LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

PERCOBAAN 6

PCR DAN ELEKTROFORESIS DNA

PRODUK TERTENTU

Disusun oleh

Nama : Hilda Khairunnisa

NIM : K100190122

Kelas :H

Kelompok : H3

Korektor : Dwi Asih Lestari

Laboratorium Biologi Molekuler

Fakultas Farmasi
Universitas Muhammadiyah Surakarta
Semester Genap 2020/2021
 PCR DAN ELEKTROFORESIS DNA PRODUK TERTENTU

I. Tujuan
Praktikan mampu memahami dan melakukan teknik PCR dan menganalisis
hasil PCR.

II. Dasar teori

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik biologi molekuler untuk
mengamplifikasi sekuen DNA spesifik menjadi ribuan sampai jutaan copy sekuen
DNA. Prinsip dasar PCR adalah sekuen DNA spesifik diamplifikasi menjadi dua copy
kelanjutnya menjadi empat copy dan seterusnya. Pelipatgandaan ini membutuhkan
enzim spesifik yang dikenal dengan polimerase. Polimerase adalah enzim yang
mampu menggabungkan DNA cetakan tunggal, membentuk untaian molekul DNA
yang panjang. Enzim ini membutuhkan primer serta DNA cetakan seperti nukleotida
yang terdiri dari empat basa yaitu Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) dan
Guanine (G).
(Gibbs, 1990)
Target PCR yaitu asam nukleat (DNA) untai ganda yang tidak diekstraksi dari
sel dan terdenaturasi menjadi asam nukleat berantai tunggal. Proses ini terjadi pada
mesin PCR meliputi tiga tahap utama yaitu pemisahan untai ganda DNA (Denaturasi),
penempelan primer (annealing) dan pemanjangan primer (ekstensi). Proses yang
dimulai dari denaturasi, penempelan dan esktensi disebut sebagai satu siklus. Produk
PCR dapat berlangsung melalui proses elektroforesis dan digunakan untuk analisis
lebih lanjut. Produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis gel yang diwarnai dengan
etidium bromida dan divisualisasikan dengan sinar ultraviolet.
(W.Widiwati Esti,2013)
Reaksi PCR (amplifikasi) dimulai dengan melakukan denaturasi DNA cetakan
yang berantai ganda menjadi rantai tunggal, kemudian suhu diturunkan sehingga
primer akan menempel (annealing) pada DNA cetakan yang berantai tunggal. Setelah
proses annealing, suhu dinaikkan kembali sehingga enzim polimerase melakukan
proses polimerase rantai DNA yang baru. Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya
sebagai cetakan bagi reaksi polimerase berikutnya
(Yuwono 2006)
Rancangan suatu primer merupakan salah satu parameter penentu
keberhasilan suatu proses PCR. Primer befungsi sebagai pembatas fragmen DNA
target yang akan diamplikasi sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) yang
diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Rancangan primer yang kurang baik
menyebabkan reaksi PCR tidak bekerja dengan baik sehingga menyebabkan produk
PCR yang tidak spesifik dan atau terbentuknya primer dimer. Perancangan atau
desain primer bertujuan untuk memperoleh primer yang dapat digunakan dalam
amplikasi DNA dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR).
(Diss, 2003)
III. Alat dan bahan
Alat :
1. Mikropipet
2. Blue tip
3. Tip box
4. PCR tube
5. Tempat sampah
6. Thermal Cycler
Bahan :
1. Air
2. PCR Buffer (Tris-HCl dan KCl)
3. DNTPs
4. Magnesium klorida (MgCl2)
5. DNA template
6. Forward primer
7. Reverse primer
8. DNA polimerase

IV. Cara kerja

Mendesain Primer
Dibuat desai primer forward dan reverse dari 5’ -> 3’.
Mengatur PCR
Diambil air dengan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung PCR yang
sangan kecil dan memiliki lapisan plastik tipis untuk memungkinkannya mengubah
suhu dengan cepat.

