semua alat tersebut dimasukkan ke

dalam autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 2 atm selama 75menit.

3.7.2 Koleksi karang Porites sp

Sampel isolat bakteri PRbg4 yang berasosiasi dengan Karang Porites sp

Gambar 3. Gambar
Lokasi Pengambilan Sampel
3. Karang Porites sp Karang Porites
yang berada disp di Pantai
Pantai Gosong,
Gosong,
Rembang,
Rembang, Jawa Tengah. Jawa Tengah
Indonesia. A-D (sumber:
merupakan dokumentasi pribadi) sampel,
lokasi pengambilan
dan E merupakan sampel Karang Porites sp yang diambil dari titik lokasi
( Sumber dokumentasi pribasi: Google Maps)
 21

3.7.3 Isolasi bakteri Karang Porites sp

Sampel Karang Porites sp diambil dari Pulau Gosong dengan kedalaman 1-

5m kemudian dimasukkan kedalam plastik zipplock dan sementara disimpan di

dalam coolbag. Sampel yang akan digunakan dibersihkan menggunakan air laut

steril untuk menghilangkan kotoran, mikroorganisme epifit yang menempel pada

permukaan. Kemudian sampel dihaluskan menggunakan mortar yang telah di

sterilkan menggunakan alkohol lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi dengan

pengenceram diferensial 10-1 hingga 10-4. Dipipet sebanyak 100ul disebarkan ke

dalam cawan petri yang berisi media ZoBell 2216E dan diinkubasi pada suhu 35

±2°C selama 48 jam untuk mendapatkan biakan bakteri yang berasosiasi dengan

Karang Porites sp. Berdasarkan isolat bakteri simbion yang berasosiasi dengan

Karang Porites sp dipilih bakteri yang paling potensial terhadap CRPA.

3.8 Uji Aktivitas Antibakteri

3.8.1 Persiapan Bakteri Uji CRPA

Isolat bakteri di dapat dari Laboratorium Mikrobiologi Universitas

Muhammadiyah Semarang yang telah diinokulasikan pada media MC dengan

suhu 35±2ºC selama 24 jam. Pada media BAP dipilih koloni dan diuji

menggunakan uji katalase yang katalase positif. Kemudian diuji kepekaannya

terhadap antibiotik Meropenem dan Amikasin.

3.8.2 Uji Daya Hambat

Uji daya hambat aktivitas antibakteri menggunakan metode overlay

(Radjasa dan Sabdono, 2006). Setiap satu ose bakteri simbion laut ditanam pada

cawan petri (berisi media zobell 2216E) dalam setiap cawan petri dibentuk 2-5

bulatan kecil. Kemudian cawan petri di inkubasi selama 24 jam, penanaman

 22

bakteri uji CRPA dilakukan satu hari sebelum overlay, bakteri uji CRPA

sebelumnya di lakukan penanaman pada media MC di inkubasi selama 24 jam,

setelah bakteri uji tumbuh dalam waktu 24 jam dibuat suspensi standar McFarland

(0,5 x 10⁸ cfu/ml) diambil 1 mL (1% dari total volume soft agar) dan dimasukkan

ke dalam 9 mL soft agar media MHB (Muller Hinton Broth) kemudian di tuang

pada cawan petri yang berisi biakan isolat bakteri simbion laut, kemudian

diinkubasi selama 24 jam dan diamati perkembangan aktivitas bakteri yang

menghambat berbentuk zona bening.

3.9 Analisis Molekuler 16S rRNA

3.9.1 Isolasi DNA Genom Bakteri

3.9.1.1 Preparasi Sampel Bakteri Gram Positif

Isolat bakteri PRbg4 di media BHI dicentrifuge dengan kecepatan 12.000

rpm selama 10 menit. Dibuang supernatan ditambahkan Gram + buffer 200uL

kedalam tabung centrifuge 15mL. Ditambahkan lisozim kedalam tabung

centrifuge 15mL lakukan resuspensi. Dipindahkan 200uL sampel kedalam

mikrotube 1,5mL. Di inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit, di bolak-balikkan

tabung setiap 10 menit sekali. Ditambahkan 20uL Porteinase K yang telah

ditambahkan ddH2O, lalu di vortex. Di inukbasi pada suhu 60oC selama 10 menit.

Dibolak- balikkan tabung setiap 3 menit sekali.

3.9.1.2 Pelisisan Sel

Ditambahkan 200uL GB Buffer kedalam sampel dan dicampur

menggunakan vortex selama 10 detik. Di inkubasi pada suhu 70 oC selama 10

menit untuk memastikan sampel lisat bersih. Selama inkubasi, setiap 3 menit
 23

sekali tabung dibolak- balikkan. Panaskan Elution Buffer pada suhu 70oC untuk

langkah Elusi DNA.

3.9.1.3 Pengikatan DNA

Ditambahkan 200uL Ethanol absolut ke lisat sampel dan campur segera

dengan mengocok kuat- kuat. Jika endapan munncul, dihancurkan sebanyak

mungkin menggunakan pipet. Ditempat Kolom GD dalam tabung pengumpul

2mL. Dipindahkan campuran ( termasuk endapan yang tidak larut) ke Kolom GD

kemudian di sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Dibuang

cairan yang terkumpul pada tabung pengumpul 2mL kemudian ditempatkan

Kolom GD di tabung pengumpul 2mL yang baru.

3.9.1.4 Pencucian DNA

Ditambahkan 400uL Buffer W1 ke Kolom GD. Di sentrifuge pada 12.000

rpm selama 30 detik kemudian dibuang alirannya. Ditempatkan Kolom GD pada

tabung pengumpul 2mL. Ditambahkan 600uL Wash Buffer yang telah

ditambahkan Ethanol ke Kolom GD. Di sentrifuge pada 12.000 rpm selama 30

detik, kemudian buang cairannya. Tempatkan Kolom GD kembali di tabung

pengumpul 2mL. Di sentrifuge kembali selama 3 menit pada 12.000rpm.

3.9.1.5 Elusi

Dipindahkan Kolom GD kering ke tabung microsentrifuge 1,5mL bersih.

Ditambakan 100uL Elution Buffer yang telah dipanaskan sebelumnya ke pusat

 24

matriks kolom. Diamkan selama 3 menit agar Elution Buffer terserap seluruhnya.

Di sentrifuge selama 30 detik untuk mengelusi DNA yang dimurnikan.

