Titah Rigel Anjalani

6005211008

METODE
Arf6-mediated macropinocytosis-enhanced suicide gene therapy of C16TAB-condensed
Tat/ pDNA nanoparticles in ovarian cancer
1. Persiapan Kultur sel, plasmid, peptid, antibodi, dan bahan kimia

- Sel Skov3 dan 293T diperoleh dari Type Culture Collection of the Chinese Academy of
Sciences (China) dan dikultur dalam media 1640 dan DMEM, masing-masing. Kedua
jenis media tersebut digunakan sebagai dua jenis kondisi kultur yang berbeda dan
menunjukkan karakteristik yang berbeda. Media DMEM mengandung konsentrasi
kalsium yang lebih tinggi (1,8 mM) dan konsentrasi fosfat yang lebih rendah (1 mM)
daripada RPMI 1640, media yang kurang kaya nutrisi yang mengandung 0,8 mM kalsium
dan 5 mM fosfat. Selain itu, DMEM (glukosa rendah) memiliki konsentrasi glukosa yang
lebih rendah (1 g/L) dibandingkan RPMI 1640 (2 g/L). Telah dikonfirmasi bahwa
komponen media yang diterapkan dapat mempengaruhi proliferasi sel dan viabilitas sel
(Wu, et al., 2009).
- Plasmid fusi ganda (DF) lentiviral, membawa promotor ubiquitin yang menggerakkan
luciferase kunang-kunang dan gen reporter protein fluoresensi hijau yang ditingkatkan
(Fluc-eGFP), dan plasmid fusi tiga (TF), membawa protein fluoresensi merah monomer,
dan Renilla luciferase dan virus herpes simpleks gen reporter timidin kinase terpotong
(RFP-Rluc-HSV-ttk) masing-masing digunakan untuk visualisasi gen yang ditargetkan
dan untuk terapi gen. Penyisipan gen herpes simplex virus-thymidine kinase atau HSV-ttk
(gen bunuh diri klasik) untuk melawan tumor.
- Plasmid reporter pGL3 luciferase 25 (untuk memantau efisiensi transfeksi in vitro)
diperoleh dari Promega. Plasmid Arf6(wt)-, Arf6 (Q67L) dan Arf6(T27N)-HA/pcDNA3
awalnya diproduksi di lab kami. Plasmid EEA1- dan Rabaptin-5/pGEX-4T-3 dipasok
oleh Prof. Byung- Ha Oh (Institut Sains dan Teknologi Tingkat Lanjut Korea).27 The
pGEX-MICAL-L2-C(833–1008), pEGFP-Rab10(Q68L), Rab8 (Q67L), Rab8(T22N),
Rab10(T23N) dan pGEX -FIP3-RBD11 (649–756) plasmid dipasok oleh Prof. Minsheng
Zhu (Universitas Nanjing). PEGFP-Rab5(Q79L), Rab5(S34N), dan Plasmid
Rab22(Q64L) dipasok oleh Prof. Chunman Li ( Universitas Shenzhen). plasmid pEGFP-
Rab22(S19N), mCherry-Rab11(Q70L) dan Rab11(S25N) dipasok oleh Prof. Wen Chang
(Academia Sinica dan Universitas Nasional Taiwan). Peptida turunan HIV-Tat
(GRKKRRQRRRPPQC -amida) diperoleh dari GL Biochem Ltd. Kelinci anti-Rab5 Ab
(D160063) dan anti-Rab22 Ab (D160036) diperoleh dari Santa Cruz. Kelinci anti-RAB10
Ab (A4459) diperoleh dari Abclonal. Kelinci anti-Rab11A Ab (DF6301) diperoleh dari
Affinity. Kelinci anti-Arf6 Ab (383520) dan anti-Rab8A Ab (R22542) diperoleh dari
Zenbio. Tikus anti-β-aktin Ab (D190606) diperoleh dari Sangon. Mouse anti-RFP Ab
(31101ES60) diperoleh dari Yeasen. Dextran-AF647 (D22914), Tfn-AF647 (T-23366),
CTxB-AF647 (C-34778) dan kit uji protein BCA (23225) diperoleh dari Thermo.
Coelenterazine H (40906ES03), D-Luciferin (40901ES02) dan kit apoptosis TUNEL
Titah Rigel Anjalani
6005211008