Distabilkan pH antara 8,3-9 dengan ditambahkan Buffer PCR yang mengandung

Tris-HCL dan KCl sebanyak 2µL ke dalam 20 L reaksi (Buffer berada pada
konsentrasi 10x dan volum akhirnya dalam reaksi harus 1x).

Ditambahkan DNTP dan MgCl2.

Ditambahkan DNA template sebanyak 1 ng.

Ditambahkan primer forward dan reverse secara terpisah dengan konsentrasi

akhir 1 mikromolar.

Ditambahkan DNA polimerase.

 Dicampur semua sampel yang telah ditambahkan.
Menulis program PCR ke dalam Thermo Cycler
Denaturasi awal : Diatur suhu pada 950C selama 5 menit.

Denaturasi siklus : Diatur suhu pada 950C selama 30 detik.

Anneling : Diatur suhu pada 680C selama 30 detik. Dihitung suhu dengan
menggunakan rata-rata TM dari masing-masing primer.

Ekstensi : Diatur suhu pada 720C selama 30 detik.

Final Ekstensi : Diatur suhu pada 720C selama 7 menit.

Run Samples
Ditempatkan tabung PCR ke bagian tengah thermo cycler.Ditutup dan
dikencangkan, lalu klik run.
V. Hasil percobaan
Keterangan: 1 2 3 4 5 6 7 8
1 : Marker 1kb ladder 2% TAE agarose

2 : Kontrol positif (Porcine DNA)

3 : Kontrol negative (Nuclease free water)

4 : Sample daging segar

5 : Sample bakso

6 : Sample sosis

Hasil Restriction Mapping

1. Suatu DNA erukuran 19 kb, dipotong dengan enzim A dan B. Bagaiman pola
restriksinya jika dipotong dengan kedua enzim tersebut?

Jawab :
2 kb 8 kb 9 kb
A A

5 kb 14 kb
B

2 kb 3 kb 5 kb 9 kb
A B A

A B A

0 kb 2 kb 5 kb 10 kb 19 kb
 2. Suatu DNA erukuran 5 kb, dipotong dengan enzim A dan B. Bagaiman pola
restriksinya jika dipotong dengan kedua enzim tersebut?

Jawab :

1000 2100 1400 500

A
1200 2500 1300
B
A B A B A
Map
1000 200 1900 600 800 500

3. Suatu DNA erukuran 5,5 kb, dipotong dengan enzim A dan B. Bagaiman pola
restriksinya jika dipotong dengan kedua enzim tersebut?

