TUGAS AKHIR
Disusun Oleh:
Wiwit Setyowati
G1C017037
Wiwit Setyowati
G1C17037
Pembimbing I Pembimbing II
ii
HALAMAN PENGESAHAN
Tanggal Sidang:
iii
SURAT PERNYATAAN
Jika dikemudian hari ternyata saya melakukan tindakan plagiarism, saya akan
bertanggungjawab sepenuhnya dan menerima sanksi yang dijatuhkan
Universitas Muhammadiyah Semarang kepada saya.
(Wiwit Setyowati)
iv
KATA PENGANTAR
Assalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh
Segala puji syukur kehadirat Allah SWT, yang telah melimpahkan rahmat,
nikmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan Tugas Akhir
yang berjudul “Identifikasi Bakteri PRbg4 Simbion Porites sp dan Uji Aktivitas
Antibakteri Terhadap Carbapenem Resistant Pseudomonas aeruginosa Berbasis
16S r RNA”
v
7. Rekan – rekan Diploma IV Analis Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semarang angkatan 2017
Penulis menyadari masih banyak ketidak sempurnaan dan kekurangan
dalam penulisan Proposal Tugas Akhir ini. Kritik dan saran yang membangun
diharapkan dari para pembaca. Semoga Tugas Akhir ini dapat bermanfaat bagi
para pembaca.
Wiwit Setyowati
NIM. G1C017037
DAFTAR ISI
vi
HALAMAN PERSETUJUAN................................................................................ii
KATA PENGANTAR.............................................................................................v
DAFTAR ISI..........................................................................................................vii
BAB I.....................................................................................................................12
PENDAHULUAN.................................................................................................12
1.1 Latar Belakang........................................................................................12
1.2 Rumusan Masalah...................................................................................15
1.3 Tujuan Penlitian......................................................................................15
1.4 Manfaat Penelitian...................................................................................16
1.4.1 Bagi Ilmu Pengetahuan....................................................................16
1.4.2 Bagi Peneliti.....................................................................................16
1.4.3 Bagi Institusi....................................................................................16
1.4.4 Bagi Masyarakat..............................................................................16
1.5 Originalitas Penelitian.............................................................................17
BAB II....................................................................................................................19
TINJAUAN PUSTAKA........................................................................................19
2.1 Pseudomonas aeruginosa........................................................................19
2.2 Carbapenem Resistant Pseudomonas aeruginosa (CRPA)....................20
2.3 Karang Porites sp....................................................................................20
2.4 Isolasi Bakteri dari Karang Porites sp....................................................21
2.5 Uji Aktivitas Antibakteri.........................................................................21
2.6 Polymerase Chain Reaction(PCR)..........................................................22
2.7 Tahapan Proses PCR...............................................................................23
2.8 Sekuensing Gen 16S rRNA.....................................................................23
2.9 Kerangka Teori........................................................................................26
2.10 Kerangka Konsep....................................................................................27
BAB III..................................................................................................................28
METODE PENELITIAN.......................................................................................28
3.1 Jenis Penelitian........................................................................................28
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian.................................................................28
3.2.1 Tempat.............................................................................................28
vii
3.2.2 Waktu...............................................................................................28
3.3 Variabel Penelitian..................................................................................28
3.3.1 Variabel Bebas.................................................................................28
3.3.2 Variabel Terikat...............................................................................28
3.4 Definisi operasional.................................................................................29
3.5 Obyek Penelitian/ Populasi dan Sampel..................................................29
3.6 Alat dan Bahan.............................................................................................30
3.6.1 Alat.......................................................................................................30
3.6.2 Bahan.....................................................................................................30
3.7 Prosedur Penelitian......................................................................................31
3.7.1 Sterilisasi Alat.......................................................................................31
3.7.2 Koleksi karang Porites sp......................................................................31
3.7.3 Isolasi bakteri Karang Porites sp.....................................................31
3.8 Uji Aktivitas Antibakteri..............................................................................32
3.8.1 Persiapan Bakteri Uji CRPA.................................................................32
3.8.2 Uji Daya Hambat...................................................................................32
3.9 Analisis Molekuler 16S rRNA................................................................33
3.9.1 Isolasi DNA Genom Bakteri............................................................33
3.9.1.1 Preparasi Sampel Bakteri Gram Positif...........................................33
3.9.1.2 Pelisisan Sel.....................................................................................33
3.9.1.3 Pengikatan DNA..............................................................................34
3.9.1.4 Pencucian DNA................................................................................34
3.9.1.5 Elusi.................................................................................................34