(40306ES) diperoleh dari Yeasen. DiYO-1 (17580) dan DiYO-3 (17581) diperoleh dari
AATbio. Klorpromazin hidroklorida (CPZ, 69-09-0) dan metil-b-siklodekstrin (MBCD,
128446-36-6) diperoleh dari J&K. Gansiklovir (GCV) diperoleh dari Roche. EIPA
hidroklorida (HY-101840A), paclitaxel (HY-B0015) dan NAV2729 (HY-112473)
diperoleh dari MCE. Kit uji luciferase (E1501) diperoleh dari Promega. Kit deteksi SP-
9000 SPlink (sistem deteksi HRP biotin-streptavidin) diperoleh dari ZSGB-BIO.
Hochest33342 (B2261), polybrene (H9268), puromycin (P7255), blasticidin (R21001),
C16TAB (H5882) dan bahan kimia lainnya diperoleh dari Thermo Fisher.
2. Produksi dan Infeksi Lentivirus

- Untuk memantau sel yang ditransplantasikan secara in vivo, sel Skov3 diberi label
dengan gen reporter DF dengan transduksi lentiviral seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Secara singkat, sel 293T subkonfluen ditransfeksi dengan DF dan mengemas plasmid
oleh lipofectamine 2 K. Lipofectamine adalah reagen transfeksi umum, diproduksi dan
dijual oleh Invitrogen, digunakan dalam biologi molekuler dan seluler. Ini digunakan
untuk meningkatkan efisiensi transfeksi RNA (termasuk mRNA dan siRNA) atau DNA
plasmid ke dalam kultur sel in vitro dengan lipofeksi (Cardarelli, et al., 2016). 12 jam
pasca-transfeksi, media diubah menjadi media segar, dan 48 jam kemudian, supernatan
(mengandung lentivirus) dikumpulkan.
- Untuk infeksi, media yang mengandung lentivirus dan polibre (8 g ml−1) ditambahkan ke
sel Skov3 yang diunggulkan kemudian disentrifugasi pada 1600g per menit selama 1 jam.
Media transduksi diubah menjadi media lengkap untuk pertumbuhan sel. Sel-sel GFP-
positif diurutkan menggunakan FACS (BD Biosciences) tiga hari kemudian.
- Transduksi lentiviral yang efisien telah digunakan untuk memperkenalkan produk gen
untuk mengekspresikan gen tertentu secara berlebihan atau untuk mengurangi ekspresi
gen tertentu (Kennedy and Cribbs, 2016).
3. Overekspresi dan Knock Down yang Stabil pada Gen

- Sistem ekspresi gen pLV (plasmid lentiviral: pLV-EF1α-MCS-IRES-GFP-Bsd,

BiOSETTIA) digunakan untuk menghasilkan garis sel kanker ovarium dengan over-
ekspresi (OE) Arf6 yang stabil. Plasmid Arf6(wt)-, Arf6(Q67L)- dan Arf6(T27N)-HA/
pcDNA3 digunakan sebagai template untuk amplifikasi cDNA target menggunakan
primer (5′-AAGCGGATCCATGGGGAAGGTGCT- 3′, 5′-
TCCGGCTAGCTTAAGATTTGTAGTT-3′). Sistem pembungkaman gen pLV (plasmid
lentiviral: pLV-H1- EF1α-GFP-Puro, BiOSETTIA) digunakan untuk menghasilkan garis
sel kanker ovarium dengan knock-down (KD) stabil Arf6. shRNA penargetan Arf6
(AAAAGGAAGGTGCTATCCAAAATTTGGATCCAAATTTTGGATAGCACCTTCC)
dihasilkan.
- Tujuan dari Ekspresi/ekspresi berlebih (overexpression) melalui teknik rekayasa genetika
merupakan salah satu alat bioteknologi paling umum yang digunakan untuk memvalidasi
Titah Rigel Anjalani
6005211008

sekuens cisgenik dan transgenik yang menginduksi atau meningkatkan terekspresinya

gen pLV (Capriotti, et al., 2020). Sedangkn Knock Down (KD) adalah teknik di mana
ekspresi gen dikurangi. Pengurangan ini dapat dihasilkan dari modifikasi DNA atau dari
pengikatan oligonukleotida baik ke mRNA atau ke gen. Dalam hal ini perubahan ekspresi
bersifat sementara, jadi kita berbicara tentang knockdown sementara.

