KLONING GEN Rv 1980c PENGKODE PROTEIN MPT 64 KE VEKTOR EKSPRESI

pQE 30 Xa Mycobacterium tuberculosis SEBAGAI ANTIGEN UNTUK

IMMUNODIAGNOSTIK TUBERKULOSIS LATEN

Besse Nafisah1, Rosana Agus2, Muh. Nasrum Massi3, Fahruddin2

1. Mahasiswa Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Hasanuddin, Makassar, 90245
2. Dosen Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Hasanuddin, Makassar, 90245
3. Dosen Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin, Makassar, 90245

email : nafisahbesse@gmail.com

ABSTRAK
Gen Rv 1980c merupakan gen yang mengkodekan protein Mycobacterium Protein
Tuberculosis (MPT 64). MPT 64 adalah protein yang disekresi oleh Mycobacterium
tuberculosis. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan klon rekombinan gen Rv 1980c
pengkode protein MPT 64 yang menjadi dasar untuk immunodiagnostik TB laten. Prosedur
untuk melakukan kloning tersebut adalah merestriksi gen Rv 1980c dan vektor ekspresi pQE
30 Xa, dilanjutkan dengan meligasi gen Rv 1980c ke vektor ekspresi pQE 30 Xa, dan
selanjutnya mentransformasi ke sel host Escherichia coli BL21. Karakterisasi klon
rekombinan dilakukan dengan PCR koloni dan isolasi plasmid rekombinan (pQE 30 Xa – Rv
1980c). Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen Rv 1980c telah berhasil diligasi ke vektor
ekspresi pQE 30 Xa. Hal ini ditunjukkan pada hasil seleksi koloni biru putih pada sel host
Escherichia coli BL21 dan setelah karakterisasi klon rekombinan diketahui bahwa gen
sisipannya adalah benar gen Rv 1980c berukuran 671 bp dan klon rekombinan (pQE 30 Xa –
Rv 1980c).

Kata Kunci : Gen Rv1980c, MPT 64, Kloning, Vektor pQE 30 Xa, E. coli BL21

ABSTRACT
Gene Rv 1980c is a gene which coding the protein of Mycobacterium Protein Tuberculosis
(MPT 64). MPT 64 is a protein that secreted by Mycobacterium tuberculosis. The aim of this
study is to achieve recombinant clone of Rv 1980c protein coder of MPT 64 which become
the basic for delitescent of TB immunodiagnostic. Procedure to do the cloning by restricting
gene Rv 1980c and expression vector of pQE 30 Xa and inserted into expression vector pQE
30 Xa, after was transformed into Escherichia coli BL21 cell. Characterisation of clone
recombinant made with PCR colony and recombinant of plasmid isolation (pQE 30 Xa – Rv
1980c). These result verified the successful cloning of the MPT 64 gene via the expression
vector pQE 30 Xa. These thing shown toward the evaluation result of white blue colony in the
cell of Escherichia coli BL21 and after characterisation of recombinant clone shows that
inserted gene is true that gen Rv 1980c with lengths of 671 bp and recombinant clone (pQE
30 Xa-Rv 1980c)

Keywords : Gen Rv1980c, MPT 64, Cloning, Vector pQE 30 Xa, E. coli BL21

PENDAHULUAN
 Tuberkulosis (TB) merupakan salah
satu indikator dalam menentukan derajat
kesehatan masyarakat, tuberkulosis sudah
menjadi masalah utama kesehatan global
sebagai penyebab utama kematian pada
jutaan orang setiap tahun diseluruh dunia
setelah Human Immunodeviciency Virus
(HIV), diperkirakan sekitar sepertiga
penduduk dunia telah terinfeksi
Mycobacterium tuberculosis yaitu bakteri
penyebab tuberkulosis (Saraswati et al.,
2016).