3.9.2 Kuantitas Ekstrak DNA...................................................................35
3.9.3 Amplifikasi DNA dengan Primer Gen 16S rRNA...........................35
3.9.4 Analisis Sekuensing.........................................................................36
3.10 Alur Penelitian............................................................................................37
3.11 Teknik Pengumpulan Data......................................................................38
BAB IV..................................................................................................................39
HASIL DAN PEMBAHASAN..............................................................................39
4.1 Hasil Penelitian.............................................................................................39
viii
4.1.1 Gambaran Sampel..................................................................................39
4.1.2 Isolasi dan Identifikasi Koloni Bakteri..................................................39
4.1.3 Identifikasi Isolat Bakteri dengan Pewarnaan Gram.............................41
4.1.4 Uji Daya Hambat...................................................................................43
4.1.5 Isolasi DNA Bakteri Penghambat CRPA..............................................45
4.1.6 Hasil Kemurian Ekstrak DNA Bakteri..................................................45
4.1.7 Amplifikasi PCR Gen 16S rRNA..........................................................45
4.1.8 Gel Elektroforesis 2%............................................................................46
4.1.9 Sekuensing Gen 16S rRNA...................................................................46
4.2 Pembahasan..................................................................................................48
BAB V....................................................................................................................53
PENUTUP..............................................................................................................53
5.1 Kesimpulan...................................................................................................53
5.2 Saran.............................................................................................................53
DAFTAR PUSTAKA............................................................................................54
DAFTAR TABEL
1.Originalitas Penelitian................................................................................11
2.Definisi Operasional...................................................................................22
3. Morfologi Koloni Bakteri..........................................................................41
ix
4. Pengecatan Gram Koloni Bakteri..............................................................41
5. Uji aktivitas antibakteri isolat Porites sp terhadap CRPA.........................43
6. Standar Pengujian Antibiotik Terhadap CRPA (CLSI, 2011)...................44
7. Hasil Kemurnian DNA Bakteri..................................................................45
DAFTAR GAMBAR
1.Kerangka Teori...................................................................................................19
2.Kerangka Konsep...............................................................................................20
3. Lokasi Pengambilan Sampel Karang Porites sp di Pantai Gosong...................28
4.Alur Penelitian....................................................................................................37
x
5. Karang Porites sp..............................................................................................39
6. Hasil isolatkKarang Porites sp..........................................................................40
7. Hasil pewarnaan Gram......................................................................................42
8. Hasil Zona hmambat isolat Karang Porites sp terhadap CRPA dan
kontrol....................................................................................................................44
9. Pita Gel El46ektroforesis...................................................................................46
10. Hubungan Kerabat yang mendekati PRbg4.....................................................47
11. Pohon Filogenetik Isolat PRbg4......................................................................47
xi
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri patogen oportunistik yang
sebagai penyebab utama morbiditas dan mortalitas pada pasien Cystic Fibrosis
(CF) dan sebagai salah satu penyebab utama infeksi nosokomial(Moradali et al.,
fibrosis kistik dan penyakit paru obstruktif kronik, serta infeksi saluran kemih
kronis pada pasien dengan kateter kandung kemih permanen, dan pneumonia
terkait ventilator pada pasien yang diintubasi, dan juga merupakan patogen
utama dalam luka kronis. Pseudomonas aeruginosa adalah salah satu dari enam
penyebab utama komplikasi dalam terapi penyakit menular (El mekes et al.,
2020).
bakteri terhadap setidaknya satu agen dengan tiga atau lebih kategori antibiotik
12
13
et al., 2020). Penelitian yang dilakukan Pusat Rumah Sakit Universitas Marakesh-
Maroko dengan pemeriksaan sampel sebanyak 479 pasien, terdapat 305 bakteri
(10%) dan strain bakteri lainnya (5%) (El mekes et al., 2020). Pemeriksaan
laboratorium pada pasien dewasa klinik paru, The Jordan University Hospital
ditemukan pada tahun 2015 sebanyak 52,5% di klinik paru (Al Dawodeyah et al.,
2018). Karbapenem anti pseudomonal adalah salah satu agen antimikroba yang
terhadap amikasin dan atau tobramycin) (Kresken et al., 2020). Pasien dengan
infeksi yang disebabkan oleh bakteri MDR memiliki resiko yang lebih buruk
karena sifatnya yang sulit pengobatan dan kemungkinan kematian yang tinggi.
Infeksi yang diisebabkan oleh bakteri MDR juga menghabiskan lebih banyak
14
Diperlukan adanya solusi antibitotik yang bersumber dari alam dengan daya
kerja optimal dan realtif lebih aman. Memanfaatkan organisme laut yang
et al., 2018). Jenis orgaisme laut yang banyak dijumpai di Laut Indonesia adalah
terumbu karang. Salah satu jenisnya adalah Karang Porites sp yang dapat
yang dapat digunakan sebagai antimikroba sama seperti di inangnya. Hal ini
dengan proses Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR 16S rRNA digunakan
(Madilana et al., 2018) Analisi gen penyandi 16S rRNA digunakan sebagai
15
dalam kondisi apapun) dengan fungsi identik pada semua bakteri. Gen 16S
rRNA memiliki daerah urutan basa yang konservatif dan juga ada yang variatif.
lebih besar bahkan dapat menyebabkan tingkat kematian yang tinggi. Sehingga
berasosiasi dengan karang laut untuk daya hambat terhadap bakteri CRPA
bioaktif yang berasal dari bahan alami dari sumber laut untuk
CRPA.