3.9.2 Kuantitas Ekstrak DNA

Kuantifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan untuk mengetahui berapa

volume sampel yang dihasilkan yang diperlukan sebagai sampel dalam proses

PCR. Pengukuran ekstrak DNA amilolitik menggunakan Nano drop

Spektrofotometer dengan mengukur absorbansi DNA pada panjang gelombang

260 atau 280nm (Rahayu et al., 2019)

3.9.3 Amplifikasi DNA dengan Primer Gen 16S rRNA

Bahan- bahan reaksi PCR terdiri atas Go Taq Green Master Mix (12,5ul),

primer 27F sebanyak (2ul) dan primer 1492R sebanyak (2ul), template DNA

(1ul), dan ddH2O (7,5ul). Primer yang digunakan yaitu primer universal 27F

(Forward) dan primer 1492R (Reverse) dengan hasil produk PCR 1500bp. Urutan

nukleotida primer 27F dimulai dari 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’,

sedangkan urutan primer 1492R dimulai dari 5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-

3’. Tahapan awal pada proses PCR dengan alat thermal cycler adalah tahap

denaturasi memerlukan suhu yang tinggi yaitu 94oC selama 30 detik, annealing

dengan suhu 55oC selama 30 detik, ekstensi awal memerlukan waktu 1 menit

dengan suhu 72oC, ekstensi akhir dengan waktu 5 menit pada suhu 72 oC, pada

tahap cooling down memerlukan suhu 4oC. Siklus amplifikasi terjadi sebanyak 35

siklus (Ethica et al., 2018).

Ekstrak DNA genom diamplifikasi menggunakan PCR berdasarkan gen

16S rRNA. Hasil amplifikasi PCR kemudian dilakukan elektroforesis

 25

menggunakan gel agarose 2%. Tangki elektroforesis yang sudah diisi dengan

larutan TAE 1X kemudian dimasukkan gel agarose 2% kedalam tangki. Pipet

loading dye sebanyak 1ul dan tambahkan 4ul sampel kemudian resuspensi. Pipet

seluruh campuran larutan tersebut dengan menggunakan mikropipet lalu

masukkan kedalam well pada gel agarose 2%. Pipet marker 5ul lalu masukkan

pada well agarose 2%. Hubungkan tangki elektroforesis dengan power supply,

lakukan running dengan tegangan 100 volt. Tunggu selama ± 1 jam kemudian

lakukan pembacaan pada UV transluminator.

3.9.4 Analisis Sekuensing

Produk hasil gen 16S rRNA dilanjutkan proses skeunsing. Hasil sekuensing

DNA bakteri dianalisis dan dicocokkan dengan data yang tersedia pada Gen Bank

Basic Lokal Aligment Search Tool (BLAST) pada NCBI.

 26

3.10 Alur Penelitian

Karang Porites sp dari Pantai Gosong

Rembang, Jawa tengah.

Diisolasi pada media Zobell 2216E inkubasi

suhu 35°C ± 2 selama 48 jam

Didapat isolat bakteri yang berasosiasi

dengan Karang Porites sp

Uji Aktivitas
Antibakteri

Penentuan zona hambat (Metode Overlay)

Didapat isolat bakteri simbion laut yang potensial

terhadap CRPA

Isolat DNA bakteri PRbg4 yang berpotensi

sebagai antibakteri CRPA

Dilakukan proses PCR

Dilakukan Proses Sekuensing oleh PT.

Genetika Science (Jakarta)

Pengumpulan data
 27

Gambar 4. Tahap Penelitian

3.11 Teknik Pengumpulan Data

Data yang diambil selama penelitian di Laboratorium adalah data primer

yang terdiri dari data uji aktivitas antibakteri isolat Karang Porites sp terhadap

CRPA yang dihitung zona hambat yang terbentuk dengan satuan (mm), isolat

bakteri Karang Pories sp yang berhasil menghambat CRPA di identifikasi

jenisnya berbasis Gen16S rRNA dan data yang diperoleh disusun kemudian

disajikan dalam bentuk narasi deskriptif.

28
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

4.1.1 Gambaran Sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah Karang Porites sp

yang diperoleh dari Pulau Gosong, Rembang, Jawa Tengah dan biakan murni

bakteri CRPA diperoleh dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi Universitas

Muhammadiyah Semarang. Pada penelitian ini menggunakan metode overlay,

metode berlapis dengan menggunakan dua media berbeda yaitu media Zobell

2216E dan juga media soft agar.

Gambar 5. Karang Porites sp

4.1.2 Isolasi dan Identifikasi Koloni Bakteri

Setelah dilakukan pengeceran pada sampel, dituang hasil pengenceran 10-1

-10-4 dari sampel Karang Porites sp yang ditanam pada media Zobell 2216E.

Koloni yang ditemukan adalah sebayak delapan morforlogi koloni berbeda yang

diberi kode PRbg1, PRbg2, PRbg3, PRbg4, PRbg5, PRbg6, PRbg7, PRbg8.

Setelah dilakukan identifikasi, Purifikasi dilakukan pada delapan koloni bakteri

yang berbeda jenisnya pada media baru.

29
 30

A B C

D E F

G H

Gambar 6. Hasil isolatkKarang Porites sp, (A) isolat PRbg1, (B) isolat PRbg 2,
(C) isolat PRbg 3, (D) isolat PRbg 4, (E) isolat PRbg 5,
(F) isolat PRbg 6, (G) isolat PRbg 7, (H) isolat PRbg 8,
 Sifat koloni
No Kode
Bentuk Warna Ukuran Tepi Elevasi Konsistensi
1. PRbg 1 Punctiform Putih 0,5mm Entire Convex Smooth
2. PRbg 2 Filamentous Kuning 1-2mm Erose Umbonate Kasar

3. PRbg 3 Circular Krem 1mm Pulvinate Convex Mukoid

4. PRbg 4 Puncitform Kuning 0,5mm Entire Convex Smooth

5. PRbg 5 Circular Putih 1mm Entire Pulvinate Mukoid

6. PRbg 6 Circular Putih susu 1mm Entire Flat Mukoid

7. PRbg 7 Cicular Putih 1mm Undulate Pulvinate Mukoid

8. PRbg 8 Circular Orange 0,5mm Pulvinate Convex Mukoid

Tabel 3. Morfologi Koloni Bakteri

4.1.3 Identifikasi Isolat Bakteri dengan Pewarnaan Gram
Bakteri yang telah dilakukan proses purifikasi dan dan diamati bentuk dari

koloninya, akan dilanjutkan ke tahap pewarnaan Gram untuk melihat jenis dan

karakteristik dari bakteri.