Berdasarkan laporan WHO dalam
Global Tuberculosis Report (2015), angka
kejadian TB di dunia diperkirakan
mencapai 10,4 juta penderita kasus TB
dimana 5,9 juta terjadi pada pria, 3,5 juta
terjadi pada wanita dan 1 juta terjadi di
antara anak-anak. Data Kementerian
Kesehatan Repubik Indonesia (2016)
menunjukkan pada tahun 2015 jumlah
kasus tuberkulosis sebanyak 330.910
kasus, meningkat bila dibandingkan semua
kasus tuberkulosis yang ditemukan pada
tahun 2014 yaitu sebesar 324.539 kasus.
Berdasarkan data Dinas Kesehatan
Provinsi Sulawesi Selatan (2015), Angka
Case Notification Rate (CNR) yang
dihitung berdasarkan jumlah seluruh kasus
TB yang ditemukan dan diobati
menunjukkan peningkatan pada tahun
2015 yaitu 154/100.000 penduduk
dibandingkan tahun 2014 yaitu
152/100.000 penduduk.
Diagnosis tuberkulosis berbasis
reaksi imunologis yang pertama kali
dikembangkan adalah Tes Kulit Tuberkulin
atau Tuberculosis Skin Test (TST). Metode
ini di dasarkan respon imun seluler
terhadap antigen Purified Protein derivatif
(PPD). Tes kulit tuberkulin mempunyai
beberapa keterbatasan yaitu dapat terjadi
reaksi positif palsu karena adanya reaksi
silang antara PPD dan antibodi yang
dihasilkan oleh vaksinasi BCG atau
infeksi dengan mikobakteria bukan TB
(Diel et al., 2009). Mengantisipasi reaksi
silang antigen PPD maka berbagai bahan
pemeriksaan untuk mendeteksi antigen
tuberkulosis telah dikembangkan melalui
temuan antigen spesifik yang berasal dari
protein yang disekresi oleh M. tuberculosis
yang reaktif terhadap serum penderita
tuberkulosis laten, dilakukan untuk
menangani penderita TB yang semakin
meningkat. Salah satu antigen protein
tersebut adalah Mycobacterium Protein
Tuberculosis 64 (MPT 64). Dihipotesiskan
bahwa protein MPT 64 disekresikan oleh
M. tuberculosis adalah protein yang
pertama kali berinteraksi dengan sistem
kekebalan tubuh, karena itu protein MPT
64 akan mengaktifkan respon sistem
kekebalan tubuh pada individu yang
terinfeksi M.tuberculosis, protein MPT 64
ini akan dikenali oleh sel Th1 manusia.
Oleh karena itu MPT 64 dijadikan sebagai
vaksin kandidat baru untuk diagnostik TB
spesifik.
Berdasarkan hal tersebut perlu
dilakukan produksi antigen MPT 64
dengan teknologi DNA rekombinan.
Produksi antigen tersebut dapat dilakukan
dengan terlebih dahulu melakukan kloning
gen penyandi protein MPT 64 ke vektor
ekspresi pQE 30 Xa. Dihasilkannya protein
MPT 64 tersebut dapat digunakan untuk
diaplikasikan bagi kesehatan manusia yaitu
memberikan proteksi terhadap penderita
TB laten pada usia produktif, yang pada
akhirnya diharapkan dapat mengurangi
angka morbiditas dan mortalitas yang
disebabkan oleh tuberkulosis.