Jawab :
Eco RI Eco RI
kb
1.9 1.4 2.2

Bam HI Bam HI
kb
3.0 1.5 1.0

Eco RI Bam HI Eco RI Bam HI

Kb
1.9 1.1 0.3 1.2 1.0
VI. Pembahasan
Tujuan dari percobaan kali ini adalah untuk melakukan PCR dan menganalisis
hasilnya serta menentukan hasil dari restriction mapping. Polymerase Chain Reaction
(PCR) adalah teknologi dalam bidang biologi molekuler yang digunakan untuk
memperbanyak salinan sepotong DNA di bagian tertentu sehingga menghasilkan
ribuan hingga jutaan salinan dari urutan DNA tertentu. PCR dapat digunakan dalam
ilmu forensik, DNA sequencing, dan diagnosa penyakit genetik. Komponen-komponen
yang diperlukan pada proses PCR adalah template DNA; sepasang primer, yaitu
sekuen oligonukleotida pendek biasanya tersusun atas 20 pasang basa yang
berfungsi sebagai pemula sintesis rantai DNA dalam reaksi PCR; dNTPs
(Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim
polimerase DNA. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi
DNA template; (2) denaturasi DNA template; (3) penempelan primer pada template
(annealing); (4) pemanjangan primer (extension/elongation) dan (5) pemantapan
(post-extension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus),
di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA.
Pada siklus pertama, DNA cetakan dipisahkan menjadi dua untai tunggal
dengan pemanasan 95°C di dalam campuran yang mengandung oligonukleotida
primer dengan jumlah berlebih serta keempat dNTP. Suhu ini kemudian dikurangi
menjadi 55°C, untuk memberi kesempatan primer menempel (anneal) pada sekuen
target. Primer akan membentuk ikatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen
yang komplementer dengan sekuen primer. Sedangkan, suhu yang diperlukan pada
tahap berulang adalah 95°C. Pada langkah ini heliks ganda DNA terurai menjadi dua
untai cetakan template DNA tunggal. Selanjutnya, tahap annealing pada suhu 68°C.
Pada langkah ini terjadi proses penempelan primer cetakan DNA, suhu annealing
ditentukan oleh susunan primer. Tahap ekstensi dilakukan pada suhu 72°C. Pada
langkah ini terjadi proses polimerisasi untuk pembentukan DNA baru. Waktu yang
dibutuhkan tergantung panjang pendeknya ukuran DNA baru sebagai produk
amplifikasi. Masing-masing ketiga tahapan tersebut memerlukan waktu selama 30
detik dilakukan berulang selama 34 menit.
Dalam prosedur PCR pertama dipipet aquades dalam volume kecil agar suhu
dapat berubah dengan cepat, kemudian PCR buffer konsentrasi 10x Tris HCl dan KCl
untuk menstabilkan pH antara 8,3 dan 9. Selanjutnya ditambahkan dNTP yang
berfungsi sebagai building blocks DNA untuk DNA polimerase mensintetis untai DNA,
setelah itu ditambahkan magnesium klorida sebagai penstabil DNA dan menstabilkan
interaksi dengan DNA polimerase dan DNA template sebagai cetakan untuk
pembentukan molekul DNA baru yang sama. Kemudian ditambah primer yaitu
forward primer dan reverse primer dan ditambah DNA polymerase. Setelah seluruh
bahan sudah ditambahkan dan dicampur hingga homogen, diatur suhu dengan alat
thermo cycler pada waktu tertentu sesuai dengan tahapan PCR yang sudah
dijelaskan sebelumnya.
Hasil PCR akan dianalisis menggunakan elektroforesis DNA gel. Elektroforesis
adalah teknik yang paling umum digunakan untuk memvisualisasikan hasil PCR atau
amplikon. Dari hasil elektroforesis DNA dapat dilihat migrasi elektroforesis DNA
melalui gel dipengaruhi oleh faktor ukuran dan konfirmasi molekul DNA, konsentrasi
 agarosa, arus listrik, dan temperatur. Dalam percobaan kali ini, dilakukan identifikasi
terhadap 6 sampel yang dengan elektroforesis, yaitu (1) marker 1kb ladder 2% TAE
Agarose, (2) kontrol positif (Porcine DNA), (3) kontrol negatif (Nuclease free water),
(4) sampel daging segar, (5) sampel bakso, dan (6) sampel sosis. Setelah sampel
dikumpulkan dan dihaluskan, dilakukan ekstraksi DNA pada masing-masing sampel.
Sampel DNA yang didapat kemudian dilakukan amplifikasi PCR. Produk PCR
divisualisasikan dengan elektroforesis gel. Jika positif terdapat DNA porcine, pita DNA
akan terbentuk. Hasilnya pada sampel nomer 2 kontrol positif terdapat pita kuning,
sedangkan pada nomor 5 (bakso), 4 (daging) dan 6 (sosis) tidak terdapat bercak pita
kuning berarti sampel tersebut tidak mengandung daging babi. Pada sampel 3 berisi
nuclease free water, yang merupakan kontrol negatif sehingga tidak ditemukan pita
DNA.
Restriction mapping adalah metode yang digunakan untuk memetakan segmen
DNA yang tidak diketahui dengan memecahnya menjadi beberapa bagian dan
kemudian mengidentifikasi lokasi breakpoints. Metode ini bergantung pada
penggunaan protein yang disebut enzim restriksi, yang dapat memotong atau
mendigesti molekul DNA pada urutan spesifik yang disebut situs restriksi. Setelah
segmen DNA di digesti menggunakan enzim restriksi, fragmen yang dihasilkan dapat
diperiksa menggunakan metode laboratorium yang disebut elektroforesis gel, yang
digunakan untuk memisahkan potongan DNA menurut ukurannya. Setelah digesti,
fragmen DNA dipisahkan dalam gel agarosa menggunakan Gel Electrophoresis.
Didapatkan hasil enzim A dan enzim B menghasilkan gabungan potongan berada di
ukuran 2 kb, 5 kb, 10 kb, dan 19 kb, hasil perpotongan mapping pada enzim A dan B
bisa dilihat dengan cara menutup salah satu hasil perpotongan, gabungan enzim A
dan B menghasilkan perpotongan pada 1000 kb, 200 kb, 1900 kb, 600 kb, 800 kb,
dan 500 kb, dan hasil perpotongan mapping EcoRI dan BamHI menghasilkan
gabungan perpotongan pada 1,9 kb; 1,1 kb; 0,3 kb; 1,2 kb; dan 1,0 kb.