aureus dan Escherichia coli dan pada penelitian Meezan Ardhanu isolasi
Bakteri ini merupakan bakteri gram negatif, mempunyai flagel tunggal yang
bersifat polar atau terkadang terdiri atas 2-3 flagel, berbentuk batang dan
klinik sering kali mempunyai pili yang berperan penting dalam pelekatan pada
2013)
tetapi jarang terdapat pada flora orang yang sehat. Jumlah pembawa meningkat
tempat hidup P. aureginosa, seperti bak cuci, keran air dan disinfektan yang
Kingdom : Prokariota
Divisi : Protophyta
Kelas : Schizomycetes
Bangsa : Pseudomonadales
Suku : Pseudomonadaceae
Marga : Pseudomonas
Jenis : Pseudomonas aeruginosa
19
20
yang mampu menginfeksi manusia dengan pertahanan alami yang terganggu dan
menyebabkan penyakit paru yang parah. Ini adalah salah satu yang terdepan
yang tidak teratur. Karbapenem anti pseudomonal adalah salah satu agen
Struktur terumbu karang didominasi endapan batu kapur yang bersifat masif
satu karang yang keras (hard coral) yaitu Porites sp dengan bentuk yang hampir
Kingdom :Animalia
Phylum :Cnidaria
Kelas :Anthozoa
Sub Kelas :Hexacorallia
Family :Poritidae
Genus :Porites
2.4 Isolasi Bakteri dari Karang Porites sp
2216E( media agar laut) dengan pengambilan secara steril menggunakan zipplock
disterilkan menggunakan air laut steril dan dihaluskan menggunakan mortar steril.
Kemudian dihomogenisasi secara serial dan diencerkan 10-1 sampai 10-4 dan
disebar pada media Zobell 2216E, diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam.
Setiap satu cawan petri yang berisikan media Zobell 2216E ditanam 4 jenis isolat
selama 48jam. Bakteri patogen CRPA ditanam pada media MC dan diinkubasi
selama 24 jam, seteah proses inkubasi bakteri CRPA dibuat suspensi sesuai
dengan standar MCFarland(0,5 x 10⁸ cfu/ml) diambil sebanyak 1mL(1% dari total
volume soft agar) lalu dimasukkan kedalam 9mL soft agar media MHB(Muller
Hinton Broth) kemudian tuang kedalam media yang berisi isolat bakteri simbion
22
karang laut, inkubasi selama 24 jam dan amati aktivitas bakteri yang dapat
menghambat bakteri patogen CRPA akan terbentuk zona bening disekitar koloni.
sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro.Teknik PCR pertama kali ditemukan
oleh Mullis pada tahun 1985. PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi
segmen DNA dengan jumlah hingga jutaan dalam waktu beberapa jam (Handoyo
adanya enzim yaitu enzim polimerase. Enzim polimerase adalah enzim yang
DNA yang panjang. Enzim polymerase membutuhkan primer atau cetakan DNA
seperti nukleotida yang terdiri atas: Adenin (A), Tymine (T), Guanin (G) dan
Cytosine(C).
(dNTP) mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi efektif ion yang
mengandung 10-50mM Tris-HCl pH 8,8 suhu 20 oC, 50mM KCl 0,1% gelati atau
Bouvine Saline Albumin (BSA) dan tween 20 sebanyak 0,01% (Budiarto, 2015).
23
Tahapan yang penting pada PCR yang berlangsung cepat dan selalu berulang 30-
a. Denaturasi
proses pembukaan untai ganda DNAmenjadi untai tunggal yang terjadi sebelum
cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Proses
ini berlangsung selama 30-45 detik dengan suhu 50-68oC. Jika primer semakin
DNA dengan enzim polimerase dan primer dengan suhu 70-78oC dan meghasilkan
copy an DNA yang berfungsi sebagai DNA cetakan pada siklus selanjutnya
dengan analisis gen 16S rRNA ( 16S Ribosomal Ribonucleic Acid/ Ribonukleat
(Inayatul et al., 2018). Urutan Ribosomal RNA (rRNA), baik 16S rRNA untuk
Archaea, bakteri dan kloroplas atau 18S rRNA untuk eukariota, adalah standar
komunitas mikroba dengan sangat rinci (Thompson et al., 2017). Sekuen gen
penyandi 16S rRNA merupakan molekul yang sempurna karena memiliki daerah
conserved (dipertahankan) dan fungsi yang konstan pada tiap organisme, tersebar
secara universal, dan mempunyai urutan sekuen yang terkonservasi dengan baik
Urutan gen 16S rRNA akan memberikan hasil terbaik untuk karakterisasi
taksonomi, namun keterbatasan teknologi pada panjang urutan pembacaan saat ini
membatasi pendekatan ini pada bagian gen (Cruaud et al., 2014). Pemilihan
wilayah variabel dan primer diperlukan untuk memperkuat hasil, sehingga bias
yang mengakibatkan representasi kurang atau berlebihan dari berbagai taksa dan
dari keragaman dan kekayaan komunitas dapat di minimalisir (Yu and Morrison,
fitoplankton dari SSU kloroplas rRNA(Choi et al., 2017) , sedangkan V3-V4 dan
et al., 2017). Survei mikrobioma laut global yang dilakukan dalam ekspedisi Tara
( Sunagawa et al., 2015). desain primer universal untuk amplifikasi wilayah V4-
25
Primer yang digunakan yaitu primer universal 27F (Forward) dan primer
1492R (Reverse) dengan hasil produk PCR 1500bp. Urutan nukleotida primer 27F
bakteri CRPA. Uraian tersebut dapat dilihat pada skema dibawah ini.
BAB III
METODE PENELITIAN
studi pustaka.
3.2.1 Tempat
3.2.2 Waktu
Variabel bebas dari penelitian ini adalah isolat bakteri yang berasosiasi
Variabel terikat dari penelitian ini adalah hasil zona hambat isolasi bakteri
Karang Porites sp terhadap CRPA dan identifikasi molekuler isolat bakteri Karang
mortar lalu dilakukan pengenceran serial dan disebar pada media Zobell 2216E
lalu di inkubasi 48 jam, didapat isolat bakteri uji. Kemudian, diujikan dengan
30
Muhammadiyah Semarang.
3.6.1 Alat
Alat yang digunakan untuk uji antibakteri adalah autoclave (HMC
reaksi, cork borer (10 mm), ose, neraca analitik, rak tabung, beaker glass, mortar,
3.6.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Karang Porites sp,
subjek uji dalam penelitian ini adalah bakteri P.aerugionosa. Bahan yang
digunakan untuk kultur bakteri adalah media ZoBell 2216E, media uji aktivitas
antibakteri dan MHB (Mueller Hinton Broth), media penyubur BHI (Brain Heart
Vancominym dan Oxacilin sebagai control. Bahan yang digunakan untuk isolasi
DNA isolat PRbg3 dan PRbg4 adalah ddH 2O, Kit Presto TM Mini gDNA
Bacteria. Bahan yang dibutuhkan saat proses PCR adalah Master Mix (dNTPs,
Taq Polymerase, MgCl2, buffer PCR), Forward 27F, primer Reverse 1492R.
Bahan yang digunakan saat elektroforesis gel adalah agarose 2%, marker 1500bp,
31
Phospate Buffer Saline (PBS), biology molecular agarose marker, loading dye,
alat-alat gelas ditutup mulutnya dengan kapas dan dibungkus dengan kertas,
untuk cawan petri dibungkus kertas, kemudian semua alat tersebut dimasukkan ke
dalam autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 2 atm selama 90menit.
Gambar 3. Gambar
Lokasi Pengambilan Sampel
3. Karang Porites sp Karang Porites
yang berada disp di Pantai
Pantai Gosong,
Gosong,
Rembang,
Rembang, Jawa Tengah. Jawa Tengah
Indonesia. A-D (sumber:
merupakan dokumentasi pribadi) sampel,
lokasi pengambilan
dan E merupakan sampel Karang Porites sp yang diambil dari titik lokasi
( Sumber dokumentasi pribasi: Google Maps)
32
dalam coolbag. Sampel yang akan digunakan dibersihkan menggunakan air laut
dalam cawan petri yang berisi media ZoBell 2216E dan diinkubasi pada suhu 35
±2°C selama 48 jam untuk mendapatkan biakan bakteri yang berasosiasi dengan
Karang Porites sp. Berdasarkan isolat bakteri simbion yang berasosiasi dengan
suhu 35±2ºC selama 24 jam. Pada media BAP dipilih koloni dan diuji
(Radjasa dan Sabdono, 2006). Setiap satu ose bakteri simbion laut ditanam pada
cawan petri (berisi media zobell 2216E) dalam setiap cawan petri dibentuk 2-5
33
bakteri uji CRPA dilakukan satu hari sebelum overlay, bakteri uji CRPA
setelah bakteri uji tumbuh dalam waktu 24 jam dibuat suspensi standar McFarland
(0,5 x 10⁸ cfu/ml) diambil 1 mL (1% dari total volume soft agar) dan dimasukkan
ke dalam 9 mL soft agar media MHB (Muller Hinton Broth) kemudian di tuang
pada cawan petri yang berisi biakan isolat bakteri simbion laut, kemudian
ditambahkan ddH2O, lalu di vortex. Di inukbasi pada suhu 60oC selama 10 menit.
menit untuk memastikan sampel lisat bersih. Selama inkubasi, setiap 3 menit
sekali tabung dibolak- balikkan. Panaskan Elution Buffer pada suhu 70oC untuk
3.9.1.5 Elusi
matriks kolom. Diamkan selama 3 menit agar Elution Buffer terserap seluruhnya.
volume sampel yang dihasilkan yang diperlukan sebagai sampel dalam proses
Nanodrop dengan mengukur absorbansi DNA pada panjang gelombang 260 atau
Bahan- bahan reaksi PCR terdiri atas Go Taq Green Master Mix (12,5ul),
primer 27F sebanyak (2ul) dan primer 1492R sebanyak (2ul), template DNA
(1ul), dan ddH2O (7,5ul). Primer yang digunakan yaitu primer universal 27F
(Forward) dan primer 1492R (Reverse) dengan hasil produk PCR 1500bp. Urutan
3’. Tahapan awal pada proses PCR dengan alat thermal cycler adalah tahap
denaturasi memerlukan suhu yang tinggi yaitu 94oC selama 30 detik, annealing
dengan suhu 55oC selama 30 detik, ekstensi awal memerlukan waktu 1 menit
dengan suhu 72oC, ekstensi akhir dengan waktu 5 menit pada suhu 72 oC, pada
tahap cooling down memerlukan suhu 4oC. Siklus amplifikasi terjadi sebanyak 35
menggunakan gel agarose 2%. Tangki elektroforesis yang sudah diisi dengan
36
loading dye sebanyak 1ul dan tambahkan 4ul sampel kemudian resuspensi. Pipet
masukkan kedalam well pada gel agarose 2%. Pipet marker 5ul lalu masukkan
pada well agarose 2%. Hubungkan tangki elektroforesis dengan power supply,
lakukan running dengan tegangan 100 volt. Tunggu selama ± 1 jam kemudian
Produk hasil gen 16S rRNA dilanjutkan proses skeunsing. Hasil sekuensing
DNA bakteri dianalisis dan dicocokkan dengan data yang tersedia pada Gen Bank
Basic Lokal Aligment Search Tool (BLAST) pada NCBI dan Mega X.
37
Uji Aktivitas
Antibakteri
Pengumpulan data
yang terdiri dari data uji aktivitas antibakteri isolat Karang Porites sp terhadap
CRPA yang dihitung zona hambat yang terbentuk dengan satuan (mm), isolat
jenisnya berbasis Gen16S rRNA dan data yang diperoleh disusun kemudian
yang diperoleh dari Pantai Gosong, Rembang, Jawa Tengah dan biakan murni
metode berlapis dengan menggunakan dua media berbeda yaitu media zobell
dari sampel Karang Porites sp yang ditanam pada media Zobell 2216E. Koloni
yang ditemukan adalah sebayak delapan morforlogi koloni berbeda yang diberi
kode PRbg1, PRbg2, PRbg3, PRbg4, PRbg5, PRbg6, PRbg7, PRbg8. Setelah
39
40
A B C
D E F
G H
Gambar 6. Hasil isolatkKarang Porites sp, (A) isolat PRbg1, (B) isolat PRbg 2,
(C) isolat PRbg 3, (D) isolat PRbg 4, (E) isolat PRbg 5,
(F) isolat PRbg 6, (G) isolat PRbg 7, (H) isolat PRbg 8,
Sifat koloni
No Kode
Bentuk Warna Ukuran Tepi Elevasi Konsistensi
1. PRbg 1 Punctiform Putih 0,5mm Entire Convex Smooth
koloninya, akan dilanjutkan ke tahap pewarnaan Gram untuk melihat jenis dan
A B C
41
42
D E F
G H
Gambar 7. Hasil pewarnaan Gram (A) isolat PRbg1, (B) isolat PRbg 2,
(C) isolat PRbg 3, (D) isolat PRbg 4, (E) isolat PRbg 5,
(F) isolat PRbg 6, (G) isolat PRbg 7, (H) isolat PRbg 8,
Berdasarkan pewaran gram yang telah dilakukan, terdapat bakteri
Berbentuk coccus Gram- positif pada kode isolat PRbg1, PRbg4 dan
PRbg 5, coccus Gram- negatif pada kode isolat PRbg8, basil Gram positif pada
kode isolat PRbg6, basil Gram negatif pada kode isolat PRbg2, PRbg3 dan
43
sehingga tetap bewarna ungu yang disebabkan oleh gentian violet yang mengikat
bakteri, sedangkan Gram- negatif bewarna merah karena terdapat sisa Safranin
adanya zona hambat yang berbentuk zona bening disekitaran koloni. Hasil
A
C
Gambar 8: Hasil Zona hambat isolat Karang Porites sp terhadap CRPA dan
kontrol:
ditandai dengan adanya zona bening disekitar koloni. Uji sensitivitas bakteri
disekitar koloni dilakukan proses isolasi DNA. Proses ini bertujuan untuk
sedangkan 280nm adalah nilai maksimal residu protein atau fenol. DNA dapat
dikatakan murni jika memiliki rasio OD260/280 antara 1,8-2,0 (Fatchiyah et al.,
2011). Konsentrasi DNA template yang baik untuk dilakukan PCR adalah
hasil uji pada gelombang 260/280nm pada kode sampel PRbg4 sebesar 1.86 dan
amplifikasi PCR gen 16S rRNA sebagai DNA template. Primer yang digunakan
46
adalah primer universal gen 16S rRNA primer Forward 27F dan primer Reverse
PRbg4
X) dengan consesnsus sekuens Forward dan Reverse. Hasil pemetaan pasang basa
dengan fragmen gen 16S ribosomal RNA isolat bakteri Staphylococcus sp strain
4.2 Pembahasan
Penelitian diawal dengan isolasi bakteri simbion Karang Porites sp
bakteri murni dengan kode PRbg1, PRbg2, PRbg3, PRbg4, PRbg5, PRbg6,
dengan melihat bentuk, ukuran, warna, tepian, elevasi, dan konsistensi pada
overlay. Isolat bakteri ditumbuhkan pada media Zobell Marine Agar 2216E
sebanyak 4 isolat pada satu cawan petri, kemudian di inkubasi selama 48 jam
48
dengan suhu ±35oC. Komposisi utama Zobell Marine Agar 2216E adalah 0,5%
pepton, 0,1% ekstrak ragi, 0,01% besi fosfat dan 3% NaCl, dalam 1L media
Marine Agar 2216E digunakan pada penelitian ini karena adanya kandungan
mineral dan garam yang meniru komposisi air laut (Guria et al., 2020). Media soft
agar yaitu pencampuran MHB dan agar-agar digunakan untuk uji aktivitas
antibakteri. Peremajaan bakteri progen pada media MC, kemudian dibuat suspensi
bervolume 9mL, kemudian dituang pada media Zobell Marine Agar 2216E yang
berisi isolat murni. Inkubasi selama 24 jam pada suhu ±35oC. Terdapat 4 kriteria
daya hambat antibakteri yaitu: menghambat lemah (<5 mm), sedang (5-10 mm),
kuat (10-20 mm) dan sangat kuat (>20 mm) (Nugraheni et al., 2021). Terbentuk
zona bening di sekitar koloni pada isolat bakteri PRbg4 sebesar 15,25mm
dengan daya hambat kuat. Isolat bakteri PRbg4 dilakukan tahap selanjutnya yaitu
Mini GDNA Bacteria sehingga diperoleh DNA bakteri yang kemudian diukur
2,0 menunjukkan bahwa sampel DNA tidak murni yang disebabkan oleh adanya
sisa ethanol atau sisa kandungan metabolit sekunder bakteri (Fatchiyah et al.,
2011). Hasil ini menujukkan bahwa tidak terdapat kontaminasi protein atau fenol
isolat DNA PRbg4 yang diperoleh adalah 461.173ng/ul, maka perlu dilakukan
PCR. setelah dilakukan proses PCR untuk mengetahui besaran produk yang
2%. Hasil amplifikasi isolat DNA genom bakteri meunjukkan pita DNA sejajar
dengan marker pada nilai ±1500bp. Hasil amplifikasi yang diperoleh kemudian
dilakukan tahap sekuensing, dan dianalisis secara bioinformatika pada situs NCBI
aplikasi MEGAX.
kecocokannya dengan gen 16S rRNA yang dimiliki oleh bakteri lain pada Gen
pencocokan kemiripan hasil sekuensing dengan data pada Gen Bank kemudian
bulat dan motil. Hasil uji katalase positif dan oksidase negatif, mampu
memfermentasi laktosa dan sukrosa, dan tumbuh optimum pada temperatur 37ºC.
jaringan. Bakteri patogen pada dasarnya tidak bersifat toksik, akan tetapi dapat
menghasilkan berbagai enzim yang bersifat toksik dan berperan dalam proses
infeksi (Sandycho, 2020). Staphylococcus sp yang ditemukan pada sampel air laut
tanaman/ hewan laut pada bawah kapal) dengan kandungan metabolit sekunder
juga pada sedimen laut dalam yang berasal dari Teluk Benggala, India dan
51
Berat molekul PPDHMP ditentukan sebagai 211(MH) dengan rumus empiris pada
dari Aspergillus flavus dan Aspergillus para-sitius (Lalitha et al., 2016) Sehingga
sekunder dan dapat berpotensi sebagai antibateri dapat dikembangkan lebih baik
di masa yang akan datang dan dimanfaatkan dalam skala besar sebagai sumber
antibakteri.
52
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang dilakukan pada Karang Porites sp dapat
5.2 Saran
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dikemukakan, maka penulis
menyarankan:
2. Penelitian ini belum dapat dibilang sebagai sumber referensi baru sumber
53
DAFTAR PUSTAKA
Al Dawodeyah, H.Y., Obeidat, N., Abu-Qatouseh, L.F., Shehabi, A.A., 2018.
Antimicrobial resistance and putative virulence genes of Pseudomonas
aeruginosa isolates from patients with respiratory tract infection. Germs 8,
31–40. https://doi.org/10.18683/germs.2018.1130
Alhazmi, A., 2015. Pseudomonas aeruginosa – Pathogenesis and Pathogenic
Mechanisms. Int. J. Biol. 7, 44–67. https://doi.org/10.5539/ijb.v7n2p44
Asagabaldan, M.A., Bedoux, G., Bourgougnon, N., 2019. Bacterial isolates from
bryozoan Pleurocodonellina sp .: Diversity and antimicrobial potential
against pathogenic bacteria 20, 2528–2535.
https://doi.org/10.13057/biodiv/d200914
BABCHINSKII, F. V., 1963. Osobennosti Narusheni I Rechi Pri Dykhanii Pod
Izbytochnym Davleniem. Vestn. Otorinolaringol. 25, 10–14.
Budiarto, B.R., 2015. Polymerase Chain Reaction (Pcr) : Perkembangan Dan
Perannya Dalam Diagnostik Kesehatan. Polym. Chain React. Perkemb. Dan
Perannya Dalam Diagnostik Kesehat. 6, 29–38.
Choi, C.J., Bachy, C., Jaeger, G.S., Poirier, C., Sudek, L., Sarma, V.V.S.S.,
Mahadevan, A., Giovannoni, S.J., Worden, A.Z., 2017. Newly discovered
deep-branching marine plastid lineages are numerically rare but globally
distributed. Curr. Biol. 27, R15–R16.
https://doi.org/10.1016/j.cub.2016.11.032
Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T., 2019. Tolerance and resistance of pseudomonas
aeruginosabiofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosaCan escape
antibiotics. Front. Microbiol. 10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00913
Comeau, A.M., Douglas, G.M., Langille, M.G.I., 2017. Microbiome Helper: a
Custom and Streamlined Workflow for Microbiome Research. mSystems 2,
1–11. https://doi.org/10.1128/msystems.00127-16
Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P.E., Godfroy, A.,
Cambon-Bonavita, M.A., 2014. Influence of DNA extraction method, 16S
rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial
diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic
ecosystems. Appl. Environ. Microbiol. 80, 4626–4639.
https://doi.org/10.1128/AEM.00592-14
Dr Maksum Radji, 2013. Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi
dan Kedokteran.
El mekes, A., Zahlane, K., Ait said, L., Tadlaoui Ouafi, A., Barakate, M., 2020.
The clinical and epidemiological risk factors of infections due to multi-drug
resistant bacteria in an adult intensive care unit of University Hospital Center
in Marrakesh-Morocco. J. Infect. Public Health 13, 637–643.
https://doi.org/10.1016/j.jiph.2019.08.012
Ethica, S.N., Saptaningtyas, R., Muchlissin, S.I., Sabdono, A., 2018. The
development method of bioremediation of hospital biomedical waste using
hydrolytic bacteria. Health Technol. (Berl). 8, 239–254.
https://doi.org/10.1007/s12553-018-0232-8
54
55
Nugraheni, I.A., Setianah, H., Wibowo, D.S., Bioteknologi, P.S., Sains, F.,
Yogyakarta, U.A., Ika, K., Nugraheni, A., 2021. AKTIVITAS
ANTIBAKTERI DARI BAKTERI ENDOFIT ASAL AKAR CIPLUKAN
( Physalis angulata L .) TERHADAP Staphylococcus aureus DAN
Escherichia coli ( Physalis angulata L .) FOR Staphylococcus aureus AND
Escherichia coli 13, 48–55. https://doi.org/10.23917/biomedika.v13i1.11009
Prastiyanto, M.E., Wardoyo, F.A., Wilson, W., Darmawati, S., 2020. Antibacterial
Activity of Various Extracts of Averrhoa bilimbi against Multidrug Resistant
Bacteria. Biosaintifika J. Biol. Biol. Educ. 12, 163–168.
https://doi.org/10.15294/biosaintifika.v12i2.23600
Radjasa, O.K., S.I.O. Salasia, A. Sabdono, J. Weise, J.F. Imhoff, C.L. and M.J.R.,
2007. 170-174.Pdf. Int. J. Pharmacol.
Rahayu, M.A., Sulistyaningtyas, A.R., Darmawati, S., 2019. Isolasi Bakteri
Hidrolitik Penghasil Enzim Amilase dari Limbah Industri Tapioka. Pros.
Semin. Nas.
Sandycho, N., 2020. isolasi dan identifikasi molekuler bakteri penghasil enzim
protease pada wadi ikan belanak (moolgarda seheli) sekeuns gen 16S rRNA.
skripsi 38–39.
Thompson, L.R., Sanders, J.G., McDonald, D., Amir, A., Ladau, J., Locey, K.J.,
Prill, R.J., Tripathi, A., Gibbons, S.M., Ackermann, G., Navas-Molina, J.A.,
Janssen, S., Kopylova, E., Vázquez-Baeza, Y., González, A., Morton, J.T.,
Mirarab, S., Xu, Z.Z., Jiang, L., Haroon, M.F., Kanbar, J., Zhu, Q., Song,
S.J., Kosciolek, T., Bokulich, N.A., Lefler, J., Brislawn, C.J., Humphrey, G.,
Owens, S.M., Hampton-Marcell, J., Berg-Lyons, D., McKenzie, V., Fierer,
N., Fuhrman, J.A., Clauset, A., Stevens, R.L., Shade, A., Pollard, K.S.,
Goodwin, K.D., Jansson, J.K., Gilbert, J.A., Knight, R., Agosto Rivera, J.L.,
Al-Moosawi, L., Alverdy, J., Amato, K.R., Andras, J., Angenent, L.T.,
Antonopoulos, D.A., Apprill, A., Armitage, D., Ballantine, K., Bárta, J.,
Baum, J.K., Berry, A., Bhatnagar, A., Bhatnagar, M., Biddle, J.F., Bittner,
L., Boldgiv, B., Bottos, E., Boyer, D.M., Braun, J., Brazelton, W., Brearley,
F.Q., Campbell, A.H., Caporaso, J.G., Cardona, C., Carroll, J.L., Cary, S.C.,
Casper, B.B., Charles, T.C., Chu, H., Claar, D.C., Clark, R.G., Clayton, J.B.,
Clemente, J.C., Cochran, A., Coleman, M.L., Collins, G., Colwell, R.R.,
Contreras, M., Crary, B.B., Creer, S., Cristol, D.A., Crump, B.C., Cui, D.,
Daly, S.E., Davalos, L., Dawson, R.D., Defazio, J., Delsuc, F., Dionisi,
H.M., Dominguez-Bello, M.G., Dowell, R., Dubinsky, E.A., Dunn, P.O.,
Ercolini, D., Espinoza, R.E., Ezenwa, V., Fenner, N., Findlay, H.S., Fleming,
I.D., Fogliano, V., Forsman, A., Freeman, C., Friedman, E.S., Galindo, G.,
Garcia, L., Garcia-Amado, M.A., Garshelis, D., Gasser, R.B., Gerdts, G.,
Gibson, M.K., Gifford, I., Gill, R.T., Giray, T., Gittel, A., Golyshin, P.,
Gong, D., Grossart, H.P., Guyton, K., Haig, S.J., Hale, V., Hall, R.S.,
Hallam, S.J., Handley, K.M., Hasan, N.A., Haydon, S.R., Hickman, J.E.,
Hidalgo, G., Hofmockel, K.S., Hooker, J., Hulth, S., Hultman, J., Hyde, E.,
Ibáñez-Álamo, J.D., Jastrow, J.D., Jex, A.R., Johnson, L.S., Johnston, E.R.,
Joseph, S., Jurburg, S.D., Jurelevicius, D., Karlsson, A., Karlsson, R.,
Kauppinen, S., Kellogg, C.T.E., Kennedy, S.J., Kerkhof, L.J., King, G.M.,
57
Kling, G.W., Koehler, A. V., Krezalek, M., Kueneman, J., Lamendella, R.,
Landon, E.M., Lanede Graaf, K., LaRoche, J., Larsen, P., Laverock, B., Lax,
S., Lentino, M., Levin, I.I., Liancourt, P., Liang, W., Linz, A.M., Lipson,
D.A., Liu, Y., Lladser, M.E., Lozada, M., Spirito, C.M., MacCormack, W.P.,
MacRae-Crerar, A., Magris, M., Martín-Platero, A.M., Martín-Vivaldi, M.,
Martínez, L.M., Martínez-Bueno, M., Marzinelli, E.M., Mason, O.U., Mayer,
G.D., McDevitt-Irwin, J.M., McDonald, J.E., McGuire, K.L., McMahon,
K.D., McMinds, R., Medina, M., Mendelson, J.R., Metcalf, J.L., Meyer, F.,
Michelangeli, F., Miller, K., Mills, D.A., Minich, J., Mocali, S., Moitinho-
Silva, L., Moore, A., Morgan-Kiss, R.M., Munroe, P., Myrold, D., Neufeld,
J.D., Ni, Y., Nicol, G.W., Nielsen, S., Nissimov, J.I., Niu, K., Nolan, M.J.,
Noyce, K., O’Brien, S.L., Okamoto, N., Orlando, L., Castellano, Y.O.,
Osuolale, O., Oswald, W., Parnell, J., Peralta-Sánchez, J.M., Petraitis, P.,
Pfister, C., Pilon-Smits, E., Piombino, P., Pointing, S.B., Pollock, F.J., Potter,
C., Prithiviraj, B., Quince, C., Rani, A., Ranjan, R., Rao, S., Rees, A.P.,
Richardson, M., Riebesell, U., Robinson, C., Rockne, K.J., Rodriguezl, S.M.,
Rohwer, F., Roundstone, W., Safran, R.J., Sangwan, N., Sanz, V., Schrenk,
M., Schrenzel, M.D., Scott, N.M., Seger, R.L., Seguinorlando, A., Seldin, L.,
Seyler, L.M., Shakhsheer, B., Sheets, G.M., Shen, C., Shi, Y., Shin, H.,
Shogan, B.D., Shutler, D., Siegel, J., Simmons, S., Sjöling, S., Smith, D.P.,
Soler, J.J., Sperling, M., Steinberg, P.D., Stephens, B., Stevens, M.A.,
Taghavi, S., Tai, V., Tait, K., Tan, C.L., Taş, N., Taylor, D.L., Thomas, T.,
Timling, I., Turner, B.L., Urich, T., Ursell, L.K., Van Der Lelie, D., Van
Treuren, W., Van Zwieten, L., Vargas-Robles, D., Thurber, R.V., Vitaglione,
P., Walker, D.A., Walters, W.A., Wang, S., Wang, T., Weaver, T., Webster,
N.S., Wehrle, B., Weisenhorn, P., Weiss, S., Werner, J.J., West, K.,
Whitehead, A., Whitehead, S.R., Whittingham, L.A., Willerslev, E.,
Williams, A.E., Wood, S.A., Woodhams, D.C., Yang, Y., Zaneveld, J.,
Zarraonaindia, I., Zhang, Q., Zhao, H., 2017. A communal catalogue reveals
Earth’s multiscale microbial diversity. Nature 551, 457–463.
https://doi.org/10.1038/nature24621
Willis, C., Desai, D., Laroche, J., 2019. Influence of 16S rRNA variable region on
perceived diversity of marine microbial communities of the Northern North
Atlantic. FEMS Microbiol. Lett. 366, 1–9.
https://doi.org/10.1093/femsle/fnz152
Yu, Z., Morrison, M., 2004. Comparisons of different hypervariable regions of rrs
genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing
gradient gel electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 70, 4800–4806.
https://doi.org/10.1128/AEM.70.8.4800-4806.2004
Yulvizar, C., 2013. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik pada Rastrelliger sp.
Isolation and Identification of Probiotic Bacteria in Rastrelliger sp.
Biospecies 6, 1–7.
58