METODE PENELITIAN
Alat
Alat yang digunakan yaitu Lamina
Air Flow (ESCO), PCR (SOE-PLAST),
elektroforesis (BIO-RAD), Gel-Doc (BIO-
RAD), sentrifuse (Profuge), vortex
(Heidolph), autoclave (Hirayama),
microwave (Electrolux), dry bath
(Memmert), water bath (Memmert),
inkubator (Memmert), incubator shaker
(Heidolph), mikropipet (BIO-RAD),
cawan petridish, mikrotube (Axygen),
mikrosentrifuge, tabung 1,5 ml dan 0,5 ml
(Axygen), tabung falcon, tabung spin
kolom, tabung eppendorf, botol reagen,
Bahan
Bahan yang digunakan adalah klon
rekombinan (pGEM-T – Rv 1980c),
plasmid pQE-30 Xa, nuclease free water,
Escherichia coli strain BL21, medium
Luria Bertani (LB), buffer PB [Qiagen],
buffer PE [Qiagen], buffer EB [Qiagen],
buffer NE [Qiagen], T4 DNA ligase
[Invitrogen], Buffer 10X T4 DNA ligase,
2X tango buffer, primer MPT F’, primer
MPT R’, enzim KAPA, enzim BamHI,
enzim HindIII, aquadest, loading dye 2X,
X-Gal, IPTG, marker 100 bp. Bahan kimia
yang digunakan antara lain tryptone, yeast
extract, NaCl, bacto agar, ampisilin, 10 M
CaCl2, gel agarosa, TBE 0,5X, ETBR
(Etidium Bromide).
Prosedur Kerja
A. Kloning Gen Rv 1980c Pengkode
Protein MPT 64 ke Vektor pQE 30 Xa
1. Restriksi Gen Target Rv 1980c dan
Vektor pQE 30 Xa
Gen Rv 1980c yang telah disisipi
vektor kloning pGEM-T Easy didigesti
dengan metode restriksi. Komposisi
reaksi restriksi untuk memotong gen
target Rv 1980c yaitu nuclease free water
14 μl, 2X tango buffer 2 μl, sampel
(pGEM-T - Rv 1980c) 2 μl, enzim
BamHI 1 μl, enzim HindIII 1 μl.
Campuran tersebut dimasukkan ke dalam
tabung 1,5 ml, dihomogenisasi dan
diinkubasi di incubator shaker pada suhu
37oC selama 16 jam. Komposisi reaksi
restriksi untuk memotong plasmid pQE
30 Xa yaitu nuclease free water 14 μl, 2X
tango buffer 2 μl, plasmid pQE 30 Xa 2
μl, enzim BamHI 1 μl, enzim HindIII 1
μl. Campuran reaksi dihomogenisasi dan
diinkubasi pada suhu 37°C selama 16
jam. Produk restriksi di cek dengan
menggunakan elektroforesis gel agarosa
1,2%. Elektroforesis gel agarosa
dilakukan berdasarkan metode Sambrook
dkk. (1989). Produk restriksi di cek
dengan menggunakan elektroforesis gel
agarosa 1,2%. Sebanyak 1,2 g gel
agarosa dilarutkan dalam 60 ml TBE
0,5X, kemudian dipanaskan di dalam
microwave ±3 menit (sampai larut),
tambahkan EtBr (Ethidium Bromida) 2 μl
dan diamkan sejenak, selanjutnya dituang
ke dalam cetakan gel berisi sisir. Gel
agarosa yang telah memadat kemudian
dimasukkan ke dalam tangki
elekroforesis berisi TBE 0,5X.
Kertas parafilm disiapkan untuk
mencampurkan sampel dengan loading
dye. Sebanyak 5 μl Rv 1980c hasil
restriksi (sampel), 5 μl pGEM-T – Rv
1980c (tidak restriksi), 3 μl pQE restriksi
dan 3 μl pQE tidak restriksi, masing-
masing ditambahkan loading dye 2 μl
kemudian dimasukkan ke dalam sumur
gel, dan terakhir masukkan 3 μl marka
100 pb yang digunakan sebagai penanda.
Perangkat elektroforesis dihubungkan
dengan sumber arus listrik bertegangan
100 V selama ± 60 menit. Setelah 60
menit, gel kemudian diletakkan di dalam
perangkat dokumentasi hasil
elektroforesis (Gel Doc) untuk
visualisasi.
2. Ligasi Gen Rv 1980c ke Vektor
Ekspresi pQE 30 Xa
Proses ligasi dilakukan dengan
menggunakan T4 DNA Ligasi.