Tabel 4. Pengecatan Gram Koloni Bakteri

Kode Isolat Bentuk Warna Hasil Pewarnaan

PRbg 1 Coccus Ungu Gram- Positif

PRbg 2 Basil Merah Muda Gram- Negatif

PRbg 3 Basil Merah Muda Gram- Negatif

PRbg 4 Coccus Ungu Gram- Positif

PRbg 5 Coccus Ungu Gram- Positif

PRbg 6 Basil Ungu Gram- Positif

PRbg 7 Basil Merah Muda Gram- Negatif

PRbg 8 Coccus Merah Muda Gram- Negatif

A B C

31
 32

D E F

G H

H
G

Gambar 7. Hasil pewarnaan Gram (A) isolat PRbg1, (B) isolat PRbg 2,
(C) isolat PRbg 3, (D) isolat PRbg 4, (E) isolat PRbg 5,
(F) isolat PRbg 6, (G) isolat PRbg 7, (H) isolat PRbg 8,
Berdasarkan pewaran gram yang telah dilakukan, terdapat bakteri

Berbentuk coccus Gram- positif pada kode isolat PRbg1, PRbg4 dan

PRbg 5, coccus Gram- negatif pada kode isolat PRbg8, basil Gram positif pada
 33

kode isolat PRbg6, basil Gram negatif pada kode isolat PRbg2, PRbg3 dan

PRbg7. Dikatakan Gram- positif dikarenakan tidak terdapat sisa Safranin

sehingga tetap bewarna ungu yang disebabkan oleh Gentian Violet yang mengikat

bakteri, sedangkan Gram- negatif bewarna merah karena terdapat sisa Safranin

yang mewarnai sel bakteri.

4.1.4 Uji Daya Hambat

Hasil uji daya hambat dengan menggunakan metode overlay menunjukkan

adanya zona hambat yang berbentuk zona bening disekitaran koloni. Hasil

aktivitas zona hambat ditunjukkan pada tabel 5.

Tabel 5. Uji aktivitas antibakteri isolat Porites sp terhadap CRPA

NO Kode Isolat Aktivitas antibakteri Kontrol

(Zona Hambat) Meropenem Amikasin
1. PRbg 1 -
2. PRbg 2 -
3. PRbg 3 -
4. PRbg 4 ±(15,25mm)
5. PRbg 5 -
6. PRbg 6 -
7. PRbg 7 -
8. PRbg 8 -
9. CRPA ±(9,05mm) ±(20,24mm)
 34

B
PRbg4
A
C

Gambar 8: Hasil Zona hambat isolat Karang Porites sp terhadap CRPA dan

kontrol:

(A) Isolat Karang Porites sp PRbg4

(B) Kontrol +: Meropenem

(C) Kontrol -: Amikasin

Berdasarkan gambar 8, isolat PRbg4 dapat menghambat bakteri CRPA

ditandai dengan adanya zona bening disekitar koloni. Uji sensitivitas bakteri

CRPA terhadap antibiotik mengggunakan kontrol positif dan negatif. Sebagai

kontrol positif menggunakan antibiotik Meropenem dan sebagai kontrol negatif

menggunakan antibiotik Amikasin. Hasil diameter yang diperoleh dari PRbg4

dengan CRPA adalah ±(15,25mm). Hasil diameter antibiotik bakteri CRPA

terhadap antibiotik Meropenem sebesar ±(9,05mm) dan terhadap Amikasin

sebesar ±(31,24mm). Kemudian dibandingkan dengan data CLSI 2011.

 35

Tabel 6. Standar Pengujian Antibiotik Terhadap CRPA (CLSI, 2011)

Diameter Zona Hambat (mm)

Antibiotik Sensitif Intermediet Resistant

Meropenem ≥23 20-22 ≤19

Amikasin ≥17 15-16 ≤14

Berdasarkan tabel 6, bakteri CRPA dikatakan resistant terhadap antibiotik

Meropenem dikarenakan hasil uji sensitivitas menunjukkan ≤19mm, dan bakteri

CRPA dikatakan sensitif terhadap antibiotik Amikasin dikarenakan hasil uji

sensitivitas menunjukkan ≥17mm.

4.1.5 Isolasi DNA Bakteri Penghambat CRPA

Bakteri yang telah dilakukan uji sensitivitas dan terdapat zona bening

disekitar koloni dilakukan proses isolasi DNA. Proses ini bertujuan untuk

mendapatkan genom DNA bakteri murni. Produk hasil ekstraksi kemudian

dilakukan proses identifikasi dengan menggunakan Nano drop spektrofotmeter

(Thermo Scientific).

4.1.6 Hasil Kemurian Ekstrak DNA Bakteri

Tabel 7. Hasil Kemurnian DNA Bakteri
Kode Sampel Konsentrasi (ng/ul) A260/280 Sampel

PRbg4 461.173 1.86 DNA

Panjang gelombang DNA maksimal yang dapat diserap adalah 260nm,

sedangkan 280nm adalah nilai maksimal residu protein atau fenol. DNA dapat

dikatakan murni jika memiliki rasio OD260/280 antara 1,8-2,0 (Fatchiyah et al.,

2011). Konsentrasi DNA template yang baik untuk dilakukan PCR adalah

150ng/ul (Mulyani and Purwanto, 2011). Bedasarkan Tabel 7 diketahui bahwa

 36

hasil uji pada gelombang 260/280nm pada kode sampel PRbg4 sebesar 1.86 dan

konsentrasi asam nukleat dari isolat PRbg4 adalah 461.173ng/ul.

4.1.7 Amplifikasi PCR Gen 16S rRNA

DNA Genom bakteri yag telah dilakukan isolasi dilakukan proses

amplifikasi PCR gen 16S rRNA sebagai DNA template. Primer yang digunakan

adalah primer universal gen 16S rRNA primer Forward 27F dan primer Reverse

1492R dengan besaran produk sebesar 1500bp.

4.1.8 Gel Elektroforesis 2%

Hasil amplifikasi dari PCR dilakukan proses elektroforesis gel 2%. Hasil

yang didapatkan memiliki ukuran marker sebesar 1437bp.

Berikut hasil amplifikasi Gen 16S rRNA terhadap isolat PRbg4:

PRbg4

1500bp

Gambar 9. hasil amplifikasi Gen 16S rRNA terhadap isolat PRbg4

4.1.9 Sekuensing Gen 16S rRNA

Proses sekuensing dilakukan oleh PT. Genetika Science Indonesia

berlokasi di Tangerang. Program yang digunakan untuk menganalisa

bioinformatika adalah Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) dengan

 37

consesnsus sekuens Forward dan Reverse. Hasil pemetaan pasang basa

selanjutnya dianalisis pada Gen Bank menggunakan BLAST. Berikut hasil

sekuens isolate PRbg4:

Hasil kemiripan terdekat dengan isolat PRbg4 dapat dilihat pada Gambar

10 sebagai berikut:

Gambar 10. Similaritas isolat PRbg4

Isolat PRbg4 memiliki kemiripan dengan Staphylococcus sp strain YNA

104-2 dengan tingkat kemiripan sebesar 91,82% dan query cover sebesar 58%.

