Studi Mutasi A3243G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe 2 Menggunakan PCR-RFLP Iman

Permana Maksum*, Toto Subroto*, Anas Subarnas**, Budhi Prihartanto**Amelia Fauziana*, Neti* *Jurusan Kimia FMIPA Unpad ** Jurusan Farmasi FMIPA Unpad Jalan Raya Jatinangor-Sumedang Km 21 Jatinangor, Jawa Barat ABSTRAK Diabetes mellitus tipe 2 (DM tipe 2) merupakan salah satu penyakit kronis yang banyak terjadi di Indonesia dengan jumlah penderita yang semakin meningkat. Kete rlibatan faktor genetik dan faktor lingkungan menjadikan studi genetik mengenai penyakit ini menjadi sangat penting. Salah satu bentuk DM tipe 2 ini adalah Maternal Inherited Diabet es and Deafness (MIDD) yang disebabkan oleh adanya mutasi DNA mitokondria (mtDNA). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi mutasi heteroplasmi A3243G pada gen tRNALeu mtDNA manusia Indonesia dan pewarisannya pada penderita DM tipe 2 dengan memanfaatkan teknologi PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragments Length Polymorphism). Sampel yang digunakan adalah sel darah yang diambil secara acak dari 101 subjek manusia Indonesia penderita DM tipe 2 dan dua generasi keturunan dari sampel positif mutasi A3243G. mtDNA diisolasi dari sel limfosit, dan gen tRNALeu mtDNA diamplifikasi dengan teknik PCR menggunakan primer D1/D2. Fragmen 294 pb hasil P CR dimurnikan dengan metode presipitasi etanol dan dikarakterisasi dengan menggunak an enzim restriksi ApaI untuk mengidentifikasi mutasi A3243G. Hasil penelitian ini menunj ukkan adanya mutasi heteroplasmi A3243G pada gen tRNALeu DNA mitokondria penderita dia betes mellitus tipe 2 di Indonesia dengan tingkat prevalensi 2% dan tidak dapat mendet eksi mutasi pada dua generasi selanjutnya dikarenakan tingkat mutasi heteroplasmi yang renda h. PENDAHULUAN Faktor genetik sangat berperan dalam timbulnya penyakit diabetes mellitus tipe 2 selain karena faktor lingkungan. Gen-gen pada DNA mitokondria manusia (mtDNA) me njadi salah satu kemungkinan penyebab diabetes mellitus tipe 2 karena fosforilasi oksi datif yang terjadi di mitokondria memainkan peranan yang penting dalam sekresi insulin oleh sel b pankreas saat terjadinya respon glukosa dan nutrien yang lainnya dalam tubuh [Ka dowaki et

Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

al., 1994]. Mutasi gen pada mtDNA ini menyebabkan suatu bentuk diabetes tipe 2 y ang dikenal dengan MIDD (Maternal Inherited Diabetes and Deafness). Bentuk diabetes ini dikarakterisasi oleh diagnosis pada usia di atas usia 25 tahun, terjadi gangguan pada sekresi insulin dan sering diikuti oleh melemahnya indera pendengaran [Malecki et al., 2 001]. Beberapa penelitian mengenai mutasi gen mtDNA yang berhubungan dengan diabetes mellitus tipe 2 ini telah dilakukan di berbagai populasi di Jepang, Korea, China , Prancis, Australia, Inggris, Belanda dan Polandia dan terdapat beberapa mutasi gen yang t elah dilaporkan, diantaranya yang paling banyak ditemukan adalah mutasi titik A3243G pada gen tRNALeu [Malecki et al., 2001; Ohkubo et al., 2001 ; Lee et al., 1997; Froguel & Hager, 1995; Ng et al., 2001; t Hart et al., 1994; and Saker et al., 1997]. Mutasi ini terjadi pada sisi pengikatan DNA mitokondria untuk protein promotor terminasi transkripsi pada bat as antara RNA ribosom 16S dan gen tRNALeu . Mutasi ini tidak hanya mempengaruhi sintesis d ari tRNALeu tetapi juga menggangu mekanisme pengikatan faktor terminasi transkripsi, yang dapat menyebabkan terganggunya sintesis dari protein-protein mitokondria [Kadowa ki et al., 1994]. Penelitian ini merupakan bagian dari upaya untuk mendapatkan data base varian normal dan tidak normal mtDNA manusia Indonesia dan produk translasinya dengan memanfaatkan teknologi PCR. Pada penelitian sebelumnya telah ditemukan 67 varias i nukleotida mtDNA 41 manusia Indonesia normal baik pada daerah penyandi maupun no n penyandi, yaitu pada posisi 5.042-6384 (fragmen X), 11.580-13.200 (fragmen F), 1 5.978 16.420 (fragmen M) urutan Anderson [Triraharjo, 1998; Puspasari, 1998; Gaffar, 1 998; Rachmayanti, 2000; Wayan, 2001; Maksum, I.P., 2002].Selanjutnya dilakukan peneli tian mengenai analisis urutan nukleotida manusia Indonesia yang mempunyai hubungan ke luarga menurut garis keturunan ibu. Penelitian tersebut menganalisis pola variasi uruta n nukleotida 0,4 kb daerah D-loop mtDNA pada tiga generasi segaris keturunan ibu yang mempuny ai homologi 100 % [Maksum, 2003]. Pada penelitian ini, analisis mutasi A3243G gen tRNALeu akan dikembangkan ke penggunaan metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi ApaI dan diharapkan dapat mendeteksi mutasi heteroplasmi yang terjadi dan pewarisannya ke generasi berikut nya melalui segaris keturunan ibu sehingga potensi mutasi tersebut dapat terdeteksi pada usi a muda.

Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

METODE PENELITIAN Bahan dan penyiapan mtDNA templat Sampel diambil dari darah 101 penderita diabetes mellitus (DM) tipe 2 manusia Indonesia dan dua keturunan segaris keturunan ibu dari sampel positif mutasi A(3 243)G. 101 Sampel penderita DM tipe 2 tersebut dianalisis dengan PCR-RFLP untuk dipelajari mutasi A(3243)G yang menunjukkan fenotip MIDD. Sebagai kontrol digunakan sampel darah manusia normal. MtDNA templat disiapkan menggunakan metode lisis sel limfosit dengan bufer lisis yang terdiri atas Tris-HCl 50 mM pH 8,5; EDTA 1 mM pH 8,0; proteinase K 0,04 mg/ mL, dan tween-20 0,5% [Noer, et al., 1994]. Sebelumnya sel limfosit diperoleh dengan cara mencuci sampel darah sebanyak 500 m L dengan 500 m L bufer TE (Tris-HCl 10 mM, p H 8,0; EDTA 1 mM, pH 8,0), pencucian dilakukan secara berulang sampai diperoleh pelet p utih. Lisis sel dilakukan dengan metode maniatis. Amplifikasi mtDNA secara in vitro (PCR) Amplifikasi fragmen 294 pb gen tRNALeu mtDNA dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer D1/D2. Campuran reaksi mengandung enzim Taq DNA Polymerase 1 unit, mtDNA templat hasil lisis, sepasang primer masing-masing 1 m M, bufer PCR 10x (TrisHCl 10 mM, pH 9,0, NaCl 50 mM, Triton x-100 0,1%), dNTP 200 m M, MgCl2 2 m M dan ddH2O steril. Proses PCR akan dilakukan dalam mesin PCR Automatic Thermal Cycler 30 siklus. Tahap awal PCR adalah denaturasi awal yang akan dilakukan pada suhu 94oC selama 5 menit, kemudian masuk ke program siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri tiga tahap yaitu denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, penempelan primer (anneal ing) pada suhu 56oC selama 30 detik, dan perpanjangan primer (extension) pada suhu 72oC se lama 50 detik. Akhir dari semua siklus dilakukan tambahan proses extension pada suhu 72o C selama 10 menit [Zhang et al., 2001]. Hasil dianalisis menggunakan elektroforesis gel agar osa 1,5% (b/v) dengan DNA marker pUC19/HinfI dan visualisasi dengan bantuan lampu ultra violet. Karakterisasi hasil PCR dengan enzim ApaI (RFLP) Pemurnian hasil PCR akan dilakukan dengan metode presipitasi etanol [Sambrook, e t al., 1989]. Hasil PCR murni akan dikarakterisasi dengan enzim ApaI (15 unit) dal am bufer

Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

10x yang diinkubasi pada suhu 37oC selama overnight. Hasil inkubasi akan dianali sis menggunakan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) dengan DNA marker pUC19/HinfI da n dapat dilihat secara visual dengan bantuan lampu ultra violet. Analisis Homologi daerah Hiper Variabel I D-Loop mtDNA Pada penelitian ini amplifikasi 0,4 kb daerah D-loop menggunakan primer M1/M2 [Aquadro and Greenberg, 1983]. Campuran reaksi PCR dilakukan di dalam tabung mik ro yang terdiri atas templat mt DNA hasil lisis, primer M1 /M2, bufer PCR 10 x, 2 u nit enzim Taq DNA Polymerase, dNTP dan ditambah ddH2O steril. Proses PCR dilakukan dengan mesi n Automatic Thermal Cycler 30 siklus. Tahap awal dari proses PCR adalah denaturasi awal yang dilakukan pada suhu 94 C selama 1 menit, kemudian masuk ke program siklus PCR den gan masing-masing siklus terdiri tiga tahap yaitu denaturasi yang dilakukan pada suh u 94 C selama 1 menit, annealing yang dilakukan pada suhu 50 C selama 1 menit dan extent ion atau polimerisasi pada suhu 72 C selama 1 menit. Akhir dari semua siklus dilakukan tam bahan polimerisasi pada suhu 72 C selama 4 menit. DNA hasil PCR disimpan pada suhu 20 C. Hasil amplifikasi dari proses PCR tersebut selanjutnya dianalisis dengan elektro foresis gel agarosa 1,2 % (b/v) dengan penanda kontrol yang digunakan adalah pUC19/HinfI . Sekuensing Sekuensing DNA merupakan tahapan akhir penentukan urutan nukleotida fragmen hasil amplifikasi. Sekuensing dilakukan dengan metode Dideoksi Sanger menggunaka n Automatic DNA Sequencer yang berdasarkan pada metode Dye Terminator Labeling. Tahapan sekuensing DNA yang dilakukan pada penelitian ini meliputi : (1) penyiap an DNA templat, (2) proses amplifikasi melalui PCR dengan menggunakan primer univer sal T7, (3) pemurnian DNA dengan kolom Sephadex G-50 , (4) elektroforesis pada gel poliakrilamida, dan (5) pembacaan elektroforegram hasil sekuensing. Direct Sequencing Direct sequencing merupakan tahapan untuk menentukan urutan nukleotida fragmen hasil amplifikasi dengan PCR tanpa melalui proses kloning. Metode sekuensing yan g digunakan sama seperti proses sekuensing biasa, tetapi ada beberapa perbedaan da lam

