LAPORAN PRAKTIKUM

PENYAKIT BAKTERIAL DAN MIKAL

“ASPERGILLOSIS”

Kelompok 1/ Paralel 5

Fathan Rahmadya Anfara B04180126

Nadilla Fahrani B04180130

Jevania Esterrina M B04180131

Muhammad Nurochman B04180135

DEPARTEMEN ILMU PENYAKIT HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2021
1. Unggas apa saja yang digunakan dalam penelitian tersebut dan bagaimana design
penelitiannya di masing masing unggas yang digunakan

a. Merpati Balap, Desain eksperimental. Percobaan pertama dilakukan untuk menentukan

dosis infeksi yang tepat. Tiga kelompok enam merpati diinokulasi secara
intratrakeal.Eksperimen kedua dilakukan untuk menguji dampak penggunaan rute
inokulasi yang berbeda dan imunosupresi pada perjalanan infeksi dengan A.fumigatus.
b. Kalkun, Enam anak ayam kalkun berumur 1 hari dilakukan euthanasia pada awal
percobaan (kontrol pra-inokulasi). Paru-paru mereka diangkat dan diinokulasi A.
fumigatus ke agar Sabouraud dekstrosa. Diinkubasi pada suhu 41°C dan keberadaan
koloni A. Fumigatus diperiksa setiap hari selama 1 minggu. Anak kalkun berumur 1 hari
yang tersisa dibagi secara acak menjadi dua kelompok. Setiap ayam dalam kelompok
yang terinfeksi (n 15) dianasthesi dengan injeksi intramuskular 15 ml ketamin dan 10 ml
diazepam (5 mg/kg), 15 ml imalgene 1000 mg/10 ml 10 ml valium, 5 mg/ml; kalkun ini
kemudian diinokulasi dengan injeksi transkutan ke dalam kantung udara toraks caudal
kanan dengan 100 ml suspensi spora a Kultur A. fumigatus umur 3 hari mengandung
spora. kalkun di kelompok kontrol (n 10) dianasthesi dan diberikan 20 ml larutan garam
steril. kalkun dari kedua kelompok ditempatkan secara terpisah kandang. Diamati
dengan cermat setidaknya dua kali sehari untuk munculnya gejala klinis. Tiga ekor
kalkun yang dipilih secara acak dari kelompok yang terinfeksi dan dua dari kelompok
kontrol euthanasia 1, 2, 3, 5 dan 7 hari.
c. Elang, Enam kelompok terdiri dari tiga elang masing-masing diinokulasi A. fumigatus
konidia 0,5 ml dengan jalur intratrakeal, dan satu kelompok tiga elang diinokulasi palsu
intratrakeal. Inokulasi dilakukan dengan anestesi general menggunakan isofluran
melalui tabung endotrakeal pediatrik. Diambil sampel darah sebanyak 1,3 ml dari sayap
(Vena basilica) sebelum permulaan inokulasi, diolesi hematologi, dan disentrifugasi
(2400 × g selama 10 menit pada 21°C) segera setelah diambil. Hematologi smear
diwarnai dengan pewarnaan Wright-Giemsa dan dievaluasi menurut prosedur standar.
Sampel plasma disimpan pada suhu 20°C dan diteruskan untuk analisis lebih lanjut dari
A. fumigatus antibodi, antigen A. fumigatus (Galactomannan dan beta-(1,3)-D-glukan),
toksin A. fumigatus (Fumigaclavin A), protein fase akut (Haptoglobin dan serum amiloid
A), dan elektroforesis protein plasma yang telah diterbitkan di tempat lain (Fischer et al.,
2014).

2. Bagaimana cara melakukan persiapan Aspergillus fumigatus yang akan digunakan

dimulai sejak melakukan pembiakan pada media biakan sampai memanen spora yang
akan digunakan.

Untuk mendapatkan spora aseksual (konidia), biakan ditumbuhkan pada agar YM

(ekstrak ragi 0,3%, ekstrak malt 0,3%, pepton 0,5%, dan agar 0,5%) pada suhu 378 C. Setelah
pertumbuhan 3 hari, sejumlah besar konidia dihasilkan dari sel-sel spesifik (phialid) yang
memancar dari vesikel di bagian atas hifa konidiofor. Konidia dipanen dengan membanjiri piring
dengan air suling steril. Mereka kemudian dipelet dengan sentrifugasi, dicuci dalam saline buffer
fosfat (0,15 M) dan dikuantifikasi menggunakan sel Malassez.
3. Bagaimana cara menghitung jumlah spora yang akan digunakan dan bagaimana cara
pemberiannya. Ada berapa metode pemberian atau aplikasi.