Sehingga isolat PRbg4 belum dapat dikatakan sebagai bakteri Staphylococcus sp,

namun jika dibandingkan dengan data pada NCBI isolat PRbg4 memiliki tingkat

kemiripan tertinggi dengan Staphylococcus sp ( Genbank kode akses:

JQ071517.1).

4.2 Pembahasan
Penelitian diawal dengan isolasi bakteri simbion Karang Porites sp

menggunakan media Zobell Marine Agar 2216E sehingga menghasilkan isolat

bakteri murni dengan kode PRbg1, PRbg2, PRbg3, PRbg4, PRbg5, PRbg6,
 38

PRbg7, PRbg8. Dilakukan pengamatan karakteristik morfologi koloni bakteri

dengan melihat bentuk, ukuran, warna, tepian, elevasi, dan konsistensi pada

koloni, kemudian dilakukan uji aktivitas antibakteri dengan menggunakan metode

overlay. Isolat bakteri ditumbuhkan pada media Zobell Marine Agar 2216E

sebanyak 4 isolat pada satu cawan petri, kemudian di inkubasi selama 48 jam

dengan suhu ±35oC. Komposisi utama Zobell Marine Agar 2216E adalah 0,5%

pepton, 0,1% ekstrak ragi, 0,01% besi fosfat dan 3% NaCl, dalam 1L media

terkandung NaCL sebanyak 35g/L(Asagabaldan et al., 2019). Media Zobell

Marine Agar 2216E digunakan pada penelitian ini karena adanya kandungan

mineral dan garam yang meniru komposisi air laut (Guria et al., 2020). Media soft

agar yaitu pencampuran MHB dan agar-agar digunakan untuk uji aktivitas

antibakteri. Peremajaan bakteri progen pada media MC, kemudian dibuat suspensi

bakteri sesuai standar Mc Farland sebanyak 1 mL dengan menggunakan NaCl

Fisiologis. Suspensi bakteri dimasukkan kedalam media Media MHB yang

bervolume 9mL, kemudian dituang pada media Zobell Marine Agar 2216E yang

berisi isolat murni. Inkubasi selama 24 jam pada suhu ±35oC. Terdapat 4 kriteria

daya hambat antibakteri yaitu: menghambat lemah (<5 mm), sedang (5-10 mm),

kuat (10-20 mm) dan sangat kuat (>20 mm) (Nugraheni et al., 2021). Terbentuk

zona bening di sekitar koloni pada isolat bakteri PRbg4 sebesar 15,25mm

menujukkan bahwa isolat bakteri PRbg4 berpotensi sebagai antibakteri CRPA

dengan daya hambat kuat. Isolat bakteri PRbg4 dilakukan tahap selanjutnya yaitu

proses isolasi DNA dan identifikasi berbasis molekuler.

 39

Isolasi DNA isolat bakteri PRbg4 menggunakan kit prosedur Presto tm

Mini GDNA Bacteria sehingga diperoleh DNA bakteri yang kemudian diukur

tingkat kemurniannya dengan Spektrofotometer Nanodrop. Berdasarkan hasil

pengukuran konsentrasi DNA PRbg4 yang diperoleh mempunyai konsentrasi 1,86

ng/ul. Rasio OD 260/280nm kurang dari 1,8 menunjukkan adanya kemungkinan

ekstrak DNA yang terkontaminasi protein. Sedangkan tingkat kemurnian diatas

2,0 menunjukkan bahwa sampel DNA tidak murni yang disebabkan oleh adanya

sisa ethanol atau sisa kandungan metabolit sekunder bakteri (Fatchiyah et al.,

2011). Hasil ini menujukkan bahwa tidak terdapat kontaminasi protein atau fenol

dalam larutan atau DNA yang didapat sudah murni.

Isolat DNA bakteri PRbg4 kemudian dilakukan proses PCR untuk

memperbanyak segmen DNA. Konsentrasi DNA template yang baik untuk

dilakukan PCR adalah 150ng/ul (Mulyani and Purwanto, 2011). Konsentrasi

isolat DNA PRbg4 yang diperoleh adalah 461.173ng/ul, maka perlu dilakukan

pengenceran sampel atau pengurangan volume penggunaan DNA template untuk

PCR. setelah dilakukan proses PCR untuk mengetahui besaran produk yang

dihasilkan sesuai dengan marker yang digunakan dilakukan Elektroforesis Gel

2%. Hasil amplifikasi isolat DNA genom bakteri meunjukkan pita DNA sejajar

dengan marker pada nilai ±1500bp. Hasil amplifikasi yang diperoleh kemudian

dilakukan tahap sekuensing, dan dianalisis secara bioinformatika pada situs NCBI

menggunakan BLAST.

Produk hasil sekuensing disebut dengan basa nukleotida ditelurusi

kecocokannya dengan gen 16S rRNA yang dimiliki oleh bakteri lain pada Gen
 40

Bank Basic Local Alignment Search Tools (BLAST). Hasil program BLAST

menunjukkan bahwa isolat PRbg4 memiliki kemiripan dengan Staphylococcus sp

strain YNA 104-2 sebesar 91,82%. klasifikasi bakteri Staphylococcus sp sebagai

berikut:

Klasifikasi Staphylococcus sp menurut (Rosebanch, 1884):

Kingdom :Bacteria
Phylum :Firmicutes
Class :Bacilli
Order :Bacillales
Familia : Staphylococcaceae
Genus : Staphylococcus
Staphylococcus sp merupakan Genus Staphylococcus, Gram positif,

bentuk sel bulat dan motil. Hasil uji katalase positif dan oksidase negatif, mampu

memfermentasi laktosa dan sukrosa, dan tumbuh optimum pada temperatur 37ºC.

Staphylococcus sp adalah organisme anaerob fakultatif (mampu tumbuh baik

secara aerob maupun anaerob)(Yulvizar, 2013). Staphylococcus bersifat patogen

melalui kemampuannya berkembang biak dan menyebar secara luas dalam

jaringan. Bakteri patogen pada dasarnya tidak bersifat toksik, akan tetapi dapat

menghasilkan berbagai enzim yang bersifat toksik dan berperan dalam proses

infeksi (Sandycho, 2020). Staphylococcus sp yang ditemukan pada sampel air laut

yang dikumpulkan dari area pelabuhan kapal dari Pelabuhan Vizhinjam,

Thiruvananthapuram dan digunakan sebagai antifouling( bahan pembersih dari

tanaman/ hewan laut pada bawah kapal) dengan kandungan metabolit sekunder

(Josphine et al., 2021).