Komposisi reaksi ligasi terdiri dari hasil
restriksi Rv 1980c (sampel) 3 µl, pQE 30
Xa 1 µl, nuclease free water 13,8 µl,
buffer 10x T4 DNA Ligase 2 µl, dan T4
DNA Ligase 0,2 µl. Campuran
dimasukkan dalam tube 1500 μl. Proses
pencampuran dilakukan dalam Laminar
Air Flow. Setelah semua larutan berada
dalam kondisi homogen, kemudian
diinkubasi di dry bath sebagai proses
ligasi pada suhu 22oC selama 60 menit,
setelah itu diinkubasi dalam water bath
sebagai proses inaktiv pada suhu 70oC
selama 5 menit. Hasil reaksi ligasi
kemudian ditransformasikan ke dalam E.
coli BL21 yang kompeten.
3. Transformasi PlasmidRekombinan
ke Escherichia coli BL21
 Metode yang digunakan dalam
transformasi ini adalah heat shock
berdasarkan Sambrook et al., (1989).
Sebanyak 10 μl produk ligasi dimasukkan
ke dalam 50 μl sel kompeten E. coli
BL21, lalu diinkubasi di es selama 30
menit kemudian dilakukan proses kejut
panas (heat shock) dengan memindahkan
sampel ke dalam water bath dengan suhu
42°C selama 90 detik, kemudian
diinkubasi ke dalam es selama 30 menit.
Selanjutnya ditambahkan media LB cair
sebanyak 600 μl. Sampel diinkubasi
dengan menggunakan incubator shaker
pada suhu 37oC selama 3 jam dengan
kecepatan 150 rpm. Selanjutnya
disentrifugasi selama 1 menit dengan
kecepatan 14.000 rpm, kemudian
supernatan di buang dan pelet (sampel)
50 μl diinokulasikan ke dalam medium
Luria Bertani padat yang mengandung
ampisilin (2,5 mg/ml) dan yang tidak
mengandung ampisilin (sebagai kontrol),
40 μl X-Gal diinokulasikan juga dalam
medium Luria Bertani padat, kemudian
diinkubasi pada suhu 37°C selama 16
jam.
B. Karakterisasi Klon Rekombinan
(pQE 30 Xa – Rv 1980c) pada Koloni
Putih
1. PCR Koloni
Koloni biru yang tumbuh pada
medium Luria Bertani hanya merupakan
vektor pQE 30 Xa tanpa insert (Rv
1980c), sedangkan koloni putih yang
tumbuh pada medium Luria Bertani
(+ampisilin) merupakan klon rekombinan
(Rv 1980c - pQE 30 Xa). Klon
rekombinan (koloni putih) diisolasi ke
dalam aquades 20 μl, lalu di vortex
selama 10 detik dan ditambahkan ke
dalam reagen PCR. Komposisi reagen
PCR terdiri dari enzim KAPA 12,5 μl,
primer forward 0,5 μl, primer reseverse
0,5 μl, nuclease free water 6,5 μl dan
sampel 5 μl, kemudian dihomogenasi
dan di PCR. Reaksi PCR dilakukan
sebanyak 30 siklus selama 2 jam. Produk
yang sudah di PCR di cek dengan
menggunakan elektroforesis gel agarose
1,2%.
2. Isolasi Plasmid Rekombinan
Karakterisasi klon rekombinan
dilakukan dengan mengisolasi koloni
putih dengan Kit Qiagen. Transforman
yang membawa DNA rekombinan
diinokulasikan ke dalam 4 ml medium
Luria Bertani cair yang telah
ditambahkan ampisilin (50 mg/ml)
sebanyak 4 μl. Kultur diinkubasi pada
shaker inkubator dengan kecepatan 200
rpm pada suhu 37°C selama 16 jam.