4. Persiapan Nnanopartikel T-P-C

- Nanopartikel Tat/pDNA/C16TAB (T–P–C) disiapkan seperti yang dijelaskan

sebelumnya. Secara singkat, pDNA (pGL3 atau TF plasmid) diberi label dengan DIYO-1
atau DIYO-3 (10–5 M, dalam PBS, inkubasi-vortex dalam gelap selama 5 jam) awalnya
pada molekul pewarna untuk pasangan basa DNA (pewarna/bp) rasio 1: 5 rasio.
Kompleks Tat/pDNA diformulasikan pada rasio muatan (muatan positif peptida terhadap
muatan negatif pDNA, N/P) sebesar 1, 5, 10 dan 20 melalui penambahan tetes demi tetes
peptida turunan Tat ke pDNA (30 menit pada 4 °C). Campuran divortex selama 20 menit
segera sebelum digunakan.
- Untuk menyiapkan nanopartikel Tat/pDNA/C16TAB, campuran Tat/pDNA berair dengan
rasio N/P yang diinginkan ditambahkan tetes demi tetes ke larutan C16TAB yang diaduk
perlahan (1 mM, dilarutkan dalam air deionisasi). Campuran yang dihasilkan kemudian
diseimbangkan pada suhu 4 °C selama 1 jam, dan kemudian dicuci dengan 250 mM PBS
pada pH 7,4. Phosphate buffered saline (PBS) adalah larutan buffer yang biasa digunakan
dalam penelitian biologi. Buffer membantu menjaga pH konstan. Umumnya pH 7,4
dipertahankan. Osmolaritas dan konsentrasi ion larutan biasanya sesuai dengan tubuh
manusia. Kompleks akhir disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 15 menit dan pelet yang
dihasilkan mengandung nanopartikel T-P-C.
5. Karakterisasi nanopartikale Tat/pDNA/C16TAB

- Morfologi nanopartikel T-P-C diamati melalui mikroskop elektron transmisi (Philips

Tecnai G2 20 S-TWIN). Nanopartikel T-P-C tersuspensi dijatuhkan ke kisi-kisi tembaga
yang dilapisi dengan film pendukung karbon, dan kemudian diinkubasi selama 2 menit.
Kelebihan cairan dibuang dan nanopartikel T-P-C diwarnai secara negatif dengan atau
tanpa 2% uranil asetat dihidrat selama 5 menit. Pewarnaan negative ini dilakukan karena
permukaan sebagian besar sel bakteri bermuatan negatif, permukaan sel menolak noda.
Kaca obyek akan ternoda, tetapi sel bakteri tidak. Bakteri akan muncul sebagai bintik-
bintik bening dengan latar belakang gelap (Scarff, et al., 2018).
- Kemudian larutan pewarnaan uranil asetat yang tersisa dihilangkan dan kisi-kisi
dibiarkan mengering di atmosfer sebelum pengukuran. Ukuran partikel rata-rata dan
potensi zeta dari nanopartikel T-P-C ditentukan melalui hamburan cahaya dinamis (DLS)
(ZETAPALS/BI-200SM, BROOKHAVEN). Data dikumpulkan selama 2 menit untuk
setiap sampel. Untuk memeriksa lebih lanjut diameter nanopartikel, mikroskop gaya atom
Titah Rigel Anjalani
6005211008

