Fira Widyananda Aslama

412118046
D4 TLM

Deteksi Molekuler Ekson 2 Gen Beta Globin pada Pasien Beta Talasemia Mayor
Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) Single Strand Conformation
Polimorfism (SSCP)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA
secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1984.
Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali
hanya dalam beberapa jam.
Pada PCR terjadi amplifikasi atau penggandaan sekuen DNA yang diinginkan
berdasarkan pemilihan primer untuk reaksi. Penggandaan DNA secara alami terjadi pada
organisme melalui proses replikasi DNA dengan DNA helikase berperan dalam membuka pita
ganda DNA sehingga DNA polimerase dapat memulai penggandaan. Pada PCR peran DNA
helikase digantikan dengan menaikkan suhu ketika reaksi sehingga DNA terdenaturasi dan
terbentuk untai tunggal DNA, kemudian titik untuk memulai polimerasi ditentukan oleh primer
yang spesifik yang melekat pada untai tunggal dan kemudian oleh DNA polimerase penggandaan
sekuen DNA target terjadi. PCR memerlukan enzim polimerasi DNA yang tahan terhadap panas
(thermostable) contohnya Taq Polymerase (Bustin, 2010).
Polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism (PCR - SSCP) telah
dikembangkan untuk mendeteksi mutasi pada banyak kasus, baik pada manusia maupun hewan.
Deteksi menggunakan PCR-SSCP dapat melihat perubahan satu sekuens basa nukleotida melalui
migrasi pita DNA pada elektroforesis dengan gel poliakrilamid. PCR-SSCP selain dapat sensitif
mendeteksi adanya mutasi pada DNA, juga tidak menggunakan unsur radioaktif dan mudah
untuk diaplikasikan. Oleh karena itu dalam penelitian ini digunakan metode PCR-SSCP sebagai
uji konfirmasi (conformatory test) dari data pemeriksaan darah yang telah dilaksanakan.
Thalassemia

Talasemia merupakan kelainan genetik yang disebabkan adanya mutasi gen penyandi
rantai globin, yaitu gen HBA yang menyandi α globin atau gen HBB yang menyandi β globin
(Galanello dan Origa, 2010). Talasemia disebabkan oleh penurunan kecepatan sintesis atau
kemampuan produksi satu atau lebih rantai globin α dan β. Hal ini terjadi karena delesi total atau
parsial, substitusi, atau insersi nukleotida gen globin. Pada Talasemia terjadi perubahan
nukleotida ke 59 secara transisi (T menjadi C) dan nukleotida ke 147 secara transversi (G
menjadi C).
Beta talassemia adalah kelainan darah herediter yang ditandai dengan berkurangnya
kadar haemoglobin akibat sintesis rantai globin yang tidak seimbang. β-talasemia minor
membawa gen heterozigot. Pasien β-talasemia mayor mengalami kerusakan pada β-glogin
disebabkan karena adanya mutasi di gen β globin yang terletak pada kromosom nomor 11. Gen
β-globin memiliki tiga buah ekson yaitu ekson 1, ekson 2, dan ekson 3, pada ekson 2
mempunyai ukuran terbesar pada gen ini. Mutasi yang umumnya berupa substitusi, insersi atau
delesi, dapat terjadi pada ketiga ekson tersebut.

Aplikasi PCR
1. Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan berdasarkan instruksi kit isolasi gSYNC DNA Extraction Kit
(Blood Protocol Prosedur) dengan modifikasi, yang meliputi tahap lisis sel, pengikatan
DNA pada kolom silica gel, pencucian, dan elusi DNA. Hasil isolasi DNA diuji kualitatif
dengan elektroforesis gel agarosa 0,8 % dalam TBE 1× 100 Volt selama 30 menit. Hasil
elektroforesis direndam dalam ethidium bromide 30 menit dan dilihat dengan UV
transiluminator.
2. Amplifikasi Ekson 2 Gen β-Globin
Hasil isolasi DNA digunakan sebagai cetakan pada proses amplifikasi dengan
metode polymerase chain reaction (PCR). Amplifikasi daerah ekson 2 gen β-globin
dilakukan pada mesin thermocycler (Eppendorf Mastercycler Personal) dengan
menggunakan PCR kit KAPA 2GTM Fast Ready Mix yang ditambahkan primer dan cetakan
DNA.

Kondisi siklus PCR yang digunakan untuk amplifikasi gen β-globin adalah sebagai berikut:
(Priyambodo, 2014)

Hasil amplifikasi ekson 2 gen β-globin diuji kualitatif dengan elektroforesis gel
agarosa 1% dalam TBE 1× 50 Volt 45 menit. Hasil elektroforesis direndam dalam ethidium
bromide 30 menit dan dilihat dengan UV transiluminator.
3. PCR-SSCP
Analisis polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-
SSCP) dilakukan berdasarkan metode Priyambodo (2014) dengan modifikasi. Sebanyak 10
μl produk PCR ditambah dengan 15 μl loading buffer (campuran bromo phenol blue,
formamide, EDTA, gliserol) diinkubasi dalam waterbath 950C selama 10 menit, kemudian
secepatnya dimasukkan dalam freezer -200C selama 10 menit. Sebanyak 25 μl campuran
produk PCR dan loading buffer dimasukkan dalam sumuran gel poliakrilamid
(acrylamide:bis-acrylamide 29:1). Elektroforesis dilakukan pada 100 Volt, 50 mA selama
100 menit dalam TBE 0,5X. Visualisasi hasil PCR-SSCP dilakukan dengan pewarnaan
etidium bromida yang diamati dengan UV transluminator.

Interpretasi data dilakukan dengan mendeskripsikan pita hasil SSCP dengan

membandingkan perbedaan jarak migrasi pita (Single strand DNA) subyek yang diteliti
dengan individu normal. Individu yang memiliki genotip homozigot, baik homozigot
dominan maupun resesif menunjukkan dua pita DNA pada gel, sedangkan individu
heterozigot menunjukan tiga atau empat pita DNA.
 Indikasi adanya mutasi pada sekuen region II gen beta globin diketahui dengan
melihat adanya pola pita yang berbeda dengan kontrol negative (sampel N). Berdasarkan
pada region II, terdapat dua sampel yang berdasarkan analisis SSCP tidak ada indikasi
mutase (sampel 5 dan 9) sedangkan pada 7 sampel sisanya ada indikasi dan perlu dilakukan
konfirmasi dengan sekuensing DNA. Adapun konfirmasi dengan sekuensing DNA yang
dimaksud disini adalah untuk mengetahui tepatnya mutasi apa yang terjadi pada region
tersebut sehingga terbentuk pola yang berbeda dengan kontrol negatif. Sekuensing dilakukan
terhadap fragmen gen beta globin yang menunjukkan pita ganda DNA pada hasil PCR-
SSCP.

DAFTAR PUSTAKA

Elfahmi, Indrayati, A., Yahya, F. (2017). Deteksi Molekuler Ekson 2 Gen Beta Globin pada
Pasien Beta Talasemia Mayor di RSUD DR. Soeroto Ngawi menggunakan Metode
Polymerase Chain Reaction- Single Strand Conformation Polimorfism (PCR-SSCP).(15)
(1).Jurnal Farmasi Indonesia. Tersedia online:
http://setiabudi.ac.id/ejurnal/index.php/farmasi-indonesia
Yahya, F. (2018).Deteksi Mutasi Sekuen Ekson 2 Gen Beta Globin Pada Pasien Talasemia Beta
Mayor Dengan Metode Polymerase Chain Reaction Singgle Strand Conformation
Polymorphism. Surakarta: Univeritas Setia Budi
H, Niken Satuti Nur., Purwanto, R. (2015). CD35 (DEL C) frameshift mutation in exon 2 of β-
globin gene on β-thalassemia carriers.(1)(1).Yogyakarta : Biomedical Engineering.