VII. Kesimpulan
1. Hasil PCR dianalisis menggunakan elektroforesis DNA gel.
2. Dari hasil elektroforesis DNA dapat dilihat migrasi elektroforesis DNA melalui gel
dipengaruhi oleh faktor ukuran dan konfirmasi molekul DNA, konsentrasi agarosa,
arus listrik, dan temperatur.
3. Sampel daging segar, bakso, dan sosis. Ketiga sampel tersebut tidak terdapat pita
kuning, yang menunjukkan bahwa sampel tidak mengandung porcine.
4. Dalam Denaturation, Annealing, Extension, waktu yang dibutuhkan dalam
percobaan adalah 30 detik.
5. Restriction mapping digunakan untuk memetakan segmen DNA yang tidak
diketahui dengan memecahnya menjadi beberapa bagian dan kemudian
mengidentifikasi lokasi breakpoints, Sehingga masing-masing lokasi breakpoints
dapat diketahui.
VIII. Lampiran Lembar Hasil
Polymerase Chain Reaction

1. Instruksi: silakan menonton Video mengenai PCR jawab pertanyaan di bawah ini
a. Sebutkan alat dan bahan yang digunakan untuk PCR di dalam video tersebut!
Jawab:
Alat :
1) Mikropipet
2) Blue tip
3) PCR tube
4) Tempat pembuangan
5) Thermal cycler
Bahan :
1) Air
2) Buffer (Tris-HCL dan KCl)
3) DNTP
4) MgCl2
5) DNA polimerase
6) DNA template
7) Primer (forward dan reverse)

b. Apa fungsi dari masing-masing bahan yang digunakan untuk PCR di dalam video
tersebut
Jawab :
1) Air : Membilas/mencuci tabung PCR
2) Buffer : Menstabilkan pH antara 8,3-9
3) DNTP : DNA building blok dan bersama DNA polimerase yang
akan mensintesis
4) MgCl2 : Penstabil tulang punggung DNA dan penstabil interaksi
dengan DNA polimerase
5) DNA polimerase : Menyintesis DNA
6) DNA template : Cetakan untuk membentuk DNA yang sama
7) Primer : Pembatas fragmen DNA yang akan diamplifikasi dan
menyediakan gugus -OH pada ujung 3’.
c. Buatlah cara kerja skematis dari PCR
Jawab:
Mendesain Primer
Dibuat desai primer forward dan reverse dari 5’ -> 3’.

Mengatur PCR
Diambil air dengan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung PCR yang
sangan kecil dan memiliki lapisan plastik tipis untuk memungkinkannya mengubah
suhu dengan cepat.

Distabilkan pH antara 8,3-9 dengan ditambahkan Buffer PCR yang mengandung

Tris-HCL dan KCl sebanyak 2µL ke dalam 20 L reaksi (Buffer berada pada
konsentrasi 10x dan volum akhirnya dalam reaksi harus 1x).

Ditambahkan DNTP dan MgCl2.

Ditambahkan DNA template sebanyak 1 ng.

Ditambahkan primer forward dan reverse secara terpisah dengan konsentrasi

akhir 1 mikromolar.