Pada rumput laut Corallina officinalisL.(Corallinaceae) ditemukan adanya

bakteri Staphylococcus sp yang dapat mengambat pertumbuhan bakteri

 41

Staphylococcus aureus (±11mm), Escheriachia coli (±14mm), Schizo-

phyllumcommune (±13mm) (Khedr et al., 2015). Staphylococcus sp ditemukan

juga pada sedimen laut dalam yang berasal dari Teluk Benggala, India dan

berpotensi sebagai antimikroba dengan kandungan metabolit sekunder.

Stapylocccus strain MB30 ditemukan sebagai spektrum luas terhadap berbagai

bakteri patogen manusia. Metabolit bioaktif murni secara struktural dijelaskan

sebagai pirol (1, 2, a) pirazin 1, 4,dion, heksahidro 3-(2-metil propil) (PPDHMP).

Berat molekul PPDHMP ditentukan sebagai 211(MH) dengan rumus empiris pada

C11H18N2O2. PPDHMP ditemukan sebagai turunan peptida dari cyclicdipeptide

dan diketopiperazine. Turunan peptida ini dilaporkan menghambat produksi

metabolit sekunder (aflatoksin) yang sangat beracun, karsinogenik dan teratogenik

dari Aspergillus flavus dan Aspergillus para-sitius (Lalitha et al., 2016).

Penelitian yang dilakukan oleh Sharma menunjukkan bahwa Karang Porites sp

memiliki kandungan metabolit utama yaitu (2Z,4E)-3-Methyl-2,4-decadienoic

acid. Terdapat juga metabolit sekunder Karang Porites sp yaitu metilasi turunan -

metionin pada karbon yang berasal dari karbonil dari asetat. Senyawa metil pada

bakteri yang bersimbion dengan Karang Porites sp (Microbulbifer) menunjukkan

penghambatan pertumbuhan yang lemah terhadap Saccharomyces cerevisiae

(Sharma et al., 2019). Sehingga diharapkan kemampuan bakteri genus

Staphylococcus sp yang memiliki metabolit sekunder dan dapat berpotensi sebagai

antibateri dapat dikembangkan lebih baik di masa yang akan datang dan

dimanfaatkan dalam skala besar sebagai sumber antibakteri.

 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang dilakukan pada Karang Porites sp dapat

kesimpulan sebagai berikut:

1. Isolat bakteri PRbg4 yang berasosiasi dengan Karang Porites sp memiliki

potensi sebagai antibakteri terhadap CRPA, ditunjukkan dengan adanya zona

bening disekitar koloni dengan diameter rata-rata sebesar 15,25mm.

2. Berdasarkan hasil analisis molekuler berbasis sekuens gen 16S rRNA,

isolat bakteri PRbg4 memiliki kemiripan dengan Staphylococcus sp strain YNA

104-2 dengan tingkat kemiripan sebesar 91,82% dan Query Cover sebesar 58%.

5.2 Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dikemukakan, maka penulis

menyarankan:

1. Melakukan penelitian di biosafety cabinet untuk mengurangi resiko

kontaminasi dan hasil yang maksimal.

2. Melakukan proses sekuensing DNA genom bacteria dengan menggunakan

koloni murni untuk mengurangi kontaminasi bakteri jika menggunakan

media cair.

3. Penelitian ini belum dapat dibilang sebagai sumber referensi baru sumber

antibakteri CRPA alternatif, tetapi dapat menjadi screening awal untuk

penelitian lebih lanjut.

42
 DAFTAR PUSTAKA
Al Dawodeyah, H.Y., Obeidat, N., Abu-Qatouseh, L.F., Shehabi, A.A., 2018.
Antimicrobial resistance and putative virulence genes of Pseudomonas
aeruginosa isolates from patients with respiratory tract infection. Germs 8,
31–40. https://doi.org/10.18683/germs.2018.1130
Alhazmi, A., 2015. Pseudomonas aeruginosa – Pathogenesis and Pathogenic
Mechanisms. Int. J. Biol. 7, 44–67. https://doi.org/10.5539/ijb.v7n2p44
Asagabaldan, M.A., Bedoux, G., Bourgougnon, N., 2019. Bacterial isolates from
bryozoan Pleurocodonellina sp .: Diversity and antimicrobial potential
against pathogenic bacteria 20, 2528–2535.
https://doi.org/10.13057/biodiv/d200914
BABCHINSKII, F. V., 1963. Osobennosti Narusheni I Rechi Pri Dykhanii Pod
Izbytochnym Davleniem. Vestn. Otorinolaringol. 25, 10–14.
Budiarto, B.R., 2015. Polymerase Chain Reaction (Pcr) : Perkembangan Dan
Perannya Dalam Diagnostik Kesehatan. Polym. Chain React. Perkemb. Dan
Perannya Dalam Diagnostik Kesehat. 6, 29–38.
Choi, C.J., Bachy, C., Jaeger, G.S., Poirier, C., Sudek, L., Sarma, V.V.S.S.,
Mahadevan, A., Giovannoni, S.J., Worden, A.Z., 2017. Newly discovered
deep-branching marine plastid lineages are numerically rare but globally
distributed. Curr. Biol. 27, R15–R16.
https://doi.org/10.1016/j.cub.2016.11.032
Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., 2019. Tolerance and resistance of pseudomonas
aeruginosabiofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosaCan escape
antibiotics. Front. Microbiol. 10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00913
Comeau, A.M., Douglas, G.M., Langille, M.G.I., 2017. Microbiome Helper: a
Custom and Streamlined Workflow for Microbiome Research. mSystems 2,
1–11. https://doi.org/10.1128/msystems.00127-16
Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P.E., Godfroy, A.,
Cambon-Bonavita, M.A., 2014. Influence of DNA extraction method, 16S
rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial
diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic
ecosystems. Appl. Environ. Microbiol. 80, 4626–4639.
https://doi.org/10.1128/AEM.00592-14
Dr Maksum Radji, 2013. Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi
dan Kedokteran.
El mekes, A., Zahlane, K., Ait said, L., Tadlaoui Ouafi, A., Barakate, M., 2020.
The clinical and epidemiological risk factors of infections due to multi-drug
resistant bacteria in an adult intensive care unit of University Hospital Center
in Marrakesh-Morocco. J. Infect. Public Health 13, 637–643.
https://doi.org/10.1016/j.jiph.2019.08.012
Ethica, S.N., Saptaningtyas, R., Muchlissin, S.I., Sabdono, A., 2018. The
development method of bioremediation of hospital biomedical waste using
hydrolytic bacteria. Health Technol. (Berl). 8, 239–254.
https://doi.org/10.1007/s12553-018-0232-8

43
 44

Fatchiyah, Arumingtyas, E.L., Widyati, S., Rahayu, S., 2011. BIOLOGI

MOLEKULER- Prinsip Dasar Analisis.
Guria, M.K., Sengupta, S., Bhattacharyya, M., Karmakar, P., 2020. Nanotube
mediated cell-to-cell communication and cannibalism in
&lt;em&gt;Halobacillus&lt;/em&gt; sp. GSS1 isolated from Sundarbans,
India: A cryptic story of survival under nutrient-limiting condition. bioRxiv
2020.10.20.340307.
Hewajuli, D.A., Dharmayanti, N., 2014. The Advance of Technology of Reverse
Transcriptase-Polymerase Chain Reaction in Identifying the Genome of
Avian Influenza and Newcastle Diseases. Indones. Bull. Anim. Vet. Sci. 24,
16–29. https://doi.org/10.14334/wartazoa.v24i1.1022
Inayatul, W.O., Muchlissin, S.I., Mukaromah, A.H., Darmawati, S., Ethica, S.N.,
2018. Isolasi Dan Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim Protease
Pseudomonas Stutzeri ISTD4 dari Tempe Gembus Pasca Fermentasi 1 Hari.
Semin. Nas. Edusaintek 102–109.
Irianto, K., 2013. MIKROBIOLOGI MEDIS. Alphabeta.
Josphine, J.S., Manjusha, W.A., Subathra, C., 2021. Evaluation of Antifouling
Potential of Staphylococcus Sp . Isolated from Marine Sea Water 25, 6650–
6661.
Khedr, A.I.M., Mohamed, G.A., Orabi, M.A.A., Ibrahim, S.R.M., Yamada, K.,
2015. Staphylopeptide A, a new cyclic tetrapeptide from culture broth of
Staphylococcus sp. Phytochem. Lett. 13, 11–14.
https://doi.org/10.1016/j.phytol.2015.05.007
Kresken, M., Körber-Irrgang, B., Korte-Berwanger, M., Pfennigwerth, N.,
Gatermann, S.G., Seifert, H., 2020. Dissemination of carbapenem-resistant
Pseudomonas aeruginosa isolates and their susceptibilities to ceftolozane-
tazobactam in Germany. Int. J. Antimicrob. Agents 55, 105959.
https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2020.105959
Lalitha, P., Veena, V., Vidhyapriya, P., Lakshmi, P., Krishna, R., Sakthivel, N.,
2016. Anticancer potential of pyrrole (1, 2, a) pyrazine 1, 4, dione,
hexahydro 3-(2-methyl propyl) (PPDHMP) extracted from a new marine
bacterium, Staphylococcus sp. strain MB30. Apoptosis 21, 566–577.
https://doi.org/10.1007/s10495-016-1221-x
Madilana, R.N., Wijayanti, D.P., Sabdono, A., 2018. Bakteri Simbion Karang
Porites dari Perairan Gunungkidul, Yogyakarta dan Aktivitas Antibakteri
terhadap Bakteri Patogen Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Bul.
Oseanografi Mar. 7, 43. https://doi.org/10.14710/buloma.v7i1.19044
Mellawati, J., Bachtiar, R., 2011. Sebaran Timbal Dan Kadmium Dalam Terumbu
Karang Perairan Kepulauan Seribu. J. Ecolab 5, 20–27.
https://doi.org/10.20886/jklh.2011.5.1.20-27
Moradali, M.F., Ghods, S., Rehm, B.H.A., 2017. Pseudomonas aeruginosa
lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front. Cell.
Infect. Microbiol. 7. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017.00039
Mulyani, Y., Purwanto, A., 2011. PERBANDINGAN BEBERAPA METODE
ISOLASI DNA UNTUK DETEKSI DINI KOI HERPES VIRUS ( KHV )
PADA IKAN MAS ( Cyprinus carpio L .) 1–16.
 45

Nugraheni, I.A., Setianah, H., Wibowo, D.S., Bioteknologi, P.S., Sains, F.,
Yogyakarta, U.A., Ika, K., Nugraheni, A., 2021. AKTIVITAS
ANTIBAKTERI DARI BAKTERI ENDOFIT ASAL AKAR CIPLUKAN
( Physalis angulata L .) TERHADAP Staphylococcus aureus DAN
Escherichia coli ( Physalis angulata L .) FOR Staphylococcus aureus AND
Escherichia coli 13, 48–55. https://doi.org/10.23917/biomedika.v13i1.11009
Prastiyanto, M.E., Wardoyo, F.A., Wilson, W., Darmawati, S., 2020. Antibacterial
Activity of Various Extracts of Averrhoa bilimbi against Multidrug Resistant
Bacteria. Biosaintifika J. Biol. Biol. Educ. 12, 163–168.
https://doi.org/10.15294/biosaintifika.v12i2.23600
Radjasa, O.K., S.I.O. Salasia, A. Sabdono, J. Weise, J.F. Imhoff, C.L. and M.J.R.,
2007. 170-174.Pdf. Int. J. Pharmacol.
Rahayu, M.A., Sulistyaningtyas, A.R., Darmawati, S., 2019. Isolasi Bakteri
Hidrolitik Penghasil Enzim Amilase dari Limbah Industri Tapioka. Pros.
Semin. Nas.
Sandycho, N., 2020. isolasi dan identifikasi molekuler bakteri penghasil enzim
protease pada wadi ikan belanak (moolgarda seheli) sekeuns gen 16S rRNA.
skripsi 38–39.
Sharma, A.R., Harunari, E., Zhou, T., Trianto, A., Igarashi, Y., 2019. Isolation
and biosynthesis of an unsaturated fatty acid with unusual methylation
pattern from a coral-associated bacterium Microbulbifer sp. Beilstein J. Org.
Chem. 15, 2327–2332. https://doi.org/10.3762/bjoc.15.225
Thompson, L.R., Sanders, J.G., McDonald, D., Amir, A., Ladau, J., Locey, K.J.,
Prill, R.J., Tripathi, A., Gibbons, S.M., Ackermann, G., Navas-Molina, J.A.,
Janssen, S., Kopylova, E., Vázquez-Baeza, Y., González, A., Morton, J.T.,
Mirarab, S., Xu, Z.Z., Jiang, L., Haroon, M.F., Kanbar, J., Zhu, Q., Song,
S.J., Kosciolek, T., Bokulich, N.A., Lefler, J., Brislawn, C.J., Humphrey, G.,
Owens, S.M., Hampton-Marcell, J., Berg-Lyons, D., McKenzie, V., Fierer,
N., Fuhrman, J.A., Clauset, A., Stevens, R.L., Shade, A., Pollard, K.S.,
Goodwin, K.D., Jansson, J.K., Gilbert, J.A., Knight, R., Agosto Rivera, J.L.,
Al-Moosawi, L., Alverdy, J., Amato, K.R., Andras, J., Angenent, L.T.,
Antonopoulos, D.A., Apprill, A., Armitage, D., Ballantine, K., Bárta, J.,
Baum, J.K., Berry, A., Bhatnagar, A., Bhatnagar, M., Biddle, J.F., Bittner,
L., Boldgiv, B., Bottos, E., Boyer, D.M., Braun, J., Brazelton, W., Brearley,
F.Q., Campbell, A.H., Caporaso, J.G., Cardona, C., Carroll, J.L., Cary, S.C.,
Casper, B.B., Charles, T.C., Chu, H., Claar, D.C., Clark, R.G., Clayton, J.B.,
Clemente, J.C., Cochran, A., Coleman, M.L., Collins, G., Colwell, R.R.,
Contreras, M., Crary, B.B., Creer, S., Cristol, D.A., Crump, B.C., Cui, D.,
Daly, S.E., Davalos, L., Dawson, R.D., Defazio, J., Delsuc, F., Dionisi,
H.M., Dominguez-Bello, M.G., Dowell, R., Dubinsky, E.A., Dunn, P.O.,
Ercolini, D., Espinoza, R.E., Ezenwa, V., Fenner, N., Findlay, H.S., Fleming,
I.D., Fogliano, V., Forsman, A., Freeman, C., Friedman, E.S., Galindo, G.,
Garcia, L., Garcia-Amado, M.A., Garshelis, D., Gasser, R.B., Gerdts, G.,
Gibson, M.K., Gifford, I., Gill, R.T., Giray, T., Gittel, A., Golyshin, P.,
Gong, D., Grossart, H.P., Guyton, K., Haig, S.J., Hale, V., Hall, R.S.,
Hallam, S.J., Handley, K.M., Hasan, N.A., Haydon, S.R., Hickman, J.E.,
 46