(AFM, Bruker ICON) digunakan dalam mode penyadapan. Sampel nanopartikel

disiapkan dengan mengencerkan larutan stok hingga konsentrasi 500 M, dan alikuot
ditambahkan pada permukaan mika selama 5 menit, kemudian larutan yang tertahan
dihilangkan. Sampel dikeringkan di atmosfer untuk pencitraan. Stabilitas nanopartikel T-
P-C diuji melalui retardasi elektroforesis dan uji proteksi DNase I, seperti yang dijelaskan
sebelumnya. Sampel nanopartikel T-P-C dengan rasio N/P yang berbeda diajukan ke
elektroforesis agarosa untuk memeriksa perbedaan mobilitas. Aliquot nanopartikel
diperlakukan dengan / tanpa DNase I (1 unit per 1 g DNA), dan campuran diinkubasi
pada 37 ° C selama 1 jam. Selanjutnya, sampel dilakukan analisis elektroforesis agarosa.
- Dimana, Elektroforesis gel memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran dalam media
pendukung padat seperti gel agarosa. Sampel (DNA) dipipet ke dalam sumur sampel,
diikuti dengan penerapan arus listrik yang menyebabkan DNA bermuatan negatif
bermigrasi (elektroforesis) menuju ujung anodal, positif (+ve). Laju migrasi sebanding
dengan ukuran: fragmen yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan berakhir di bagian
bawah gel. DNA divisualisasikan dengan memasukkan dalam gel.
6. Uji Ekspresi Gen Luciferase

- Nanopartikel T–P–C (10 g pDNA) yang diencerkan dalam 2,5 mL medium tidak lengkap
dengan/tanpa obat, ditambahkan ke piring (kepadatan sel: 2 × 104 per cm2) pada suhu 37
°C selama 4 jam transfeksi . Setelah berubah menjadi media lengkap untuk pertumbuhan
44 jam tambahan, sel-sel dilisiskan, dibersihkan dari puing-puing dan diakuot dalam
rangkap tiga untuk analisis ekspresi luciferase. Emisi cahaya ditentukan menggunakan
pembaca pelat mikro fluoresensi (FLUOstar Omega) dengan integrasi sinyal selama 10
detik pada 25 °C. Aktivitas (unit cahaya relatif, RLU) dinormalisasi untuk kandungan
protein.
- Gen luciferase adalah gen reporter. Uji luciferase digunakan untuk menentukan apakah
suatu protein dapat mengaktifkan atau menekan ekspresi gen target. Uji luciferase
mampu membangun hubungan fungsional antara keberadaan protein dan jumlah produk
gen yang dihasilkan. Pengujian ini tidak dapat menentukan apakah protein secara
langsung berinteraksi dengan DNA itu sendiri; protein secara tidak langsung dapat
mempengaruhi transkripsi dengan mengaktifkan atau menekan protein terpisah atau
kompleks protein yang mempengaruhi transkripsi. Luciferase adalah enzim yang
digunakan untuk bioluminesensi oleh berbagai organisme di alam, yang paling terkenal
adalah kunang-kunang. Ilmuwan menghasilkan konstruksi di mana wilayah regulasi gen
target menyatu dengan urutan pengkodean DNA untuk luciferase (Carter and Shieh,
2015).
7. Uji Serapan dan Lokalisasi Nanopartikel

- Serapan seluler nanopartikel T-P-C diukur melalui analisis pencitraan confocal, seperti
yang dijelaskan sebelumnya. Awalnya, kondisi inkubasi untuk penanda endositosis (Tfn-
Titah Rigel Anjalani
6005211008

AF647, 15 menit; Dextran-AF647, 1 jam; dan CTxB-AF647 , 1 jam) dan nanopartikel T-

P-C berlabel DiYO (10 g pDNA per mL, 1 jam) dioptimalkan. Sel-sel diinkubasi dengan
nanopartikel berlabel DiYO pada suhu 37 ° C, kemudian dengan cepat dibilas dengan
PBS/0,5 M NaCl tiga kali, dan inti diwarnai dengan Hochest33342 (1: 2000) selama 15
menit. Setelah tiga kali dibilas dengan PBST, sel segera dicitrakan menggunakan
mikroskop confocal Olympus FV 1000. Gambar diproses menggunakan perangkat lunak
ImageJ.
- Untuk serapan yang ditentukan oleh flow cytometry, trypan blue ditambahkan untuk
memadamkan fluoresensi terkait permukaan sel sebelum sel di-tripsinisasi untuk analisis
segera, seperti yang dijelaskan sebelumnya. Untuk menentukan rute perdagangan
nanopartikel T-P-C, sel ditransfusikan secara sementara dengan plasmid Rab yang
digabungkan dengan EGFP selama ekspresi 24 jam, dan kemudian diinkubasi dengan
nanopartikel untuk penyerapan, seperti dijelaskan di atas. Ko-lokalisasi subseluler
nanopartikel dengan mutan Rab yang diekspresikan (aktivasi / inaktivasi dari) dicitrakan
dan dianalisis, seperti yang dijelaskan sebelumnya
- Flow cytometry (FCM) adalah teknik yang memungkinkan analisis cepat menghitung
jumlah sel yang signifikan secara statistik pada tingkat sel tunggal. Prinsip utama dari
teknik ini didasarkan pada hamburan cahaya dan emisi fluoresensi yang terjadi ketika
sinar laser mengenai sel yang bergerak dalam aliran fluida terarah (Manohar, et al., 2021)
8. Aktivasi Rab GTP-ase