Merpati, tiga kelompok dari enam merpati diinokulasi secara intratrakeal dengan 0,2 ml
suspensi 106 atau 108 A. fumigatus conidia/ml HBSS atau 0,2 ml HBSS. Tujuh kelompok dari
empat merpati diinokulasi dengan 0,2 ml suspensi 108 A. fumigatus conidia/ml HBSS (Grup 4,
5, 6, 7 dan 8) atau 0,2 ml HBSS (Grup Kontrol 1 dan 2). Rute inokulasi: intratrakeal (Grup 8),
kantung udara toraks kanan (Grup 1, 4 dan 6) dan apical paru-paru kanan (Grup 2, 5 dan 7).
Tiga kelompok merpati disuntik dengan dexamethasone (2 mg/kg secara intramuskular setiap
48 jam) sebelum diinokulasi. (Kelompok 6, 7 dan 8). Satu kelompok merpati (n = 7) hanya
menerima tiga suntikan dexamethasone (Grup Kontrol 3).
Elang, Isolasi kultur selama 5 hari pada suhu 37°C pada SAB.
Konidia dicuci tiga kali dengan 5 ml 0,01% Tween 20 HBSS. (sentrifugasi: 3200 × g selama 10
menit pada 4°C) sebelum suspensi disesuaikan dengan 107, 106, 105, 104, 103, dan 102
conidia/0.5 ml HBSS menggunakan haemocytometer count. Jumlah pengenceran konidia 10
kali lipat dikultur pada SAB dalam 0,01% Tween 20 HBSS pada 37°C dan jumlah CFU per ½
mililiter dihitung setelah 24 jam inkubasi. Suspensi konidia akhir memiliki viable count 1,20 ×
107, 0,78 × 106, 0,88 × 105, 0,66 × 104, 0,80 × 103, dan 1,50 × 102 CFU/0,5 ml.
Kalkun, Setiap unggas yang terinfeksi (n = 15) dianalisasi dengan injeksi intramuskular
15 μl ketamin dan 10 μl diazepam (5 mg/kg), 15 μl imalgene 1000 mg/10 ml + 10 μl valium, 5
mg/ml. Unggas diinokulasi dengan injeksi transkutan ke kantung udara toraks kaudal kanan.
Diinokulasi dengan suspensi spora 100 μl dari kultur A. fumigatus berusia 3 hari yang
mengandung 107 spora Unggas control (n = 10) dianalisasi dan diberi larutan garam steril 20
ml. 3 unggas dipilih secara acak dari kelompok yang terinfeksi dan dua dari kelompok kontrol
tewas pada hari ke-1, 2, 3, 5 dan 7 pasca inokulasi.

4. Gejala klinis apa saja yang muncul.

a. Pada merpati diamati gejala klinis yang muncul yaitu kerusakan bulu, dispnea, bersin
dan stridor.
b. Pada kalkun teramati kejadian gangguan pernapasan dan diare saat penelitian
berlangsung.
c. Pada elang teramati kerusakan bulu, muntah, dispnea, stridor, dan paruh terbuka.

5. Setelah dilakukan nekropsi, perubahan patologis apa saja yang teramati dan
bagaimana prosedur nekropsi serta bagaimana prosedur dalam pengambilan sampel
organ yang akan digunakan baik untuk pemeriksaan patologis ataupun untuk
pemeriksaan mikrobiologis.

Nekropsi menunjukkan lesi sugestif aspergillosis di semua A. fumigatus-kelompok

merpati yang diinokulasi. Merpati imunokompeten inoculated intratracheally tidak menunjukkan
lesi makroskopik. Pada percobaan kedua, tidak ada lesi yang diamati dalam kelompok kontrol
dengan pengecualian dua dari tujuh merpati di Grup 3. Lesi yang terlihat pada kantung udara
termasuk adanya fokus granulomatosa. Lesi paru-paru termasuk adanya fokus granulomatosa
dan hemoragik. Lesi pada pericard termasuk keberadaan fokus granulomatosa dan kandungan
cairan kuning. Lesi hati disertakan fokus granulomatosa. Aspek ginjal pucat, fokus
granulomatosa besar di otak dan adanya aspek pucat dan granulomatosa fokus pada otot dada.
Pada elang terdapat lesi dikantung udara, paru-paru bahkan seluruh saluran
pernapasan, limpa, ginjal , granuloma jamur dengan miselium aktif di paru-paru, lesi
granulomatosa di trakea dan syrinx, splenitis parah, perikardium buram, splenomegali dan
hiperplasia folikel, lesi purulen mengandung granulosit heterofil.
Kalkun hari ke-1 pi, membran kantung udara menebal oleh edema dan ditutupi oleh
eksudat (terdapat konidia berkecambah dan berhifa). Dari hari 2-3 pi, membran kantung udara
menjadi lebih parah terdapat granuloma 5 hari pi, terjadi peradangan yang parah pd kantong
udara, multifokal, heterofilik dan granulomatosa dan 7 hari pi, terjadi penurunan keparahan
pneumonia difus.

6. Untuk keperluan pemeriksaan secara mikrobiologis organ apa saja yang akan diambil

Organ yang diambil untuk pemeriksaan mikrobiologis yaitu sampel dari trakea, syrinx,
paru-paru, kranial dan kantung udara toraks ekor, kantung udara perut, perikardium, jantung
darah, hati, limpa, ginjal, bursa kloaka, hidung, otak, dan lesi jamur.