Hidalgo, G., Hofmockel, K.S., Hooker, J., Hulth, S., Hultman, J., Hyde, E.,
Ibáñez-Álamo, J.D., Jastrow, J.D., Jex, A.R., Johnson, L.S., Johnston, E.R.,
Joseph, S., Jurburg, S.D., Jurelevicius, D., Karlsson, A., Karlsson, R.,
Kauppinen, S., Kellogg, C.T.E., Kennedy, S.J., Kerkhof, L.J., King, G.M.,
Kling, G.W., Koehler, A. V., Krezalek, M., Kueneman, J., Lamendella, R.,
Landon, E.M., Lanede Graaf, K., LaRoche, J., Larsen, P., Laverock, B., Lax,
S., Lentino, M., Levin, I.I., Liancourt, P., Liang, W., Linz, A.M., Lipson,
D.A., Liu, Y., Lladser, M.E., Lozada, M., Spirito, C.M., MacCormack, W.P.,
MacRae-Crerar, A., Magris, M., Martín-Platero, A.M., Martín-Vivaldi, M.,
Martínez, L.M., Martínez-Bueno, M., Marzinelli, E.M., Mason, O.U., Mayer,
G.D., McDevitt-Irwin, J.M., McDonald, J.E., McGuire, K.L., McMahon,
K.D., McMinds, R., Medina, M., Mendelson, J.R., Metcalf, J.L., Meyer, F.,
Michelangeli, F., Miller, K., Mills, D.A., Minich, J., Mocali, S., Moitinho-
Silva, L., Moore, A., Morgan-Kiss, R.M., Munroe, P., Myrold, D., Neufeld,
J.D., Ni, Y., Nicol, G.W., Nielsen, S., Nissimov, J.I., Niu, K., Nolan, M.J.,
Noyce, K., O’Brien, S.L., Okamoto, N., Orlando, L., Castellano, Y.O.,
Osuolale, O., Oswald, W., Parnell, J., Peralta-Sánchez, J.M., Petraitis, P.,
Pfister, C., Pilon-Smits, E., Piombino, P., Pointing, S.B., Pollock, F.J., Potter,
C., Prithiviraj, B., Quince, C., Rani, A., Ranjan, R., Rao, S., Rees, A.P.,
Richardson, M., Riebesell, U., Robinson, C., Rockne, K.J., Rodriguezl, S.M.,
Rohwer, F., Roundstone, W., Safran, R.J., Sangwan, N., Sanz, V., Schrenk,
M., Schrenzel, M.D., Scott, N.M., Seger, R.L., Seguinorlando, A., Seldin, L.,
Seyler, L.M., Shakhsheer, B., Sheets, G.M., Shen, C., Shi, Y., Shin, H.,
Shogan, B.D., Shutler, D., Siegel, J., Simmons, S., Sjöling, S., Smith, D.P.,
Soler, J.J., Sperling, M., Steinberg, P.D., Stephens, B., Stevens, M.A.,
Taghavi, S., Tai, V., Tait, K., Tan, C.L., Taş, N., Taylor, D.L., Thomas, T.,
Timling, I., Turner, B.L., Urich, T., Ursell, L.K., Van Der Lelie, D., Van
Treuren, W., Van Zwieten, L., Vargas-Robles, D., Thurber, R.V., Vitaglione,
P., Walker, D.A., Walters, W.A., Wang, S., Wang, T., Weaver, T., Webster,
N.S., Wehrle, B., Weisenhorn, P., Weiss, S., Werner, J.J., West, K.,
Whitehead, A., Whitehead, S.R., Whittingham, L.A., Willerslev, E.,
Williams, A.E., Wood, S.A., Woodhams, D.C., Yang, Y., Zaneveld, J.,
Zarraonaindia, I., Zhang, Q., Zhao, H., 2017. A communal catalogue reveals
Earth’s multiscale microbial diversity. Nature 551, 457–463.
https://doi.org/10.1038/nature24621
Willis, C., Desai, D., Laroche, J., 2019. Influence of 16S rRNA variable region on
perceived diversity of marine microbial communities of the Northern North
Atlantic. FEMS Microbiol. Lett. 366, 1–9.
https://doi.org/10.1093/femsle/fnz152
Yu, Z., Morrison, M., 2004. Comparisons of different hypervariable regions of rrs
genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing
gradient gel electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 70, 4800–4806.
https://doi.org/10.1128/AEM.70.8.4800-4806.2004
Yulvizar, C., 2013. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik pada Rastrelliger sp.
Isolation and Identification of Probiotic Bacteria in Rastrelliger sp.
Biospecies 6, 1–7.
 LAMPIRAN