- Aktivasi Rab GTPase dilakukan untuk mengaktifkan sumbu sinyal dalam mengontrol
penyerapan. Secara singkat, sel-sel yang kekurangan serum distimulasi dengan medium
lengkap (10% FBS) selama 30 menit, segera dilisiskan dan diinkubasi dengan manik-
manik yang diimobilisasi dengan GST-Rabaptin-5 (untuk aktivasi Rab5), GST-EEA1
(untuk aktivasi Rab22), GST-pGEX-MICAL-L2-C (untuk aktivasi Rab8 dan Rab10) dan
GST-pGEX-FIP3-RBD11 (untuk aktivasi Rab11). Setelah menngumpulkan pelet yang ke
SDS-PAGE, Rab5, Rab22, Rab8, Rab10 dan Rab11 yang terikat GTP dalam sampel
ditentukan dengan western blotting.
- SDS-Page berbeda dengan Western blotting, dimana SDS PAGE adalah teknologi yang
paling umum digunakan untuk mendapatkan pemisahan analitik resolusi tinggi dari
campuran protein menggunakan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida
(SDSPAGE). Prosedur ini melibatkan denaturasi awal protein komponen dengan deterjen
anionik yang juga mengikatnya, memberikan semua protein muatan negatif yang
sebanding dengan massa molekulnya. Langkah ini diikuti oleh elektroforesis melalui
matriks gel akrilamida berpori yang memisahkan protein dengan resolusi yang sangat
baik berdasarkan massa molekul. Dengan demikian, penilaian kemurnian sampel protein,
evaluasi ekspresi protein, dan identifikasi imunokimia dan kuantifikasi protein (western
blotting) adalah metode yang memanfaatkan SDS-PAGE (Nowakowski, et al., 2014)
9. Western Blot
Titah Rigel Anjalani
6005211008

- Dalam Western blotting (WB), protein target ditransfer ke membran hidrofobik setelah
SDS-PAGE dan dideteksi menggunakan antibodi spesifik. Dalam teknik ini campuran
protein dipisahkan berdasarkan berat molekul, dan dengan demikian menurut jenisnya,
melalui elektroforesis gel. Hasil ini kemudian ditransfer ke membran yang menghasilkan
pita untuk setiap protein. Membran kemudian diinkubasi dengan label antibodi khusus
untuk protein yang diinginkan (Mahmood and Yang, 2012).
- Konsentrasi protein sampel dikuantifikasi menggunakan BCA kit, diselesaikan dengan
SDS-PAGE, dan dihapus dengan Abs utama yang diencerkan sebagai berikut: anti-Arf6
(1 : 1000), anti-Rab5 (1 : 1000), anti-Rab8 ( 1 : 1000), anti-Rab10 (1 : 1000), anti-Rab11
(1 : 1000), anti-Rab22 (1 : 1000), dan anti-β-aktin (1 : 20.000).
10. Model dan Perlakuan Pada Tikus menggunakan Nanopartikel

Semua prosedur dilakukan dengan tikus betina NOD/SCID, karena hanya betina yang
memiliki ovarium. Tikus berusia 6-8 minggu (Beijing HFK Bioscience Co., Ltd) sesuai dengan
pedoman dari Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Universitas Nankai. Tikus diacak
menjadi 6 kelompok (8 tikus per kelompok), dan setiap tikus disuntik secara subkutan dengan 2
× 105 sel Skov3 berlabel DF ke ketiak kanan mereka. Tikus yang memiliki OC diperlakukan
dengan nanopartikel T–P–C (Tat/TF/C16TAB, 1 mg kg−1), nanopartikel T–P (Tat/TF, 1 mg
kg−1) dan nanopartikel T–P–C bersama dengan PTX (T–P–C + P; Tat/TF/C16TAB, 1 mg kg−1;
dan PTX, 10 mg kg−1) dengan injeksi vena ekor seminggu sekali. Injeksi intratumoral NAV2729
(10 mg kg−1) atau EIPA (10mg kg−1) seminggu sekali dilakukan secara paralel dalam kelompok
nanopartikel T–P–C tambahan (T–P–C + E, T–P–C + N). Karena pertumbuhan OC tidak
sepenuhnya dihambat oleh terapi gen bunuh diri berbasis nanopartikel T-P-C, kami mencoba
terapi tambahan dengan menggabungkan nanopartikel T-P-C dengan PTX (T-P-C + P, Tat-TF-
C16TAB + PTX). Semua mencit diberikan intraperitoneal dengan GCV (50 mg kg−1) sekali
sehari dari hari ke 11 sampai akhir percobaan. Garis besar percobaan tikus digambarkan diatas.
11. Visualisasi bioluminesensi kanker ovarium in vivo
Sel Skov3 yang ditransplantasikan dan distribusi nanopartikel yang disebutkan di atas
pada tikus hidup dilacak dengan pencitraan bioluminesensi. Karena luciferases dari Renilla dan
kunang-kunang memiliki substrat yang berbeda (masing-masing coelenterazine dan D-luciferin),
Titah Rigel Anjalani
6005211008

mereka dapat digunakan untuk menggambarkan tumor pada tikus hidup yang sama dengan
kinetika produksi cahaya yang dapat dipisahkan dalam waktu dengan injeksi terpisah dari dua
substrat ini. Secara singkat, intensitas bioluminesensi pada tikus terdeteksi untuk menilai
ekspresi Rluc atau Fluc menggunakan sistem pencitraan in vivo (IVIS 200, XENOGEN). Setelah
anestesi dengan kloral hidrat (280 mg kg-1, ip) dan pemanasan pada pelat pemanas (37 ° C),
tikus yang menerima injeksi vena ekor dengan coelenterazine IV (2,5 mg kg-1) dicitrakan segera
setelah itu selama 4 min untuk menilai ekspresi Rluc (sinyal dari nanopartikel). Satu jam
kemudian, tikus yang disuntikkan secara intraperitoneal dengan D-luciferin (150 mg kg−1)
dipindai selama 1 detik hingga 5 menit untuk menilai ekspresi Fluc (sinyal dari sel Skov3
berlabel DF). Sinyal bioluminesensi dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak Living Image
4.3 dan disajikan sebagai satuan foton rata-rata per detik per sentimeter persegi per steradian
(foton per detik per cm2).
12. Histologi dan Immunohistologi

- Tumor dan jaringan organ lain dari tikus yang diiris diisolasi dan difiksasi selama 24 jam
dengan paraformaldehyde 4%. Paraformaldehyde (PFA) adalah salah satu bahan kimia
yang paling banyak digunakan untuk sampel sel dan jaringan. PFA menyebabkan ikatan
silang kovalen antar molekul, secara efektif merekatkan secara bersama-sama ke dalam
jaringan yang mengubah sifat mekanik permukaan sel. dapat memiliki efek dramatis pada
imobilisasi molekul dalam membran seluler. Memahami proses rinci fiksasi sel di
berbagai keadaan dari sel hidup hingga sel yang benar-benar terfiksasi memberikan
kesempatan untuk mengoptimalkan protokol fiksasi sel dan memanfaatkannya (Kim, et
al., 2017).
- kemudian bagian parafin jaringan setebal 5 m diproses untuk ditanam, diiris, dan
dipanggang.
- Untuk menentukan ekspresi plasmid TF, irisan jaringan diwarnai dengan anti-RFP Ab (1:
200, semalaman pada suhu 4 °C) dan DAPI (2 g mL-1, 30 menit pada RT) untuk
pewarnaan nuklir sesuai dengan instruksi dari kit deteksi SPlink. Pewarnaan hematoxylin
dan eosin (HE) dilakukan pada bagian jaringan yang diamati di bawah mikroskop optik
(Olympus BX51).
13. Apoptosis assay