Ditambahkan DNA polimerase.

Dicampur semua sampel yang telah ditambahkan.

Menulis program PCR ke dalam Thermo Cycler

Denaturasi awal : Diatur suhu pada 950C selama 5 menit.

Denaturasi siklus : Diatur suhu pada 950C selama 30 detik.

Anneling : Diatur suhu pada 680C selama 30 detik. Dihitung suhu dengan
menggunakan rata-rata TM dari masing-masing primer.

Ekstensi : Diatur suhu pada 720C selama 30 detik.

 Final Ekstensi : Diatur suhu pada 720C selama 7 menit.

Run Samples
Ditempatkan tabung PCR ke bagian tengah thermo cycler.Ditutup dan
dikencangkan, lalu klik run.
2. Simulasi hasil:
Identifikasi kandungan daging babi (porcine) dalam beberapa produk olahan
dengan menggunakan metode PCR.
Sampel:
1. Daging segar
2. Bakso
3. Sosis

Pengumpulan sampel → sampel Ekstraksi DNA pada masing-

dihaluskan masing sampel → mendapat
sampel DNA

Produk PCR divisualisasikan dengan

elektroforesis gel, jika positif terdapar DNA
porcine akan pita DNA akan terbentuk Amplifikasi PCR

No Keterangan
1 Marker 1kb ladder 2% TAE Agarose
2 Kontrol positif (Porcine DNA)
3 Kontrol negatif (Nuclease free water)
4 Sampel daging segar
5 Sampel bakso
6 Sampel sosis
 1 2 3 4 5 6

Berikan kesimpulan anda terhadap simulasi hasil di atas.

Jawab:
Dari hasil simusi, dapat disimpulkan bahwa daging segar, bakso, dan sosis tidak
mengandung daging babi.

*Simulasi hasil pada nomor 2 menjadi hasil anda dan dibahas di laporan resmi.
 Restriction Mapping

Instruksi: Carilah peta restriksi dari DNA di bawah ini, lakukan secara berkelompok!
1. Suatu DNA erukuran 19 kb, dipotong dengan enzim A dan B. Bagaiman pola
restriksinya jika dipotong dengan kedua enzim tersebut?

Jawab :
2 kb 8 kb 9 kb
A A

5 kb 14 kb
B

2 kb 3 kb 5 kb 9 kb
A B A

A B A

0 kb 2 kb 5 kb 10 kb 19 kb
2. Suatu DNA erukuran 5 kb, dipotong dengan enzim A dan B. Bagaiman pola
restriksinya jika dipotong dengan kedua enzim tersebut?

Jawab :

1000 2100 1400 500

A
1200 2500 1300
B
A B A B A
Map
1000 200 1900 600 800 500

3. Suatu DNA erukuran 5,5 kb, dipotong dengan enzim A dan B. Bagaiman pola
restriksinya jika dipotong dengan kedua enzim tersebut?

Jawab :
Eco RI Eco RI
kb
1.9 1.4 2.2

Bam HI Bam HI
kb
3.0 1.5 1.0

Eco RI Bam HI Eco RI Bam HI

Kb
1.9 1.1 0.3 1.2 1.0
IX. Daftar pustaka
Diss, T. 2003. The Polymerase Chain Reaction Molecular Biology in Cellular
Pathology. United Kingdom: John Willey and Sons, Ltd.
Gibbs, R. A. 1990. DNA Amplification by the Polymerase Chain Reaction. Anal. Chem.
62. 1202-1214.
W.Widiwati, Esti.2013. Desain Primer Sitokrom B (cyt b) Sebagai Salah Satu
Komponen PCR (polymerase Chain Reaction) Untuk Deteks DNA Babi
Yogyakarta : Lembaga Peelitian UIN Sunan Kalijaga Yogyakarta.
Yuwono dan Tribowo, 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction, Panduan
Eksperimen PCR untuk Memecahkan Masalah Biologi Terkini. Yogyakarta:
Andi.

Surakarta, 28 Juni 2021

Praktikan

Hilda Khairunnisa