4 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

tahapan-tahapan reaksinya, yaitu pada penyiapan DNA templat dan proses amplifika si dengan PCR. HASIL DAN PEMBAHASAN Pemilihan dan Pengambilan Sampel Sel Darah dan Sel Epitel Sampel adalah sel darah dari 101 subjek penderita diabetes mellitus tipe 2 di Ru mah Sakit Cimbuleuit, Rumah Sakit Pindad, Laboratorium Klinik Prodia, dan Laboratori um Klinik Pramita, Bandung. Pemilihan sel darah sebagai sampel dikarenakan sel ini mempuny ai jumlah organel mitokondria yang cukup banyak [Thorpe, 1984]. Alasan lainnya adalah kare na sampel darah relatif mudah untuk diambil dan telah digunakan sebagai sampel pada peneli tian yang dilakukan oleh Ohkubo et al.[2001], Lee et al. [1997], dan Malecki et al. [2001] untuk menganalisis mutasi A3243G mtDNA yang berhubungan dengan diabetes mellitus di Je pang, Korea, dan Polandia. Sampel diambil secara acak dari penderita yang positif diab etes mellitus tipe 2 dengan rentang usia 25 tahun ke atas. Tetapi pada penelitian Shanske et a l. (2004) menemukan bahwa sel darah memiliki persentase heteroplasmi yang lebih rendah dan sedimen urin memiliki persentase heteroplasmi lebih tinggi dibandingkan darah, begitu ju ga dibandingkan dengan rambut, kulit dan mukosa. Bersasarkan penelitian tersebut, m aka diambil sampel darah dan sampel urin dari sampel positif mutasi A(3243)G menggun akan PCR-RFLP dengan enzim restriksi ApaI dimana dua keturunannya segaris keturunan i bu ikut dianalisis pola pewarisan mutasi A(3243)G pada penelitian ini. Amplifikasi Templat mtDNA secara Invitro dengan PCR Templat mtDNA hasil lisis selanjutnya diamplifikasi untuk mendapatkan gen tRNALe u secara invitro dengan metode PCR menggunakan primer D/D2 [Zhang et al., 2002]. H asil PCR kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) menggunakan metode EtBr staining seperti yang telah dilakukan Zhang et al. [2002] juga merujuk pada Sambrook et al. [1989] dan sebagai penanda kontrol digunakan (marker) pUC19/HinfI. Semua sam pel memberikan hasil amplifikasi fragmen DNA berukuran 294 pb gen tRNALeu mtDNA. Karakterisasi Templat mtDNA hasil PCR dengan ApaI Sebanyak 200 ng DNA hasil pemurnian selanjutnya dikarakterisasi dengan 15 unit enzim restriksi ApaI untuk mengetahui adanya mutasi A3243G mtDNA karena mempunya i Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

sisi pengenalan nukleotida GGGCCC. Dalam volume total 50 m L campuran templat mt DNA, enzim, bufer dan ddH2O diinkubasi pada suhu 370C selama overnight. Hasil inkubasi kemudian dianalisis kembali dengan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) dengan marker pUC19/HinfI. Hasil elektroforesis hasil pemotongan enzim restriksi ApaI terhadap 101 sampel menunjukkan 2 sampel mempunyai mutasi A3243G. Hal ini ditunj ukkan oleh adanya 3 pita hasil karakterisasi elektroforesis gel agarosa, 2 pita hasil pemotongan enzim restriksi ApaI, dan 1 pita utuh 294 pb (dapat ditunjukkan pada Gambar 2). Gambar 1Fragmen hasil PCR-RFLP. Karakterisasi hasil PCR-RFLP 7 sampel (lajur 2-8 ) dengan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) menggunakan penanda kontrol pUC/HinfI (lajur 1). Sampel pada lajur 5 menunjukkan adanya 3 pita yaitu fragmen utuh 294 pb , beriku t 2 pita 182 pb dan 112 pb dibawahnya yang diperkirakan merupakan hasil pemotongan enzim restriksi ApaI. Terpotongnya fragmen mtDNA 294 pb gen tRNALeu oleh enzim restriksi ApaI menjadi 2 fragmen 182 pb dan 112 pb menunjukkan adanya mutasi A3243G pada sampel tersebu t. Hal ini terjadi karena mutasi A3243G menyebabkan terbentuknya 6 nukleotida sisi peng enalan enzim restriksi ApaI pada urutan pasang basa 3242-3247, yaitu GGGCCC, sedangkan untuk subjek normal mempunyai urutan GAGCCC pada posisi tersebut. Masih adanya pita ut uh 294 pb pada sampel hasil PCR-RFLP yang terpotong oleh enzim restriksi ApaI menandaka n bahwa mutasi tersebut bersifat heteroplasmi, yang artinya dalam sel terdapat campuran antara mtDNA yang termutasi dan mtDNA yang normal. Rendahnya tingkat heteroplasmi untuk mutasi A3243G pada gen tRNALeu mtDNA pada penderita diabetes mellitus tipe 2 di dalam penelitian ini sama halnya deng an hasil yang Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