- Jaringan tumor difiksasi selama 24 jam dengan paraformaldehyde 4% dan kemudian

diproses menjadi cryosection. Cryosection, juga dikenal sebagai biopsi bagian beku,
adalah prosedur laboratorium yang paling sering digunakan dalam bedah onkologi. Lebih
khusus lagi, ini digunakan untuk mengambil analisis mikroskopis dari spesimen, yaitu
sepotong jaringan atau tumor.
- Pewarnaan TUNEL fluoresen in situ dilakukan sesuai dengan instruksi kit deteksi
apoptosis TUNEL. Kontrol negatif dilakukan dengan mengganti tris-buffered saline
Titah Rigel Anjalani
6005211008

(TBS) untuk enzim TdT. Gambar diperoleh dengan mikroskop fluoresen (Olympus) dan
diukur menggunakan perangkat lunak ImageJ (NIH).
- Uji terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL)
telah dirancang untuk mendeteksi sel-sel apoptosis yang mengalami degradasi DNA
ekstensif selama tahap akhir apoptosis. Metode ini didasarkan pada kemampuan TdT
untuk memberi label pada ujung tumpul dari DNA untai ganda yang terlepas dari
template (Kyrylkova, et al., 2012).
14. Analisis Statistik
Semua data diperoleh dari setidaknya tiga percobaan independen dan disajikan sebagai
mean ± SD. Untuk perbandingan dua sampel terhadap kontrol, uji-t Student tidak
berpasangan digunakan kecuali dinyatakan lain. Analisis varians satu arah dengan
perbandingan berganda Dunn digunakan untuk mengevaluasi signifikansi statistik dari
setidaknya tiga kelompok sampel. Uji Dunn merupakan salah satu jenis uji lanjut
nonparametrik yang cocok digunakan sesudah uji Kruskal-Wallis. Uji Dunn melakukan
pembandingan berganda atas rata-rata peringkat skor tiap populasi. Pada uji ini digunakan
nilai kritis sebagai pembanding untuk tiap pasangan rata-rata peringkat skor. Grafik dibuat
menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 8.0. *p < 0,05, **p < 0,01.

DAFTAR PUSTAKA
Capriotti, L., Baraldi, E., Mezzetti, B., Limera, C., & Sabbadini, S. (2020). Biotechnological
Approaches: Gene Overexpression, Gene Silencing, and Genome Editing to Control Fungal and
Oomycete Diseases in Grapevine. International Journal of Molecular Sciences, 21(16),
5701. doi:10.3390/ijms21165701
Cardarelli, F., Digiacomo, L., Marchini, C., Amic, A., Salomone, F., Fiume, G., Rossetta, A.,
Gratton, E., Pozzi, D., Caracciolo, G. 2016. The Intracellular Trafficking Mechanism of
Lipofectamine-based Transfection Reagents and Its Implication for Gene Delivery. Scientific
Reports. Vol 6(25879).
Carter, M. and Shieh, J. 2015. Guide to research techniques in Neuroscience. England: Elsevier
Kennedy, A., & Cribbs, A. P. (2016). Production and Concentration of Lentivirus for
Transduction of Primary Human T Cells. Methods in Molecular Biology, 85–
93. doi:10.1007/978-1-4939-3753-0_7
Kim, S.-O., Kim, J., Okajima, T., & Cho, N.-J. (2017). Mechanical properties of
paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning
ion conductance microscopy. Nano Convergence, 4(1). doi:10.1186/s40580-017-0099-9 
Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., & Kioussi, C. (2012). Detection of Apoptosis by
TUNEL Assay. Odontogenesis, 41–47. doi:10.1007/978-1-61779-860-3_5 
Titah Rigel Anjalani
6005211008

Mahmood, T. and Yang, P. 2012. Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North
American Journal of Medical Sciences. Vol 4(9).
Nowakowski, A. B., Wobig, W. J., & Petering, D. H. (2014). Native SDS-PAGE: high resolution
electrophoretic separation of proteins with retention of native properties including bound metal
ions. Metallomics, 6(5), 1068–1078. doi:10.1039/c4mt00033a 
Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., & Iadaza, M. G. (2018). Variations on Negative
Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of
Visualized Experiments, (132). doi:10.3791/57199