LAMPIRAN 1 PEMBUATAN MEDIA

1.1 MEDIA ZOBELL MARINE AGAR 2216E

A. Perhitungan:
1L/1000mL→55,25 gram

B. Alat dan Bahan:

1. Erlenmeyer
5. Beaker Glass
2. Timbangan Neraca
6. Media Zobell
3. Kompor
2216E
4. Sendok Pengaduk
7. Aquadest

C. Prosedur:
1. Ditimbang sampel sebanyak 55,25 gram.
2. Dilarutkan dengan aquadest 1000mL
3. Dipanaskan media diatas kompor
4. Dipindahkan kedalam erlenmeyer
5. Ditutup dengan menggunakan kapas dan dibungkus dengan kertas
6. Diautoclaf selama 75 menit
7. Dituangkan pada cawan petri sebanyak 25mL
8. Ditunggu hingga mengeras
9. Media dapat digunakan

1.2 PEMBUATAN MEDIA MC

A. Perhitungan:

1000mL→ 52 gram
125mL → x
X = 52
125 1000
X= 6,5 gram
B. Alat dan Bahan:
1. Erlenmeyer 5. Beaker Glass
2. Timbangan Neraca 6. Media MC
3. Kompor 7. Aquadest

47
 48

4. Sendok Pengaduk
C. Prosedur Kerja:
1. Ditimbang Media MC Sebanyak 6,5 gram dengan Neraca Analitik
2. Dilarutkan dengan Aquadest Sebanyak 125mL
3. Dipanaskan dengan Menggunakan Kompor
4. Dipindahkan Kedalam Erlenmeyer
5. Ditutup dengan Menggunakan Kapas dan Dibungkus dengan Kertas
6. Diautoclaf selama 75 Menit
7. Dituang Pada Cawan Petri
8. Ditunggu Hingga Mengeras
9. Media Siap Digunakan

1.3PEMBUATAN MEDIA MHB

A. Perhitungan:
Agar : 500mL→ 2 gram
MHB: 1000mL→ 21 gram
45mL → x
45mL → x
500 = 45
1000 = 45
2 x
21 x
X= 0,95 gram X= 0,2 gram

B. Alat dan Bahan:

1. Tabung Reaksi 6. Gelas Ukur
2. Neraca analitik 7. Media MHB
3. Kompor 8. Aquadest
4. Batang Pengaduk
5. Agar-agar

C. Prosedur Kerja:
1. Ditimbang media MHB sebanyak 0,95 gram dengan neraca analitik
2. Ditimbang media agar sebanyak 0,2 gram dengan neraca analitik
3. Dipanaskan aquadest dengan menggunakan panci sebanyak 45mL diatas
kompor
4. Dimasukkan media MHB dan agar yang sudah ditimbang
5. Dihomogenkan sampai larut sempurna
6. Dituang kedalam tabung reaksi sebanyak 9mL tiap tabung
7. Diautoclaf selama 75menit
8. Ditunggu Hingga Mengeras
9. Media Siap Digunakan
 49

1.4 PEMBUATAN STANDARD MAC FARLAND 0,5

A. Alat dan Bahan:
1. Tabung reaksi 4. Rak Tabung
2. Mikropipet 5. H2SO4
3. Tip 6. BaCl2

B. Prosedur Kerja:
1. Diambil H2SO4 sebanyak 9,950uL menggunakan mikropipet, dimasukkan
kedalam tabung reaksi
2. Diambil BaCl2 sebanyak 50uL menggunakan mikropipet, dimasukkan
kedalam tabung reaksi
3. Dihomogenkan

1.5 PEMBUATAN MEDIA MHA

A. Perhitungan:
Perhitungan ketebalan media MHA 0,6:

Volume: La x tinggi Perhitungan penimbangan:

:Πr2 x t 1000mL→ 38 gram

: 3,14 x (4,5)2 x 0,6 38,15mL → x

: 38,151 mL/ tabung X = 38

38,15 1000
X= 1,45 gram

B. Alat dan Bahan:

1. Erlenmeyer 4. Batang pengaduk
2. Neraca Analitik 5. Media MHA
3. Panci 6. Aquadest

C. Prosedur Kerja:
1. Ditimbang media MHA sebanyak 1,9 gram dengan neraca analitik
2. Dilarutkan dengan Aquadest Sebanyak 50mL
3. Dipanaskan dengan Menggunakan Kompor
4. Dipindahkan Kedalam Erlenmeyer
5. Ditutup dengan Menggunakan Kapas dan Dibungkus dengan Kertas
6. Diautoclaf selama 75 Menit
 50

7. Dituang Pada Cawan Petri

8. Ditunggu Hingga Mengeras
1.6 PEMBUATAN MEDIA BHI
A. Perhitungan:
1000mL→ 37gram
30mL → x
X = 37
30 1000
X = 1,11gram

B. Alat dan Bahan:

5. Batang pengaduk
1. Tabung reaksi
6. Media MHA
2. Neraca Analitik
7. Aquadest
3. Kompor
4. Panci

C. Prosedur Kerja:
1. Ditimbang media BHI sebanyak 1,11gram
2. Dilarutkan dengan Aquadest Sebanyak 50mL
3. Dipanaskan dengan Menggunakan Kompor
4. Dipindahkan kedalam tabung reaksi dengan volume 6mL
5. Ditutup dengan Menggunakan Kapas dan Dibungkus dengan Kertas
6. Diautoclaf selama 75 Menit
7. Media siap digunakan
 51

LAMPIRAN 2 KEGIATAN PENELITIAN

Penimbangan Sampel Karang Pencucian Karang Porites sp

Porites sp

Pengenceran bertingkat
Meghaluskan Karang Porites
Karang Porites sp
sp

Pemurnian Isolat PRbg1- Uji aktivitas antibakteri isolat

PRbg8 PRbg1-PRbg8 terhadap CRPA
 52

plifikasi DNA genom Isolasi DNA genom bakteri

eri PRbg4

Uji katalase dan oksidase

Elektroforesis Gel 2%
bakteri CRPA

LAMPIRAN 3 HASIL SEKUENSING

3.1 BLAST
 53

GGGGGGCGGGTTGCTATAATGCAGTCGAGCGAACAGATGAGAAGCTTGCTTCTCT
GATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGG
ATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCAGGGTTCA
ATAGTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTATAGATGGACCCGCGCCGTATTAGCT
AGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATACGTACCCGACCTGAGAGGGT
GATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA
GGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGA
AGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAATTTGTTAGTAACT
GAACAAGTCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG
CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCG
CGTAGGCGGTTTCTTAATTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTC
ATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAGTGGAATTCCATGTGTAGCG
GTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCT
GTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGG
TAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGT
GCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAA
CTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGA
AGCAACGCGACAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCGCTCTAGAGATA
 54

GAGTCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTC
GTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTT
GCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG
TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTAC
AATGGATAATACAAAGGGCAGCGAATCCGCGAGGCCAAGCAAATCCCATAAAATT
ATTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAG
TAATCGTAGATCAGCATGGTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGC
CCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTTAGGAG
CTAGCT

Urutan Basa Nitrogen