7. Pemeriksaan langsung secara mikroskopis (prosedur, gambaran yang seharusnya

dapat diamati)

Untuk pemeriksaan langsung secara mikroskopis dilakukan dengan mengambil sampel

dari organ paru-paru, hati, otak yang kemudian ditumbuhkan di dalam Sabourand dextrose
agar (SDA), sedangkan untuk sampel kantong udara diambil menggunakan lidi kapas atau
cotton swab yang steril. Cawan yang berisi biakan diingkubasi selama 4 hari dengan suhu 37℃,
setelah muculnya koloni dapat dilakukan identifikasi morfologi dari koloni beserta konidiofor dan
konidianya. Semua sediaan organ dan juga jaringan akan di fiksasi menggunakan formaldehid
10%. Spesimen yang menempel pada lilin paraffin dipotong 4 mm dan diwarnai dengan
haematoxylin eosin safran, methenamine silver, dan asam Schiff. Pewarnaan imunohistokimia
dilakukan dengan Ventana NexES pada 4 mm bagian menggunakan metode kompleks avidin
biotin peroksodase dengan diaminobenzidine sebagai substrat dan haematoxylin sebagai
counterstaining. Pewarnaan imunohistokimia dilakukan dengan Ventana NexES pada 4 mm
bagian menggunakan metode kompleks avidin biotin peroksodase dengan diaminobenzidine
sebagai substrat dan haematoxylin sebagai counterstaining. Untuk konidia Aspergillus
fumigatus didapatkan dengan inkubasi menggunakan antibody spesifik poliklonal dari kelinci.
8. Kultur : media apa saja yang bisa digunakan, bagaimana cara membiakan, berapa lama
waktu dan suhu yang digunakan untuk inkubasi, serta gambaran koloni kapang yang
akan tumbuh.

Pada kasus temuan klinis kalkun dianalisis mikologi serta histologis. Penggunaan agar
Sabourand dextrose dengan 0,5% kloramfenikol dalam cawan petri untuk pengaplikasian organ
paru paru dan hati. Pengambian sampel kantung udara thorax dilakukan menggunakan kapas
lidi yang sudah steril. Pelat yang berisi sampel diingkubasi selama 4 hari dengan suhu 37℃.
Identifikasi spesies dilakukan ketika koloni kapang sudah berkembang yang nantinya akan
dilakukan pemeriksaan mikroskopis konidiofora dan konidia dan tentunya pengamatan
morfologi koloni yang tumbuh. Semua sediaan organ dan juga jaringan akan di fiksasi
menggunakan formaldehid 10%.

Kasus aspergillus pada elang sampel di dapatkan dari granuloma elang yang mati akibat
aspergillosis. Kemudian sampel yang didapatkan diisolat dan kemudian dikultur selama 5 hari
pada suhu 37℃ pada Sabouraud dextrose agar (SDA)

9. Pemeriksaan mikroskopis : ada berapa metode yang bisa digunakan.

Analisis imunohistokimia, mikologi dan histologis.

Imunohistokimia: Pewarnaan imuno-histokimia dilakukan dengan imunostainer otomatis

Ventana NexES pada 4sayam bagian menggunakan metode kompleks avidin biotin
peroksidase dengan diaminobenzidine sebagai substrat dan hematoxylin sebagai
counterstaining (Ventana iView DAB detection kit). Setelah deparafinisasi, membuka kedok
antigen dengan panas (microwave 750 W, 10 menit) dan penghambatan aktivitas peroksidase
endogen (oleh buffer spesifik yang disertakan dalam kit deteksi Ventana iView DAB), beberapa
bagian diinkubasi dengan antibodi poliklonal kelinci yang spesifik untukA. fumigatus.

Mikologi: Pengambilan sampel kantung udara toraks dilakukan dengan kapas lidi steril. Pelat
diinkubasi selama 4 hari pada suhu 378C. Saat koloni jamur berkembang, identifikasi spesies
dilakukan dengan pemeriksaan mikroskopis konidiofor dan konidia. A. fumigatus dicirikan
dengan konidia hijau yang echinulate dengan diameter 2-3 µm, berasal dari phialides kehijauan
yang berukuran 6-8 µm dan 2-3 µm

Histologis: Semua organ dan jaringan selanjutnya difiksasi dalam formaldehida 10%. Spesimen
tertanam lilin parafin dipotong pada 4sayam dan diwarnai dengan hematoxylin eosin safran
(HES), pewarnaan methenamine silver (MS) dan asam periodik Schiff.

10. Kesimpulan

Penelitian terhadap Aspergillus fumigatus dapat dilakukan pada hewan coba burung
merpati, elang, dan kalkun yang diinokulasi lewat trakea atau kantung udara. Sampel dapat
diambil dari beberapa organ hewan coba tersebut, seperti trakea, paru-paru, jantung, hati,
limpa, proventriculus, ventriculus, usus, ginjal, koaka, bursa, otot pectoral, otak, dan kantung
udara. Identifikasi A. fumigatus dapat dilakukan melalui pemeriksaan histologi dan mikologi di
bawah mikroskop, pembiakan kultur, perubahan patologi anatomi, serta pengamatan terhadap
gejala klinis.