TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

• Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme

berbeda: fenomena umum di alam.
• Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus
 menghasilkan toksin yang bertanggung jawab
terhadap gejala difteri.
• Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh
virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam
alam.
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

• Duplikasi fenomena alam di laboratorium

• Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi
genetik ke dalam suatu organisme.
• Manipulasi genetik
E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri)
Saccharomyces cerevisiae (ragi)
• Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara
tradisional.
 CONTOH PRODUK REKOMBINAN

– ANTIBODI REKOMBINAN
– PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum
manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator
plasminogen jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah,
limfokin, faktor nekrosis tumor, dismutase superoksida, dan
gonadotropin manusia
– VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria
– VAKSIN DNA
– TERAPI GEN
 CONTOH PRODUK REKOMBINAN

– PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit,

resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen

– PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak,

penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)

• PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex:

PLASMID)
• LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN
VEKTOR (= VEKTOR REKOMBINAN)
• TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE
SEL INANG
& PERBANYAKAN DNA
• SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/
VEKTOR REKOMBINAN
• DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN,
KEBENARAN DNA SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN
NUKLEOTIDA)

1972 Stanley Cohen dan

Herbert Boyer
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)
DNA
kromosom
DNA
Potong dengan enzim restriksi
plasmid

ligasi
DNA rekombinan

transformasi sel

transforman
1 sel tumbuh jadi 1 koloni

klon
Kloning DNA ke Plasmid
 SUMBER DNA SISIPAN

• TIGA PENDEKATAN:
– KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA
GENOMIK
– PRODUK PCR
– mRNA cDNA (eukariot)
 Kepustakaan genomik (genomic library)

• Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup

semua gen dari suatu organisme
• Contoh ukuran genom:
– Bacillus anthracis: 5,1 – 5,2 Megabasa
– Escherichia coli: 4 Megabasa
– Pseudomonas putida: 6,0 – 6,1 Megabasa
– Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa
KROMOSOM vs PLASMID
 PLASMID

• DNA UNTAI GANDA

• BERBENTUK LINGKARAN
• BERSALINAN TINGGI
• BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI)
• DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL
• DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN)
• ADA DUA GEN MARKER:
– UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR
– UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN
 VEKTOR (Plasmid)

• VEKTOR KLONING
HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA

• VEKTOR EKSPRESI
UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahan
komponen untuk mempermudah proses “downstream”/pemurnian)
 Beberapa contoh vektor kloning

Nama Tipe Sel inang Keterangan

pBR322 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin.
Vektor untuk tujuan umum
pUC8 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining
lac. Vektor untuk tujuan umum
pBluescript Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining
lac.
gt10 Bakteriofaga E. coli Kloning cDNA

YEp24 Plasmid E. coli/ragi Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle

PETA PLASMID
 ENZIM RESTRIKSI

• MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA

INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI
• TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA
REKOMBINAN
• MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE
• MENGENALI URUTAN PALINDROM
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
 ENZIM RESTRIKSI & LIGASE
DNA (enzim restriksi) DNA (ligase)
5’- NNNGAATTCNNN -3’ 5’- NNNGOH AATTCNNN -3’
P

3’- NNNCTTAAGNNN -5’

3’- NNNCTTAAP OHGNNN -5’

EcoRI
ligase
5’- NNNGOH PAATTCNNN -3’ 5’- NNNGAATTCNNN -3’
3’- NNNCTTAA P OH GNNN -5’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’

•Sisi pengenalan enzim restriksi

•Urutan nukleotida rantai atas =
Urutan nukleotida rantai bawah
 CONTOH ENZIM RESTRIKSI
• EcoRI (Escherichia coli galur R): GAATTC (ujung lancip)
• BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): GGATCC (ujung
lancip)
• BglII (Bacillus globigii): AGATCT (ujung lancip)
• SalI (Streptomyces albus): GTCGAC (ujung lancip)
• PstI (Providencia stuartii 164): CTGCAG (ujung lancip)
• HindIII (Haemophilus influenzae): AAGCTT (ujung lancip)
• KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTACC (ujung lancip)
• XbaI (Xanthomonas bradii): TCTAGA (ujung lancip)
• HaeIII (Hemophilus aegyptius): GGCC (ujung tumpul)
 Kloning Produk PCR

PCR Ligasi

S. pyogenes M12 Gen ska pGEMT

rekombinan

SDM

Transformasi

E. coli XL- pGEMT/ska

Blue
 LIGASI PRODUK PCR KE pGEM-T
ligasi Transformasi
A A +

Gen ska
pGEM-T pGEM-T E. coli JM109
REKOMBINAN

Streptococcus pyogenes

Kontrol – Kontrol + E. coli pGEM-T REK

LB/Amp LB/Amp LB/Amp/X-Gal/IPTG
SekolahSekolah FarmasiFarmasi ITBITB BioteknologiBioteknologi FFaarmasirmasi--FAFA 42024202
 Transformasi

• info genetik ditransfer ke sel inang dengan

metode transformasi
• Sel inang dibuat kompeten (siap menerima
“DNA asing”)  modifikasi struktur dinding sel
• Metode transformasi : heat shock/elektroporasi
 Seleksi Transforman

Sel kompeten

Transformasi

Seleksi Biru-Putih
 SELEKSI BIRU PUTIH

• MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA?

• PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE
GALAKTOSIDASE)
• X-GAL  BIRU
• DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ 
GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI 
X-GAL TIDAK DIURAIKAN  PUTIH
 Deteksi keberadaan DNA sisipan

• Analisis migrasi
• Analisis restriksi Elektroforesis gel
• PCR
• Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)
 ELEKTROFORESIS GEL

• Gel agarosa atau poliakrilamid

• DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat):
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif
• DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya:
migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar
• Visualisasi:
– etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi
dengan pemaparan UV)
 Elektroforesis Gel Agarosa

Joe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNA
 KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN

1 2
Isolasi pGEM-T/ska
(kit Qiaprep, Qiagene)

Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan < 1 = pGEM-T rekombinan

ukuran plasmid dengan DNA sisipan 2 = pGEM-T tanpa DNA sisipan
 KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN

Isolasi Plasmid Rekombinan Analisis Restriksi pGEM-T

rekombinan
1 2 3 1 2

Koloni Putih
Koloni pGEM-T (3000 bp)
Koloni Biru
Biru
1419 pb
881 pb
517 pb DNA sisipan

Elektrogram hasil isolasi plasmid

koloni biru dan putih :
1. Koloni biru
2. Koloni putih
3. Koloni biru Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI
1. Marka pUC19/HinfI
2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI
HASIL PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA
DNA SISIPAN (DNA Sequencing)
 HASIL SEKUENSING

Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal

(Analisis homologi/kesamaan – program BLAST dari NCBI)