telah diteliti di berbagai negara, sedangkan apabila tingkat heteroplasmi yang t inggi biasanya menimbulkan fenotip untuk penyakit lain, yaitu MELAS (Mitochondrial Encephalomyophathy Lactic Acidosis and Stroke likes Episodes) atau komplikasi ke duanya [Urata et al., 1998]. Selanjutnya, untuk sampel yang positif terdapat mutasi heteroplasmi A3243G kemudian ditelusuri lebih lanjut mengenai data riwayat kesehatan dan silsilah ke luarganya. Hal ini dilakukan untuk mengamati gambaran klinis yang dimiliki oleh penderita D M tipe 2 di Indonesia yang mempunyai mutasi tersebut, MIDD sendiri ditandai oleh diabetes no n obesitas, tidak mengalami ketoasidosis, dan adanya gangguan pada indera pendenga ran (ketulian), serta untuk membuktikan bahwa mutasi heteroplasmi ini diwariskan sec ara maternal sehingga pada penelitian ini diharapkan dapat mendeteksi adanya mutasi heteroplasmi yang diwariskan ke generasi berikutnya melalui segaris keturunan ib u sehingga potensi mutasi tersebut dapat terdeteksi pada usia muda. Studi pola pewarisan maternal mutasi A3243G gen tRNALeu mtDNA Penyiapan templat mtDNA Sampel dalam penelitian ini diambil dari penderita diabetes melitus tipe 2 yang positif mutasi A3243G mtDNA pada penelitian tahun pertama yaitu sampel Yn sebagai genera si I dan sampel keturunannya berdasarkan segaris ibu yaitu anak perempuan (Gc) sebaga i generasi II dan cucu perempuan (Ch) sebagai generasi III. Gambar 2 Silsilah keluarga Yn. Sampel penelitian diambil dari sampel Yn sebagai generasi I dan keturunannya yang segaris ibu yaitu anak perempuannya (Gc) sebagai generasi II d an cucu perempuannya (Ch) sebagai generasi III. Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

Sampel yang digunakan sebagai templat mtDNA pada penelitian ini adalah sel limfo sit darah sampel Yn, Gc dan Ch dan sel epitel dari urin sampel Yn. Untuk mempelajari pola pewarisan maternal mutasi heteroplasmi A3243G mtDNA pada tiga generasi segaris keturunan ibu maka terlebih dahulu dilakukan analisis homologi daerah D-loop mtD NA sebagai pembuktian keturunan berdasarkan segaris keturunan ibu.. Hasil analisis homologi urutan nukleotida daerah D-loop mtDNA sampel Yn dan Ch menunjukkan tingkat homol ogi 100% sedangkan tingkat homologi daerah D-loop mtDNA antara sampel Yn dan At adal ah 96,6%. Gambar 3 Hasil analisis homologi sampel Yn, Ch dan At dengan urutan nukleotida A nderson (Cambridge) sebagai standar. Analisis homologi dilakukan dengan menggunakan prog ram Megalign DNASTAR. Tanda merah menandakan homologi 100%, tanda biru dan hijau menunjukkan varian. Analisis Mutasi A3243G mtDNA dengan metode PCR-RFLP Pada Tiga Generasi Segaris Keturunan Ibu Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