Kultur kemudian dipindahkan ke dalam
tabung mikrosentrifus dan disentrifugasi
dengan kecepatan 14.000 rpm selama 2
menit. Supernatan dibuang dan pelet
dilarutkan dengan 250 μl buffer P1
kemudian dihomogenkan, lalu tambahkan
250 μl buffer P2, tabung dibolak-balik
sebanyak 4-6 kali, lalu tambahkan 350 μl
buffer N3 dan tabung dibolak-balik lagi
sebanyak 4-6 kali. Campuran
disentrifugasi dengan kecepatan 13.000
rpm selama 10 menit. Supernatan
dipindahkan ke tabung spin kolom,
kemudian disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit.
Selanjutnya, supernatan yang terbentuk
dibuang dan sebanyak 700 μl buffer
pencuci PE ditambahkan ke dalam spin
colom, kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit.
Cairan yang terbentuk dibuang, setelah
itu colom dipindahkan ke eppendorf steril
dan ditambahkan 30 μl buffer EB.
Selanjutnya didiamkan selama 3 menit,
kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit,
cairan yang terbentuk dibuang sampai
didapatkan DNA pekat. Produk yang
sudah di isolasi plasmid di cek dengan
menggunakan elektroforesis gel agarose
1,2%
Analisis Data
Data yang diperoleh berupa data
kualitatif sehingga analisis data dilakukan
 secara deskriptif berdasarkan hasil
elektroforesis dari proses restriksi,
transformasi plasmid rekombinan, dan
karakterisasi plasmid rekombinan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Restriksi Gen Rv 1980c dan Vektor
Ekspresi pQE 30 Xa
Hasil restriksi di cek menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1,2% untuk
memastikan pita gen Rv 1980c berhasil
terpotong dari vektor pGEM-T dan juga
memastikan vektor pQE 30 Xa berhasil
terpotong.
3.015 bp 3.509 bpbp 30 Xa – Rv 1980c).
671 bp
3.461 bpbp
Gambar 1. Hasil restriksi gen Rv 1980c
dan vektor pQE 30 Xa
Visualisasi hasil elektroforesis
(Gambar 1) menunjukkan dua pita gen
yaitu gen vektor pGEM-T berukuran 3015
bp dan gen sisipan Rv 1980c berukuran
671 bp (lajur 1 dan lajur 3), sedangkan pita
gen klon rekombinan (pGEM-T – Rv
1980c) tidak terpotong berukuran 3.686 bp
(lajur 2). Setelah itu dilakukan pengecekan
pada data gen Bank didapatkan ukuran gen
Rv 1980c yaitu sebesar 671 bp. Hal ini
sesuai dengan penelitian yang dilakukan
oleh Fu, et al., (2009) bahwa gen Rv 1980c
memiliki ukuran 671 bp.
2. Ligasi Gen Rv 1980c ke Vektor
Ekspresi pQE 30 Xa
Fragmen gen Rv 1980c yang telah
direstriksi selanjutnya diligasikan ke
vektor pQE 30 Xa. Ujung-ujung sisipan
gen Rv 1980c hasil pemotongan BamHI-
HindIII berlekatan dengan ujung-ujung
vektor pQE 30 Xa yang berkomplemen
menghasilkan plasmid rekombinan (pQE
Reaksi ligasi yang dilakukan pada
penelitian ini menggunakan rasio vektor
dan sisipan (1 : 3). Menurut Cranenburgh
(2004), rasio molar sisipan dan vektor
penting dalam reaksi ligasi untuk
mengoptimalkan pembentukan plasmid
rekombinan dan meminimalisir
pembentukan fragmen-fragmen gen yang
tidak diharapkan. Suhu optimum untuk
aktivitas gen ligasi yaitu berada pada suhu
30oC. Reaksi ligasi kedua fragmen DNA
tersebut dikatalisis menggunakan T4 DNA
ligase. Menurut Cranenburgh (2004), T4
DNA ligase mengkatalisis reaksi
pengikatan ujung-ujung molekul DNA
yang saling berkomplemen. Penambahan
enzim T4 DNA ligase ini mampu
membentuk kompleks enzim AMP yang
selanjutnya terikat pada nick (daerah
putus). Hasil dari ligasi kemudian
ditransformasi ke dalam sel kompeten E.coli
BL21.
3. Transformasi Plasmid Rekombinan
ke Sel Kompeten Escherichia coli
BL21
Hasil ligasi ditransformasi ke
dalam sel kompeten Escherichia coli BL21
untuk memperbanyak DNA plasmid
rekombinan (pQE 30 Xa – Rv 1980c).
Transformasi dilakukan menggunakan
 metode heat shock yaitu dengan pemberian
kejut panas pada suhu 42⁰C selama 50
detik. Prinsip dari proses heat shock
tersebut adalah terjadi lonjakan suhu dari
0⁰C ke 42⁰C terhadap sel yang telah diberi
perlakuan CaCl2. Perlakuan CaCl2 ini
dilakukan saat pembuatan sel kompeten.
Menurut Zhiming Tu, et al, (2005), sel
kompeten yang dipreparasi dengan metode
CaCl2 memiliki kualitas yang cukup baik,
sehingga dapat digunakan untuk
mentransformasi hasil reaksi ligasi.
Sel transforman yang telah
diberikan kejutan panas dikultur pada
medium Luria Bertani (LB) selama 3 jam.
Setelah itu sel transforman disebar pada
medium LB padat yang sudah ditambahkan
antibiotik ampisilin, isopropyl β-D-1-
thiogalactopyranoside (IPTG), dan X-Gal,
kemudian diinkubasi pada suhu 37⁰C
selama 16 jam.
1 galaktosidase yang berfungsi memecah
2
Gambar 2. Hasil transformasi gen Rv
1980c - pQE 30 Xa ke E. coli BL21
(Keterangan:1: Koloni putih (pQE 30 Xa-
Rv 1980c), 2: Koloni biru (pQE 30 Xa))
Hasil transformasi ke Escherichia
coli BL21 menunjukkan terbentuknya
koloni bakteri berwarna putih dan biru
pada cawan petri yang berisi medium LB
padat, X-Gal, IPTG dan ampisilin (Gambar
2). Koloni putih menandakan bahwa DNA
sisipan Rv 1980c telah berhasil disisipkan
ke vektor pQE 30 Xa, sedang koloni biru
berarti DNA sisipan Rv 1980c tidak
berhasil diligasikan ke vektor pQE 30 Xa.
Penambahan ampisilin pada
medium LB padat berfungsi sebagai media
seleksi pertama, karena bakteri yang akan
tumbuh adalah bakteri yang memiliki gen
resistensi ampisilin, yaitu E. coli yang
mengandung pQE 30 Xa. Vektor pQE 30
Xa memiliki marka seleksi berupa gen
resistensi ampisilin. Gen pembawa sifat
resistensi terhadap ampisilin ini mengkode
enzim β-laktamase. Enzim β-laktamase
akan mendegradasi ampisilin sehingga
ketika sel pembawa plasmid rekombinan
ditumbuhkan dalam media yang
mengandung ampisilin, maka sel tersebut
akan tumbuh dalam media seleksi LB,
sementara sel yang tidak membawa
plasmid rekombinan akan mati.
Penambahan IPTG yang kemudian
dimasukkan ke dalam media LB
dimaksudkan sebagai induser transkripsi
pada gen operon lac yaitu lacZ. Gen lacZ
akan mengkode suatu enzim β-
laktosa menjadi glukosa dan galaktosa.
Kehadiran enzim β-galaktosidase ini akan
menghidrolisis substrat X-gal (5-bromo-
4chloro-3-indolyl-β-D-galactactoside)
yang ditambahkan pada media seleksi
menjadi galaktosa dan senyawa turunannya
5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna
biru (Madigan and Martinko, 2005).
Koloni biru yang terbentuk pada media
seleksi LB adalah koloni yang tidak
memiliki fragmen gen sisipan sehingga
enzim β-galaktosidase dapat mendegradasi
substrat galaktosa yang tersedia.
Sebaliknya, koloni E. coli yang
berwarna putih menunjukkan DNA
pengkode Rv 1980c telah diligasi pada
daerah MCS (multi cloning site) yang
terdapat pada gen lacZ pQE 30 Xa. Ketika
terdapat fragmen gen sisipan Rv 1980c
pada vektor pQE 30 Xa maka sintesis α-
peptida yang berperan sebagai aktivator
terhadap kerja enzim β-galaktosidase akan
terhambat, karena gen sisipan Rv 1980c
terletak di antara gen lacZ menyebabkan
fragmen gen sisipan Rv 1980c akan
menginaktifkan ekspresi dari gen lacZ
sehingga enzim β-galaktosidase tidak dapat
mendegradasi substrat galaktosa yang
tersedia, maka yang tampak pada media
seleksi LB adalah koloni berwarna putih.
Hasil transformasi yang didapatkan
menunjukkan keberhasilan proses
transformasi vektor ke dalam sel host
E.coli BL21, kemudian di karakterisasi
dengan PCR koloni dan isolasi plasmid
rekombinan.
4. Karakterisasi Plasmid Rekombinan
pQE 30 Xa – Rv 1980c
4.1 PCR Koloni
Enam koloni sel transforman
diambil untuk diamplifikasi dengan teknik
PCR koloni dan dikonfirmasi dengan
elektroforesis gel agarosa 1,2% (b/v).
Gambar 3. Hasil Elektroforesis dari PCR
Koloni (Keterangan: M : Marker dengan
ukuran 100 bp, lajur 1-6 : lajur koloni yang
digunakan sebagai cetakan)
Hasil PCR koloni menunjukkan
sampel (Gambar 3 lajur 1, 2, 3, 5, dan lajur
6) membawa fragmen gen Rv 1980c
berukuran 671 bp, Hal ini sesuai dengan
penelitian yang dilakukan oleh Fu, et al,
(2009) bahwa gen Rv 1980c memiliki
ukuran 671 bp. Adapun lajur 4 tidak
terlihat pita DNA berukuran 671 bp yang
berarti tidak terdapat pita gen Rv 1980c di
dalam sampel, hal ini dapat disebabkan
karena koloni yang terambil merupakan
koloni yang mengalami kegagalan proses
ligasi atau dapat pula merupakan koloni
bakteri kontaminan yang tidak diinginkan.
Perbedaan tebal dan tipisnya pita DNA
yang terlihat pada geldoc hasil
elektroforesis menunjukkan banyak dan
sedikitnya pita DNA sisipan. Lajur 2, 5 dan
6 memperlihatkan pita DNA yang tebal
dibanding lajur lainnya, hal ini berarti
terdapat banyak DNA sisipan Rv 1980c di
dalam lajur 2, 5 dan 6 yang terambil dari
koloni putih yang telah diisolasi yang
kemudian diperbanyak lagi dengan PCR.
Pada lajur 1 dan 3, pita DNA yang
terbentuk nampak tipis dibanding lajur
lainnya, hal ini disebabkan karena
konstentrasi DNA sampel pada lajur ini
jumlahnya lebih sedikit dibandingkan 3
sampel pada lajur lainnya, sehingga
visualisasi pita DNA yang terbentuk pada
gel agarosa juga tidak nampak jelas.
Koloni positif selanjutnya dikultur pada
media LB yang ditambah ampisilin.
4.2 Isolasi Plasmid Rekombinan
Kebenaran plasmid rekombinan pada
koloni putih dikarakterisasi setelah plasmid
berhasil diisolasi. Hasil Isolasi dan Analisis
DNA Plasmid rekombinan dilakukan
dengan menggunakan prosedur dari
manual kit miniprep Qiagen. Dalam kit
tersebut terdapat sejumlah komponen
larutan yang ditambahkan secara berurutan
yakni buffer P1, P2, N3. Tujuan
dilakukannya isolasi plasmid yaitu untuk
mendapatkan plasmid rekombinan yang
murni. Isolasi DNA ini dilakukan dengan
serangkaian proses sentrifugasi yang
berulang seiring dengan penambahan
reagen-reagen tertentu. Hasil isolasi
plasmid dianalisis dengan menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1,2 %.
 KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian
4.132 bp menunjukkan bahwa gen Rv 1980c
pengkode protein MPT 64 berukuran 671
bp telah berhasil diinsersikan ke vektor
ekspresi pQE 30 Xa sehingga diperoleh
klon rekombinan (pQE 30 Xa – Rv 1980c)
Mycobacterium tuberculosis.

DAFTAR PUSTAKA
Cranenburgh, R. M. 2004. An Equation
Gambar 4. Hasil
for Calculating the Volumetric
isolasi plasmid rekombinan (pQE 30 Xa –
Ratios Required in a Ligation
Rv 1980c)
Reaction. Applied Genetics and
(Keterangan : M : Marker 100 bp; Lajur 1 :
Molecular Biotechnology 65: 200-202.
plasmid rekombinan)
Diel, R., Robert, L. K., Karen, M. W.,
Hasil elektroforesis menunjukkan
Rene, G., and Albert, N. 2009.
terbentuknya plasmid berukuran sekitar
Comparative Performance of
4.132 bp (Gambar 4). Plasmid ini
Tuberculin Skin Test,
merupakan plasmid pQE 30 Xa berukuran
QuantiFERON-TB-Gold In Tube
3.509 bp yang telah mengandung fragmen
Assay, and T-Spot. American
gen Rv 1980c berukuran 671 bp
College of Chest Physicians. Chest
menjadikan plasmid rekombinan Skema
135:1010-1018.
hasil ligasi yang menyebabkan terjadinya
Dinas Kesehatan Makassar. 2014. Profil
penambahan ukuran plasmid menjadi
Kesehatan Kota Makassar 2013.
plasmid rekombinan berukuran 4.132 bp
Pemerintah Kota Makassar. Makassar.
(Gambar 5).
Fu, R., Chun, W., Chunwei, S., Mengji, L.,
Zhengming, F., Jia, L., Fang, W., and
Xionglin, F. 2009. An Improved
Whole-Blood Gamma Interferon
Assay Based on the CFP21-MPT64
4.132 bp
Fusion Protein. Journals Clinical
And Vaccine Immunology. Vol. 16 (5):
686-691.
Kementerian Kesehatan Republik
Indonesia. 2016. Data dan Informasi
Gambar 5. Peta Marka QE 30 Xa – Rv 1980c Tahun 2015 (Profil Kesehatan
Indonesia). Kementerian Kesehatan
Republik Indonesia. Jakarta.
Keberhasilan kloning gen Rv1980c
Sambrook, J., dan D. W. Russell. 2001.
yang menyandikan MPT 64 sebagai
Molecular Cloning: A Laboratory
antigen yang spesifik pada Mycobacterium
Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor
tuberculosis memberikan peluang untuk
Laboratory Press. New York.
melakukan serangkaian pengujian lebih
Saraswati, R., Nur, H., Basirun, A. U.
lanjut dalam imunodiagnostik, selain itu
2016. Konsep Diri Penderita TB
dapat pula dilakukan rekombinasi antigen
Paru Di RS PKU Muhammadiyah
(protein) spesifik untuk meningkatkan
Gombong. Jurnal Ilmiah Kesehatan
spesifitas uji imunodiagnostik terhadap
Keperawatan. Vol. 12 (2): 91-101.
penderita tuberkulosis laten.
WHO. 2015. Global Tuberculosis Report.
World Health Organization.
Zhiming Tu, Guangyuan, H., Kexiu, X. L,
Mingji, J. C., Junii, C., Ling, C., Qing,
Y., Dongping, P. L., Huan, Y., Jiantao,
S., & Xuqian, W. 2005. An Improved
System for Competent Cell
Preparation and High Effeciency
Plasmid Transformation Using
Different Escherichia coli strains.
Electronic Journal of Biotechnology
Vol. 8 (1): 113-120.