Implikasi jalur pensinyalan Akt, ERK1 / 2 dan alternatif p38MAPK pada apoptosis

sel kanker usus besar manusia yang diinduksi oleh teh hijau EGCG

ABSTRAK

Kami menyelidiki apoptosis yang diinduksi oleh komponen teh hijau

epigallocatechin-3-gallate (EGCG) dan jalur yang mendasari aktivitasnya dalam
garis sel kanker usus besar. Pemahaman lengkap tentang mekanisme dan molekul
yang ditargetkan oleh polifenol teh hijau dapat berguna dalam mengembangkan
pendekatan terapeutik baru untuk pengobatan kanker. EGCG, yang merupakan
polifenol utama dalam teh hijau, memiliki efek sitotoksik dan menyebabkan
kematian sel pada kematian sel HT-29. Dalam studi ini, kami mengevaluasi efek
EGCG pada jalur protein kinase yang diaktifkan mitogen (MAPK) dan Akt.
Pengobatan EGCG meningkatkan fosfoERK1/2, -JNK1/2 dan -p38α , -p38γ dan
-p38δ, serta tingkat fosfo-Akt. Menggunakan kombinasi inhibitor kinase, kami
menemukan bahwa kematian sel yang diinduksi EGCG sebagian diblokir oleh
penghambatan Akt, ERK1/2 atau aktivitas p38MAPK alternatif. Data kami
menunjukkan bahwa jalur kinase ini terlibat dalam efek antikanker EGCG dan
menunjukkan potensi penggunaan senyawa ini sebagai agen kemoterapi untuk
pengobatan kanker usus besar.

INTRODUCTION

Berdasarkan kejadian dan mortalitasnya, kanker usus besar merupakan

penyebab kematian akibat kanker nomor dua di negara maju dan nomor empat di
dunia. Karena lebih dari satu juta kasus baru kanker usus besar didiagnosis setiap
tahun, ini adalah salah satu masalah terbesar pada sistem kesehatan di seluruh dunia
(Jemal et al., 2009; Tenesa dan Dunlop, 2009). Meskipun kemajuan yang cukup
besar dalam beberapa dekade terakhir dalam bedah onkologi dan penerapan
pengobatan radiasi baru dan kemoterapi, kematian akibat kanker usus besar tetap
tinggi karena metastasis.
Dalam beberapa tahun terakhir, kemoprevensi melalui agen yang terjadi
secara alami dalam makanan dan minuman manusia telah menjanjikan untuk
pengelolaan beberapa jenis kanker; ini termasuk teh hijau, salah satu minuman paling
populer di dunia (Yang et al., 2009). Pada model hewan, polifenol teh hijau
menghambat pembentukan dan perkembangan tumor di lokasi organ yang berbeda.
Ada banyak bukti dari berbagai model eksperimental bahwa polifenol teh, terutama
unsur polifenol utama (-) - epigallocatechin-3-gallate (EGCG), telah menandai
aktivitas biologis seperti efek antioksidan, anti-inflamasi dan anti-mutagenik, ( Singh
et al., 2011; Yang et al., 2009). EGCG dan polifenol teh hijau menekan
karsinogenesis eksperimental di paru-paru, saluran pencernaan, prostat, payudara dan
usus besar pada hewan pengerat (Singh et al., 2011; Yang et al., 2009). Beberapa
studi epidemiologi telah menunjukkan hubungan antara konsumsi teh hijau dengan
pencegahan berbagai jenis kanker, termasuk kanker usus besar, dan metastasis
(Singh et al., 2011; Yang et al., 2009).
Komponen teh hijau dilaporkan bertindak baik mengaktifkan atau
menghambat jalur pensinyalan kinase, tergantung pada apakah sel-sel tersebut
beristirahat atau diaktifkan, masing-masing (Stangl et al., 2007). Dengan demikian,
EGCG menghambat aktivitas enzim dan jalur transduksi sinyal seperti jalur
pensinyalan PI3K / Akt- dan mitogen-activated protein kinase (MAPK) dalam sel
yang diaktifkan yang dirangsang dengan agonis seperti IGF-1, EGF atau bFGF, yang
mengarah ke penekanan proliferasi sel dan menginduksi apoptosis, serta
menghambat invasi sel, angiogenesis dan metastasis (Siddiqui et al., 2008; Yang et
al., 2009). Meskipun bergantung pada konteks sel, aktivasi serine / treonine protein
kinase Akt dan MAPK ekstraseluler signalregulated protein kinase (ERK) 1 dan 2
umumnya menghasilkan peningkatan proliferasi sel dan melindungi sel dari
apoptosis (Kyriakis dan Avruch, 2012; Zhang et al., 2011); fosforilasi dari stres-
aktivasi protein kinase c-Jun N-terminal kinase (JNK) 1 dan 2 dan p38MAPK terkait
dengan penangkapan siklus sel dan apoptosis (Kyriakis dan Avruch, 2012). Cacat
pada jalur pensinyalan ini dapat menyebabkan perkembangan kanker.
Subfamili p38MAPK memiliki empat anggota, p38α (MAPK14), p38β
(MAPK11), p38γ (MAPK12) dan p38δ (MAPK13), dikodekan oleh gen yang
berbeda; mereka berbagi urutan protein yang sama dan diaktifkan oleh fosforilasi
ganda yang dimediasi oleh MAPK kinase MKK3 dan MKK6 (Risco dan Cuenda,
2012). Sebagian besar penelitian berfokus pada p38α, yang memiliki fungsi penting
dalam respons sel terhadap stres, serta peran penting dalam menyeimbangkan proses
proliferasi dan diferensiasi sel selama homoeostasis jaringan (Cuadrado dan
Nebreda, 2010; Cuenda dan Rousseau, 2007). Laporan terbaru mengimplikasikan
p38γ dan p38δ pada penyakit metabolik serta kanker dan regenerasi jaringan,
meningkatkan minat pada jalur ini untuk pengembangan strategi terapeutik
(Cuadrado dan Nebreda, 2010; Risco dan Cuenda, 2012). p38γ dan p38δ memiliki
peran onkogenik dalam konteks tertentu. Studi pada tikus yang kekurangan p38γ ,
p38δ, atau keduanya menunjukkan bahwa tikus yang kekurangan p38δ kurang rentan
terhadap karsinogenesis kulit (Schindler et al., 2009), dan bahwa penghapusan
gabungan p38γ dan p38δ sangat mengurangi pembentukan tumor usus besar dalam
model terkait kolitis kanker kolorektal (Del Reino et al., 2014; Schindler et al.,
2009). Selain itu, data dari uji berbasis sel menunjukkan bahwa p38γ mengatur
protein onkogenik yang terlibat dalam perkembangan kanker usus besar, seperti K-
Ras (bermutasi pada 50% kanker usus besar) (Qi et al., 2007). p38γ dan p38δ juga
terlibat dalam regulasi proses yang terkait dengan transformasi sel ganas seperti
proliferasi, penghambatan kontak, kematian sel dan migrasi (Cerezo Guisado et al.,
2011).
Bukti mendukung peran pencegahan EGCG pada kanker. Pemahaman yang
benar tentang mekanisme kerja komponen teh hijau ini diperlukan untuk menetapkan
penggunaannya dalam terapi kanker. Di sini kami mempelajari efek EGCG pada
jalur pensinyalan MAPK dan Akt dalam jalur sel kanker usus besar manusia HT-29
dengan memeriksa aktivasi beberapa isoform p38MAPK. Kami memberikan bukti
bahwa aktivasi EGCG dari Akt, ERK1/2 dan p38δ meningkatkan kematian sel HT-
29, karena regulasi turun dari beberapa rute ini memblokir sebagian kematian sel
yang diinduksi EGCG.

MATERIAL AND METHODS

2.1. Reagent dan Antibodi

(-) - Epigallocatechin gallate (EGCG) dibeli dari Sigma. SB203580 dan Akt
inhibitor VIII diperoleh dari Calbiochem dan zVAD dari BD Bioscience. BIRB0796
dan PD184352 disiapkan dengan sintesis kustom (Kuma et al., 2005), dan JNK-IN-8
disediakan oleh Dr N. Gray (Harvard Medical School, Boston, MA). Antibodi
antip38g dan -p38d untuk western blot dihasilkan dan dimurnikan seperti yang
dijelaskan (Cuenda et al., 1997; Goedert et al., 1997). Anti-p38a dibeli dari Santa
Cruz. Antibodi terhadap ERK1 / 2 dan phospho-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204), Akt
dan phospho-Akt (Ser473), JNK1 / 2, phospho-p38MAPK (Thr180 / Tyr182;
antibodi ini mengenali keempat isoform terfosforilasi-p38), total c-Jun, GSK3a / b
dan phospho-GSK3a/b (Ser21 / 9) berasal dari Cell Signaling Technologies; anti-
phospho-JNK1/2 (Thr183 / Tyr185) berasal dari Biosource dan phospho-c-Jun (Ser
63) dari BD Biosciences. Antibodi sekunder IgG kelinci anti-domba terkonjugasi
peroksidase, anti-kambing dan kelinci anti-tikus berasal dari Perbio Science.

2.2. Kultur sel dan lisis

Garis sel kanker kolorektal manusia HT-29 dan HCT-116 dan sel ginjal
embrionik manusia (HEK) -293T dipertahankan dalam media Dulbecco's Modified
Eagle (DMEM) yang dilengkapi dengan 10% serum sapi janin (FBS), 2 mM L-
glutamin, 100 IU / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin (DMEM lengkap). Sel
kekurangan serum (16 jam) pada DMEM yang dilengkapi dengan L-glutamin dan
antibiotik sebelum stimulasi dengan EGCG. Jika perlu, sel-sel diinkubasi selama 1-
1,5 jam dengan satu atau lebih inhibitor kinase yang diindikasikan (SB203580,
BIRB0796, JNK-IN-8, Akt inhibitor VIII dan PD184352) sebelum stimulasi EGCG.
Karena EGCG dilarutkan dalam DMSO, sel kontrol diinkubasi dengan volume
DMSO yang sama dengan yang digunakan dalam perlakuan. Sel dilisis dalam 50
mM TriseHCl pH 7,5, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM natrium ortovanadat, 10
mM NaF, 5 mM pirofosfat, 0,27 M sukrosa, 0,1 mM phenylmethylsulphonyl
fluoride, 1% Triton X-100, 0,1% 2 -mercaptoethanol dan koktail penghambat
proteinase lengkap (Roche). Lisat disentrifugasi (15.000 x g, 10 menit, 4˚C),
supernatan dihilangkan, cepat dibekukan, dan disimpan pada -20˚C. Konsentrasi
protein ditentukan dengan metode Bradford.

2.3. Produksi dan transduksi short hairpin RNA (shRNA) Lentivirus

Untuk knockdown konstruksi manusia endogen p38g dan p38d MISSION
shRNA dalam vektor ekspresi pLKO.1-Puro lentiviral dibeli dari Open Biosystem.
Klon TRCN0000006145 (disebut sh145), TRCN0000006146 (sh146),
TRCN0000006147 (sh147) dan TRCN0000006148 (sh148) digunakan untuk
percobaan knockdown p38g; dan mengkloning TRCN0000000827 (shp827) dan
TRCN0000000979 (shp979) ke knockdown p38d. Vektor pLKO.1-Puro kosong
digunakan sebagai kontrol. Untuk menghasilkan partikel transduksi lentiviral, sel
HEK-293T yang tumbuh dalam cawan 10 cm ditransfeksi bersama dengan plasmid
pengkode-shRNA 5 µg dengan kemasan 5 µg plasmid pCMV delta R8.2 dan 2 µg
envelope plasmid pMD2.G, menggunakan metode polietilenimin. Media yang
mengandung virus dikumpulkan pada 40 dan 64 jam pasca transfeksi. Media dari
kedua titik waktu dikumpulkan, disaring melalui filter 0,45 µm, alikuot dan disimpan
pada suhu 80˚C. Untuk transduksi lentiviral sel HT-29, 1 ml supernatan virus, 8 mg /
ml polibrena dan HEPES hingga konsentrasi akhir 10 mM ditambahkan ke sel pada
pertemuan 50% dalam wadah enam lubang. Setelah 24 jam, 0,5 ml supernatan virus,
8 µg/ml polybrene dan HEPES (konsentrasi akhir 10 mM) ditambahkan. Media yang
mengandung virus dikeluarkan setelah 24 jam dan sel yang berhasil terinfeksi dipilih
dengan penambahan 2,5 µg/ml puromisin ke dalam medium. Sel dipertahankan
dalam medium dengan 2 µg /ml puromisin sampai panen.

2.4. Western blot

Sampel protein diselesaikan dengan SDS-PAGE dan ditransfer ke membran
nitroselulosa, yang diblokir (30 menit) dalam 50 mM Tris / HCl (pH 7,5), 0,15 M
NaCl, 0,05% (v / v) Tween (buffer TBST) yang mengandung 5 % (w / v) susu kering
tanpa lemak, kemudian diinkubasi dalam buffer TBST dengan 5% (w / v) susu
kering non-lemak dan antibodi 0,5-1 µg/ml (semalam, 4 ˚C). Protein dideteksi
dengan menggunakan antibodi sekunder terkonjugasi lobak lobak dan reagen
chemiluminescence yang ditingkatkan (Amersham Pharmacia Biotech).

2.5. Analisis aliran sitometri kematian sel

HT-29 sel diobati dengan konsentrasi EGCG yang ditunjukkan (24 jam),
ditripsinisasi dan disuspensi kembali di PBS dengan propidium iodida (PI) (0,25
µg /mL). Sel yang layak (PI-negatif) diukur dengan aliran sitometri menggunakan
Cytomics FC500 (BeckmanCoulter). Untuk mengevaluasi apoptosis, sel yang
dirawat diwarnai dengan Annexin V-FITC dalam buffer pewarnaan Annexin V
selama 15 menit pada suhu kamar dan diwarnai dengan PI dan dianalisis dalam
sitometer FACSCalibur (BD Biosciences). Profil dianalisis dengan software FlowJo
(BD Biosciences).

2.6. Analisis statistik

 Untuk perbandingan statistik antara dua kelompok, data dianalisis dengan uji-
t Student dua sisi, menggunakan software GraphPad Prism v.4.0b. Nilai p≤ 0,05
dianggap signifikan.

RESULTS

3.1. EGCG menginduksi aktivasi jalur MAPK dan Akt di sel HT-29
Untuk mendeteksi aktivasi berbagai jalur MAPK, kami merawat HT29 sel
adenokarsinoma usus besar manusia dengan pembawa saja (DMSO 0,05%) atau
dengan EGCG 1e50 mM (1 jam) dan menganalisis lisat sel di western blot
menggunakan antibodi spesifik. Pada 1 mM, perlakuan EGCG menyebabkan
fosforilasi ERK1 / 2, sedangkan JNK1 / 2 dan p38a difosforilasi pada 5 mM EGCG,
dengan maksimum pada 50 mM (Gambar 1AeC). Konsentrasi EGCG yang lebih
tinggi (100e200 mM) menyebabkan kematian sel setelah pengobatan 1 jam dan tidak
lebih meningkatkan fosforilasi MAPK (tidak ditampilkan). Dalam sel HT-29, p38g
dan p38d diekspresikan dan diaktivasi oleh 50 mM EGCG (Gbr. 1D, E); aktivasi ini
bersifat sementara, dengan maksimum pada 1 jam (Gbr. 1E). Karena p38a, p38g dan
p38d memiliki mobilitas elektroforesis yang berbeda, fosforilasi mereka dapat
divisualisasikan dalam western blot yang sama menggunakan antibodi antiphospho-
p38MAPK, yang mengenali keempat isoform p38 terfosforilasi. Aktivator hulu
p38MAPK MKK3 dan MKK6 juga difosforilasi sebagai respons terhadap EGCG
(Gbr. 1C). Ekspresi protein dari bentuk tidak aktif tetap tidak berubah. Banyak
penelitian menunjukkan bahwa fosforilasi basal Akt secara potensial dihambat oleh
EGCG di beberapa lini sel kanker (Liu et al., 2013; Shankar et al., 2013; Shimizu et
al., 2010; Siddiqui et al., 2004; Siegelin et al., 2004; Siegelin et al. ., 2008; Singh et
al., 2011). Kami kemudian memeriksa fosforilasi ini dalam sel HT-29, dan
menemukan bahwa pengobatan EGCG menginduksi fosforilasi Akt (Gambar 1F).
Untuk memastikan bahwa efek ini tidak spesifik sel, kami mengobati karsinoma usus
besar manusia sel HCT-116, sel karsinoma epitelial manusia A431 dan sel
adenokarsinoma payudara manusia MDA-MB-231 dengan DMSO saja atau 50 mM
EGCG (1 jam); Sedangkan untuk sel HT-29, Akt diaktivasi setelah pengobatan
EGCG, meskipun aktivasi lebih kuat pada garis sel karsinoma usus besar
dibandingkan pada sel kanker lainnya (Gbr. 1G). Aktivasi ERK1 / 2 juga dianalisis
dalam kontrol sel HCT-116, A431 dan MDA-MB-231.

3.2. Penghambatan jalur p38 dan ERK1 / 2, tetapi tidak pada JNK, memblokir
sebagian kematian sel yang diinduksi EGCG
EGCG dapat menginduksi penangkapan siklus sel dan apoptosis dalam sel manusia
(Yang et al., 2009). Kami menganalisis kematian sel HT-29 yang diinduksi EGCG
dengan aliran sitometri, menggunakan pewarnaan Annexin V-FITC / PI dan PI, yang
memungkinkan kuantifikasi sel apoptosis hidup dan mati (Gbr. 2A). Setelah 24 jam
pengobatan dengan 25 atau 50 mM EGCG, persentase sel HT29 hidup menurun> 40
atau 50%, masing-masing, yang dikaitkan dengan peningkatan bersamaan dalam
persentase sel apoptosis (Gbr. 2A, B). Pra-pengobatan sel dengan penghambat
caspase zVAD mengembalikan efek EGCG dalam kematian sel, mengkonfirmasikan
bahwa EGCG menginduksi apoptosis (Gbr. 2C). Sel apoptosis meningkat secara
bertahap menjadi sekitar 30% dan 50% pada sel HT-29 yang diobati dengan 50 mM
EGCG selama 6 dan 24 jam, masing-masing. Pengobatan dengan 100 atau 200 mM
EGCG menyebabkan 100% kematian sel HT-29 (hasil tidak ditunjukkan). Tidak ada
perubahan signifikan dalam persentase sel hidup atau mati pada kontrol yang diobati
dengan DMSO (Gbr. 2B).
Untuk menentukan apakah kematian sel yang diinduksi EGCG dimediasi oleh
jalur pensinyalan MAPK dalam sel HT-29, kami merawat sel dengan EGCG saja
atau dengan berbagai inhibitor kinase dan memeriksa kelangsungan hidup sel dan
apoptosis. Baik SB203580 dan BIRB0796 konsentrasi rendah menghambat p38a dan
p38b (Bain et al., 2007; Kuma et al., 2005). Tak satu pun dari inhibitor p38MAPK
ini melindungi sel dari kematian yang diinduksi EGCG, meskipun konsentrasi
BIRB0796 tinggi, yang menghambat semua isoform p38 (Gbr. 3A) dan JNK1 / 2
(Bain et al., 2007; Kuma et al., 2005), sebagian terlindungi sel melawan kerusakan
polifenol teh hijau. Pra-inkubasi sel dengan konsentrasi BIRB0796 tinggi secara
signifikan meningkatkan kelangsungan hidup sel (persentase sel PI negatif) (EGCG
saja, 39,5% ± 14,3; EGCG þ BIRB0796, 55,7% ± 7,7) dan penurunan apoptosis sel
(persentase Annexin V dan PI positif sel) (EGCG saja, 56,6% ± 18,3; EGCG þ
BIRB0796, 36,4% ± 9,9) (Gbr. 3B); ini menunjukkan 40% blokade kematian sel
akibat EGCG dibandingkan dengan EGCG saja. Karena JNK1 / 2 diaktivasi oleh
EGCG dan dihambat oleh konsentrasi BIRB0796 yang tinggi, kami menginkubasi sel
dengan inhibitor JNK kovalen selektif JNK-IN-8 (Gbr. 3C; Zhang et al., 2012) dan
memeriksa efek EGCG pada kematian sel dan kelangsungan hidup. JNK-IN-8 tidak
mengubah kematian sel yang diinduksi EGCG (Gbr. 3B), menunjukkan bahwa efek
yang diamati pada konsentrasi BIRB0796 tinggi disebabkan oleh aktivitas p38g atau
p38d.
Karena konsentrasi BIRB0796 yang tinggi memblokir p38g dan p38d, kami
menghentikan ekspresi p38g atau p38d dalam sel HT-29 untuk menguji
kontribusinya terhadap kematian sel yang diinduksi EGCG. Kami membuat garis sel
HT29 yang terinfeksi secara stabil dengan vektor lentiviral yang mengekspresikan
empat shRNA berbeda yang menargetkan p38g atau dua shRNA berbeda yang
menargetkan p38d atau vektor kosong. Dalam ekstrak sel total, vektor shRNA sh145,
sh147 dan sh148 secara nyata mengurangi ekspresi p38g, sedangkan sh827 dan
sh979 mengurangi ekspresi p38d, tetapi tidak pada isoform p38 lain dibandingkan
dengan sel yang tidak terinfeksi (tidak ditampilkan) atau sel yang terinfeksi dengan
pLKO kosong. 1 vektor (Gambar 3D, F). Kami merawat jalur sel HT-29 yang
kekurangan p38g dan yang kekurangan p38d dengan EGCG untuk mempelajari
kematian sel. Kekurangan p38g atau p38d tidak melindungi sel dari apoptosis yang
diinduksi EGCG (Gambar 3E, G), menunjukkan bahwa p38g atau p38d saja tidak
memodulasi aksi EGCG. Meskipun demikian, hasil yang diperoleh dengan inhibitor
BIRB0796 menunjukkan bahwa kedua kinase ini dapat bertindak bersama-sama
mengatur kematian sel HT-29 yang diinduksi EGCG.
Pada konsentrasi rendah, PD184352 menghapus aktivasi ERK1 / 2 dalam sel
yang dirawat (Gambar 4A) dan pada konsentrasi tinggi, aktivasi ERK5 (Bain et al.,
2007). Di western blot menggunakan antibodi spesifik, kami tidak mendeteksi
ekspresi ERK5 dalam sel ini (tidak ditampilkan). Kedua konsentrasi sel melindungi
sebagian dari efek EGCG. Perlakuan awal sel HT-29 dengan 1 mM PD184352 secara
signifikan menurunkan apoptosis sel (EGCG saja, 56.6% ± 18.3; EGCG+PD184352,
37.6% ± 9.0) dan meningkatkan kelangsungan hidup sel (EGCG saja, 39.5% ± 14.3;
EGCG+PD184352, 54.7 % ± 12) (Gbr. 4B), menunjukkan bahwa ERK1 / 2 terlibat
dalam apoptosis sel yang diinduksi EGCG.
Semua kombinasi inhibitor memblokir 50% kematian sel total yang disebabkan oleh
pengobatan 24 jam dengan 50 mM EGCG. Meskipun demikian, perbedaan
peningkatan kelangsungan hidup atau penurunan kematian sel antara sel yang telah
diinkubasi dengan masing-masing inhibitor saja atau dalam kombinasi tidak
signifikan. Data ini menunjukkan kurangnya sinergi antara jalur kinase ini pada
apoptosis sel HT-29 yang diinduksi EGCG.

3.3. Jalur Akt secara parsial mengatur kematian sel HT-29 yang diinduksi EGCG

Karena pengobatan EGCG pada sel kanker usus besar mengaktifkan Akt (Gbr. 1F,
G), kami mempelajari implikasinya dalam kematian sel yang diinduksi polifenol teh
hijau. Kami menganalisis kelangsungan hidup sel, sendiri atau dengan penghambat
kinase Akt VIII, yang memblokir aktivitas Akt dan merusak fosforilasi substrat
GSK3a / b (Gbr. 4C). Akt VIII melindungi sebagian sel HT-29 dari kerusakan akibat
EGCG, dengan peningkatan kelangsungan hidup yang signifikan (EGCG saja, 39,5%
± 14,3; EGCG þ Akt VIII, 59,2% ± 9,6) dan kematian sel (EGCG saja, 56,6% ±
18,3) ; EGCG þ Akt VIII, 32,3% ± 11,3) (Gbr. 4D). Hasil ini menunjukkan bahwa
jalur Akt terlibat dalam apoptosis sel yang dimediasi EGCG.

3.4. Inkubasi sel HT29 dengan kombinasi inhibitor kinase berbeda tidak
meningkatkan perlindungan terhadap EGCG
Untuk menentukan apakah lebih dari satu jalur kinase terlibat dalam modulasi
kematian yang diinduksi EGCG dalam sel HT-29, kami melakukan preinkubasi sel
dengan kombinasi berbagai inhibitor kinase, dan menganalisis kelangsungan hidup
sel setelah pengobatan EGCG (Gbr. 5); hanya inhibitor yang memblokir sebagian
efek EGCG pada kematian sel yang diuji. Penghambatan gabungan p38 dan Akt, dari
p38 dan ERK1 / 2 atau p38, atau dari Akt dan ERK1 / 2 tampaknya memiliki efek
yang lebih besar daripada penghambatan masing-masing jalur saja (Gambar 5, 3B).
Pra-inkubasi dengan 10 mM BIRB0796 ditambah 1 mM Akt VIII meningkatkan
kelangsungan hidup sel (EGCG saja, 39,5% ± 14,3; EGCG þ inhibitor, 61,2% ± 4,3)
dan penurunan kematian sel (EGCG saja, 56,6% ± 18,3; EGCG + inhibitor, 29,6% ±
8,4), sedangkan pra-inkubasi dengan 10 mM BIRB0796 ditambah 1 mM PD184352
meningkatkan kelangsungan hidup sel (54,8% ± 11,1) dan menurunkan apoptosis sel
(27,7% ± 7,6). Hasil serupa ketika sel diobati dengan tiga penghambat kinase (Gbr.
5).
Semua kombinasi inhibitor memblokir 50% kematian sel total yang
disebabkan oleh pengobatan 24 jam dengan 50 mM EGCG. Meskipun demikian,
perbedaan peningkatan kelangsungan hidup atau penurunan kematian sel antara sel
yang telah diinkubasi dengan masing-masing inhibitor saja atau dalam kombinasi
tidak signifikan. Data ini menunjukkan kurangnya sinergi antara jalur kinase ini pada
apoptosis sel HT-29 yang diinduksi EGCG.

DISCUSSION

Di sini kami menunjukkan bahwa pengobatan dengan EGCG, pada

konsentrasi dalam kisaran minuman teh hijau normal (Yang et al., 2009),
menyebabkan kematian sel karsinoma manusia HT-29. Setelah perlakuan EGCG,
fosforilasi ERK1 / 2, JNK1 / 2, p38a, p38g, p38d dan Akt meningkat. Hasil ini
konsisten dengan pengamatan sebelumnya pada sel kanker lain dan sel dari sistem
vaskular yang diobati dengan polifenol teh hijau (Chen et al., 2003), tetapi berbeda
dengan kesimpulan dalam laporan lain yang menunjukkan efek penghambatan
EGCG pada MAPK dan Akt. aktivasi di glioblastoma, karsinoma paru, kanker
prostat atau bahkan garis sel kanker usus besar (Singh et al., 2011; Yang et al., 2009;
Park et al., 2013). Alasan perbedaan ini tidak jelas, tetapi mungkin dikaitkan dengan
garis sel yang digunakan atau aktivasi sel. Telah disarankan bahwa EGCG
menghambat jalur pensinyalan dalam sel yang diaktifkan, tetapi dalam sel istirahat
komponen teh hijau mengaktifkan jalur pensinyalan yang berbeda seperti ERK1 / 2,
Akt atau p38MAPK (Stangl et al., 2007). Studi lebih lanjut diperlukan untuk
menentukan mekanisme molekuler dimana EGCG bertindak berbeda tergantung
pada status sel.

Pra-pengobatan dengan PD184352 atau Akt inhibitor VIII secara signifikan

menurunkan kerusakan sel HT-29 yang diinduksi EGCG, yang menyoroti efek
negatif ERK1 / 2 dan Akt pada kelangsungan hidup sel. Konsentrasi tinggi
BIRB0796, yang menghambat semua isoform p38a, p38b, p38g, p38d dan JNK,
menyebabkan pembalikan parsial (40%) kematian sel yang diinduksi EGCG dan
dengan demikian melibatkan jalur JNK1 / 2 dan p38. Apoptosis sel dalam
menanggapi pengobatan EGCG tetap tidak berubah oleh penghambat JNK spesifik
JNK-IN-8, oleh SB203580 (yang menghambat p38a dan p38b), atau oleh p38g dan
p38d knock-down. Meskipun demikian, kami tidak dapat mengesampingkan
kemungkinan bahwa pembalikan parsial apoptosis yang diinduksi EGCG yang
diamati pada sel yang diobati sebelumnya dengan BIRB0796 disebabkan oleh
penghambatan p38g dan p38d, karena redundansi fungsional telah dilaporkan dalam
proses biologis lain antara kedua p38MAPK ini. isoform. Dengan demikian, produksi
sitokin yang diinduksi LPS dihambat dalam makrofag knock-out p38g dan p38d dan
sel dendritik, tetapi tidak pada sel knock-out tunggal p38g atau p38d (Risco et al.,
2012). Selain itu, penghapusan gabungan p38g dan p38d merusak artritis yang
diinduksi kolagen, kolitis, dan kanker usus besar yang terkait dengan kolitis pada
model tikus, sedangkan tikus knock-out p38g atau p38d mengembangkan patologi ini
pada tingkat yang sama dengan tikus tipe liar (Criado et al. , 2014; Del Reino et al.,
2014).

Kami menunjukkan bahwa dalam sel HT-29, pengobatan EGCG mengarah

pada aktivasi berkelanjutan secara simultan dari ketiga jalur utama MAPK, bersama
dengan Akt, yang memiliki fungsi biologis berbeda dan dalam beberapa kasus,
kontras. ERK1 / 2 dan Akt terkait dengan proliferasi dan kelangsungan hidup sel,
sedangkan JNK1 / 2 dan p38 dikaitkan dengan apoptosis yang diaktivasi oleh stres
(Kyriakis dan Avruch, 2012; Zhang et al., 2011); kami tetap menemukan bahwa
ERK1 / 2, p38MAPK dan Akt, tetapi tidak JNK yang terlibat dalam kematian sel
yang diinduksi EGCG. Karena deregulasi jalur MAPK dan Akt sering terjadi pada
berbagai jenis kanker, modulasi EGCG kinase ini dapat memberikan strategi baru
untuk pencegahan atau pengobatan kanker manusia.

Meskipun bukti eksperimental yang berkembang mendukung potensi

pencegahan EGCG pada kanker, penting untuk memahami mekanisme yang
mengurangi risiko untuk menetapkan efektivitasnya untuk penggunaan terapeutik.
Efek EGCG tampaknya cukup spesifik, dan garis sel kanker tampaknya lebih sensitif
daripada sel normal, karena EGCG memiliki efek penghambatan pertumbuhan yang
nyata pada fibroblas manusia yang diubah, tetapi tidak pada sel normal (Chen et al.,
1998) . Pengamatan ini menunjukkan bahwa EGCG mungkin bertindak sebagai agen
penekan promosi dan perkembangan sel adenoma dan karsinoma, meskipun
mekanisme molekuler yang tepat tidak sepenuhnya ditetapkan.

CONCLUSSION

Dalam studi ini, kami memeriksa mekanisme molekuler apoptosis sel yang diinduksi
EGCG pada HT-29 garis sel adenokarsinoma usus besar manusia, dan menunjukkan
bahwa beberapa jalur pensinyalan terlibat dalam efek EGCG. Hasil kami
menunjukkan bahwa jalur Akt, ERK1 / 2 dan alternatif p38MAPK berfungsi secara
independen dalam induksi kematian sel, dan menunjukkan bahwa komponen
molekuler lain yang tidak diketahui terlibat dalam proses ini. Karena studi ini
didasarkan pada garis sel kanker usus besar, kami menganggap bahwa mekanisme
yang diusulkan mungkin lebih relevan dengan strategi terapeutik daripada efek
pencegahan kanker dari teh.