Pada penelitian ini dilakukan analisis mutasi A3243G mtDNA dengan metode PCRRFLP terhadap keturunan sampel Yn berdasarkan segaris keturunan Ibu yaitu anak peremp uan (Gc) sebagai generasi II dan cucu perempuan (Ch) sebagai generasi III dari sampe l Yn. Gambar 4 Elektroforegram hasil PCR-RFLP dari Generasi II dan III dari sampel Yn yang posi tif mutasi A3243G mtDNA pada penelitian sebelumnya. Karakterisasi hasil PCR-RFLP 2 sampel (lajur 2 dan 3) dengan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) menggunakan pe nanda kontrol pUC/Hinf1 (lajur 3). Sampel Gc dan Ch tidak menunjukkan adanya fragmen tambahan selain fragmen 294 pb. Dari hasil PCR-RFLP ini ternyata tidak terdeteksi mutasi A3243G mtDNA pada gener asi II dan III yang segaris keturunan ibu. Tidak terdeteksinya mutasi A3243G mtDNA p ada generasi II dan III ini disebabkan level heteroplasmi rendah dan metode PCR-RFLP tidak sensitif mutasi heteroplasmi tersebut. Urata et al. (2001) menyatakan identifika si mutasi A3243G dengan metode PCR-RFLP menggunakan enzim ApaI dan penandaan etidium bromida hanya mendeteksi level heteroplasmi 5-10% sedangkan diabetes melitus yan g disebabkan mutasi A3243G mtDNA memiliki level heteroplasmi 1-2%. White et al. (2 004) menyatakan bahwa limit deteksi PCR-RFLP fluoresens adalah hingga heteroplasmi 5% , sedangkan untuk metode PCR-RFLP dengan elektroforesis gel agarosa dan penandaan etidium bromida hanya dapat mendeteksi mutasi dengan sensitivitas hanya 20% dan konsiste n dengan penelitian lain yaitu Hancock et al. (2002). Faktor lain yang menyebabkan tidak terdeteksinya mutasi A3243G mtDNA pada generasi II dan III dikarenakan jaringan yang digunakan sebagai sumber templat untuk analisis mutasi bukan berasal dari jaringan yang terserang sehingga level heteroplasmi A3243G pun sangat rendah pada jaringan tersebut dan tidak ter deteksi dengan metode PCR-RFLP. Mutasi A3243G mtDNA bersifat heteroplasmi dan level Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

heteroplasmi tertinggi terdapat pada jaringan yang terserang. Oleh karena itu, s ampel uji yang paling baik adalah jaringan yang terserang Pada penyakit MIDD, jaringan yang ter serang dan memiliki mutation load A3243G mtDNA tertinggi adalah sel b -pankreas sedangkan j aringan ini bukan merupakan jaringan yang umum digunakan sebagai sampel untuk diagnosis. Sehingga permasalahannya adalah dibutuhkan suatu metode yang dapat mendeteksi mu tasi A324G mtDNA dengan tingkat heteroplasmi yang sangat rendah. Selain itu, tidak terdeteksinya mutasi A3243G mtDNA pada generasi II dan III disebabkan mutation load (level ambang kritis dari mtDNA mutan) pada sampel gene rasi II dan III belum terlampaui dimana sel belum mengekspresikan kerusakan rantai respi rasi mitokondria [Attardi et al., 1995]. Terdapat bukti bahwa ciri klinis pada penyak it mitokondria berkaitan dengan mutation load pada individu yang terserang [Chinnery et al., 19 97]. Oleh karena itu, perlu dikembangkan teknik analisis mutasi A3243G mtDNA dengan tingkat heteroplasmi sangat rendah yang dapat dijadikan sebagai metode diagnosis rutin sehingga dapat digunakan untuk mendiagnosis secara dini penyakit yang diakibatka n mutasi A34243G mtDNA. KESIMPULAN Dari hasil-hasil penelitian yang telah dilakukan hingga saat ini, maka dapat dit arik kesimpulan sebagai berikut: 1. Dengan teknologi PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi ApaI dan teknologi DNA rekombinan menunjukkan adanya mutasi heteroplasmi A3243G pada gen tRNALeu DNA mitokondria penderita diabetes mellitus tipe 2 di Indonesia dengan tingkat prevalensi 2%. 2. Metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi ApaI dengan penandaan EtBr dan karakterisasi dengan elektroforesis agarosa 2% tidak dapat mengidentifikasi muta si heteroplasmi A3243G pada gen tRNALeu DNA mitokondria dari dua generasi segaris keturunan ibu dari penderita diabetes melitus tipe 2 di Indonesia yang positif m utasi A3243G mtDNA. DAFTAR PUSTAKA Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

