IDENTIFIKASI KONTAMINASI BAKTERI

DALAM SAMPEL OKULAR DARI

ENDOPHTHALMITIS PASCA OPERASI
DENGAN DETEKSI PCR

Author :
Majid Abrishami1, Behnam Hashemi2, Mojtaba Abrishami3, Khalil
Abnous4, Kamal Razavi-Azarkhiavi5, Javad Behravan6

Presented by :
LUQMANUL HAKIM
1802201010005

Review Article
Latar belakang:
 Endophthalmitis bakterial adalah komplikasi
bedah okuler yang mengancam mata yang
membutuhkan pertimbangan medis yang
mendesak termasuk diagnosis yang
komprehensif.
 Polymerase chain reaction (PCR) sebagai metode
molekuler sensitif telah banyak digunakan untuk
mendeteksi spesies mikroba dalam spesimen
klinis.
 PCR adalah suatu metoda pemeriksaan yang
prinsip kerjanya memperbanyak
(amplication)DNA invitro(dalam tabung) secara
enzimatis
 Endophthalmitis
disebabkan oleh
organisme yang beredar
melalui aliran darah ke
dalam mata atau telah
memasuki mata melalui
luka bedah atau luka.
Infeksi di dalam darah
berasal dari pemberian
obat-obatan secara infus,
abses (kumpulan nanah),
atau operasi apa saja di
dalam tubuh. infeksi
biasanya disebabkan
bakteri, namun jamur
atau protozoa bisa juga
bertanggungjawab
 Tujuan
 Penelitian ini dirancang untuk mengidentifikasi
organisme penyebab endophthalmitis menggunakan
prosedur PCR.
 Mengidentifikasi bakteri dengan sekuens 16S rRNA
 Gen 16S ribosomal RNA (16S rRNA) memiliki
daerah yang conserved (lestari) sehingga tepat
digunakan dalam Polymerase Chain Reaction
(PCR) dan analisis sekuensing untuk menentukan
taksonomi, filogeni dan keanekaragaman antar
spesies. Gen ini juga memiliki hypervariable region
yang merupakan ciri khas tiap mikroorganisme.
Analisis sekuensing gen 16S rRNA sudah banyak
digunakan di bidang mikrobiologi. Metode berbasis
molekuler ini dinilai cepat dan akurat dalam
mengidentifikasi bakteri patogen serta memiliki
sejumlah keunggulan dibandingkan metode
mikrobiologi konvensional.
Koleksi sampel
 Penelitian ini disetujui oleh Komite Etika Medis dari
Universitas Ilmu Kedokteran Mashhad Iran dan
mendapat persetujuan tertulis dari pasien untuk
partisipasi mereka dalam prosedur eksperimental.
Sampel vitreous dari 32 pasien (satu sampel dari
setiap pasien) dengan endophthalmitis pasca operasi
dikumpulkan. Usia populasi pasien berkisar antara 20
hingga 80 tahun dengan sebagian besar di atas usia
50 tahun
 Pasien yang sudah terapi antibakteri tidak termasuk
dalam penelitian
Metode
 Semua mata diambil sampelnya dengan cara yang
sama. Pengambilan sampel dilakukan di bawah
kondisi operasi steril. Aspirasi viter dilakukan
perlahan-lahan menggunakan jarum suntik steril.
 Spesimen dikumpulkan dalam tabung microfuge
pra-steril dan disimpan pada -20˚C untuk analisis
lebih lanjut
Ekstraksi DNA
 Total DNA vitreous diekstraksi menggunakan
QIAamp DNA minikit (Qiagen, CA, USA) sesuai
dengan instruksi pabrik.
Kuantifikasi DNA
 Kualitas DNA yang diekstraksi dinilai dengan
elektroforesis gel agarosa. Konsentrasi DNA
terisolasi juga ditentukan dengan Nanodrop ND
2000 pada 260 nm (Thermo Scientific, USA).
Amplifikasi/Perbanyakan PCR
 Gen bakteri 16S rRNA diamplifikasi dari DNA genom yang
diisolasi dari sampel vitreous menggunakan PCR dengan sepasang
primer universal HAD2 : F 5 'ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'
dan R 5’GTATTACCGCGGCTGCTGGCA 3 '.
 Reaksi PCR dilakukan dalam volume total 25 μl yang mengandung
2,5 µl buffer 10 × PCR (CinnaGene, Iran), 25 mM MgCl2, 10 mM
dNTP, 2 µl template DNA (50-500 ng), 0,1 μM masing-masing
primer, 1.0 U polimerase DNA Taq.
 Langkah denaturasi dilakukan pada 95˚C selama 5 menit, diikuti
oleh 25 siklus amplifikasi 95 ° C selama 1 menit, 54 ° C selama 30
detik, dan 72 ° C selama 1 menit, dengan langkah ekstensi akhir 20
menit. pada 72 ° C.
 Produk PCR diperiksa pada gel agarose 2% yang disiapkan dalam
buffer 1 x Tris-Borate-EDTA (TBE) dan divisualisasikan dengan
pewarnaan ethidium bromide di bawah sinar-uv
Kloning, Sekuensing Dna Dan
Analisis Urutan
 Perpustakaan produk PCR dari 16S rRNA, dikloning
ke dalam vektor pTZ57R / T (MBI Fermentas). Produk
ligated kemudian diubah menjadi E. coli DH 5A strain
dan tumbuh di piring LB-ampicillin X-Gal / IPTG.
Pemurnian plasmid dilakukan dari 32 koloni dengan
vektor rekombinan yang diubah menggunakan plasmid
purification kit (Sigma-Aldrich). Setelah ekstraksi
plasmid, PCR dengan kondisi seperti yang dijelaskan
di atas dilakukan. Akhirnya, produk PCR disekuensing
dan diidentifikasi dengan peledakan terhadap yang
tersedia di database Gen-Bank
Hasil
 Hasil PCR menunjukkan bahwa dari total 32
sampel endophthalmitis vitreous pasca operasi, 18
spesimen positif, menggambarkan adanya infeksi
bakteri (56,4%).
 Bacteria Number of cases
Escherichia coli 3 • Setelah dikloning secara
Enterobacter cloacae 3
Bacillus subtilis 4
berurutan, spesies
Neisseria gonorrhoeae 3 bakteri diidentifikasi
Streptococcus pneumoniae 3
Haemophilus influenzae 3
dengan peledakan
Chlamydia trachomatis 4 urutan 16S rRNA yang
Staphylococcus aureus 3
Neisseria meningitides 3
diketahui.
Staphylococcus epidermidis 3
Pseudomonas aeruginosa 2
Bacillus cereus 4
KESIMPULAN
 Dari hasil penelitian ini ditemukan beberapa
spesies bakteri termasuk Escherichia coli,
Enterobacter cloacae, Bacillus subtilis, Neisseria
gonorrhoeae, Streptococcus pneumonia,
Haemophilus influenza, Chlamydia trachomatis,
Staphylococcus aureus, Neisseria meningitides,
Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus cereus dalam vitreous
spesimen endophthalmitis
Terima kasih