Anonymous. 2002. Konsensus pengelolaan diabetes melitus tipe 2 di indonesia 2002.PERKENI. Bandung Froguel, P., Hager, J. 1995. Human diabetes and obesity: tracking down the genes . Tibtech. 13: 52-55. Kadowaki, T., Kadowaki, H., Mori, Y., Tobe, K., Sakuta, R., Suzuki, Y., Tanabe, Y., Sakura, H., Awata, T., Goto, Y., Hayakawa, T., Matsuoka, K., Kawamori, R., Kamada, T., H orai, S., Nonaka, I., Hagura, R., Akanuma, Y., Yazaki, Y. 1994. A subtype of diabetes mell itus associated with a mutation of mitochondrial DNA. NEJM. 330: 962-968. Lee, H.C., Song, Y.D., Li, H., Park, J.O., Suh, H.C., Lee, E., Lim, S., Kim, K., Huh, K. 1997. Mitochondrial gene transfer ribonuclaic acid (tRNA)Leu(UUR) 3243 and tRNALys 834 4 mutations and diabetes mellitus in Korea. The Journal of Clinical Endocrinology & Metaboli sm. 82 (2): 372-374. Maksum, I.P. 2002. Tiga mutasi spesifik yang lestari daerah D-loop DNA mitokondr ia manusia indonesia pada tujuh generasi segaris keturunan ibu. Tesis. Bidang Studi Magister Kimia Program Pascasarjana ITB. Malecki, M., Klupa, T., Wanic, K., Frey, J., Cyganek, K., Sieradzki, J. 2001. Se arch for mitochondrial A3243G tRNALeu mutation in Polish patients with type 2 diabetes me llitus. Med Sci Monit. 7(2): 246-250. Ng, M.C., Lee, S.C., Ko, G.T.C., Li, J.K.Y., So, W.Y., Hashim, Y., Barnett, A.H. , Mackay, I.R., Critchley, J.A.J.H., Cockram, C.S., Chan, J.C.N. 2001. Familial early-onse t type 2 diabetes in China patients. Diabetes Care. 24: 663-671. Noer, A.S., Martasih, F., Mulyani, S., Muktiningsih, dan Wirahadikusumah, M.1994 . Analisis variasi urutan nukleotida D-loop mtDNA manusia dari beberapa daerah di Indonesia , Proc. 1st joint seminar on chemistry UKM-ITB, Malaysia. Ohkubo, K., Yamano, A., Nagashima, M., Mori, Y., Anzai, K., Akehi, Y., Nomiyama, R., Asano, T., Urae, A., Ono, J. 2001. Mitochondrial gene mutations in the tRNALeu(U UR) region and diabetes: prevalence and clinical phenotypes in Japan. Clinical Chemistry. 4 7: 1641-1648. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, vol. 1,2,3,. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York tHart, L.M., Lemkes, H.H., Heine, R.J., et al. 1994. Prevalence of maternally inh

erited diabetes and deafness in diabetic population in the Netherlands. Diabetologia. 3 7: 1169-70. Thorpe, N.D. 1984. Cell biology. John Wiley & Sons Inc. New York Urata, M., Waki yama, M., Iwase, M., Yoneda, M., Kinoshita, S., Hamasaki, N., Kang, D. 1998. New sensi tive method for the detection of the A3243G mutation of human mitochondrial deoxyribo nucleic Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP

acid in diabetes mellitus patients by ligation mediated polymerse chain reaction . Clinical Chemistry. 44 : 2088-2093. Zhang yong, Li Jianfeng, Wang fengyan. 2001. The study of A3243G and G13513A mitochondrial DNA pointmutation in patients with cerebral infartion, Chin Med J. , 114 (10): 129-135. Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP