LAPORAN PRAKTIKUM

FISIOLOGI TUMBUHAN

Reverse Transcription PCR (RT-

PCR)

OLEH:

Nama : Yolla Fristia

NIM : 19032108

Kelas : Biologi D

Dosen Pembimbing : Afifatul Achyar S.Si M.Si

Asisten Dosen : 1. Masnaini Siregar
2. Ruri Fitriyani

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN

ALAM UNIVERSITAS NEGERI PADANG

2021
 PRAKTIKUM 10

Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

A. Tujuan Praktikum

1. Praktikan memahami prinsip dogma central biologi

2. Praktikan memahami prinsip dan langkah kerja RT-PCR

B. Hari/ Tanggal

Hari / Tanggal : Jumat / 21 Oktober 2021

Pukul : 09.41 – 12.20 WIB

Tempat : Sungai Cubadak, Kec. Baso, Kab. Agam, Sumatera Barat

C. Teori Dasar

Memiliki DNA di organela mitokondria. DNA mitokondria ini walau jumlahnya sangat
sedikit tapi penting sekali dalam fungsi sel, sekaligus menyimpan “rahasia” asal-usul manusia
yang akan dijelaskan nanti. (Eugene V. Koonin.2015).

Polymerase Chain Reaction adalah teknik biologi molekuler untuk mengamplifikasi

sekuen DNA spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi sekuen DNA. Teknik ini
menggunakan metode enzimatis yang diperantarai primer. Prinsip dasar PCR adalah sekuen
DNA spesifik diamplifikasi menjadi dua kopi selanjutnya menjadi empat kopi dan seterusnya.
Pelipat gandaan ini membutuhkan enzim spesifik yang dikenal dengan polimerase. Polimerase
adalah enzim yang mampu menggabungkan DNA cetakan tunggal, membentuk untaian
molekul DNA yang panjang. Enzim ini membutuhkan primer serta DNA cetakan seperti
nukleotida yang terdiri dari empat basl.a yaitu Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) dan
Guanine (G) (Hewajuli, D, A. Dharmayanti. 2014).

Proses PCR merupakan siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing. dan
ekstensi oleh enzim DNA polymerase. Sepasang primer oligonukleonda yang spesifik
digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-S menuju unung 31 untai DNA Larget dan
mengamplifikasi untuk peman yang dinginkan (Yanti, A. 2017).
 Metode PCR dibedakan menjadi dua yaitu PCR konvensional dan real time. Analisis
hasil amplifikasi fragmen DNA pada PCR konvensional dilakukan dengan visualisasi di agar
elektroforesis. Sedangkan PCR real time, jumlah DNA yang diamplifikasi dapat dideteksi dan
diukur di setiap siklus proses PCR (Hewajuli, D, A. Dharmayanti. 2014).

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu teknik amplifikasi asam
nukleat in vitro yang paling banyak dipelajari dan digunakan secara luas. PCR digunakan untuk
menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan menganalisis molekul DNA
baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target melalui enzim dan oligonukleotida
sebagai primer dalam suatu thermocycle. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai
ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah
target disebut primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse.
Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA yang baru dikenal disebut
enzim polimerase. Proses PCR didahului dengan reverse transcriptase terhadap molekul
mRNA sehingga diperoleh molekul complementary DNA (cDNA). Molekul cDNA digunakan
dalam proses PCR, pada tahap proses PCR digunakan sebagai pengamplifikasi RNA. Tahap
ini dikenal sebagai proses RT-PCR (Widayat. dkk. 2019).

Reverse Transcription Real-Time PCR (RT-PCR) pertama kali dijelaskan oleh Powel
dan rekan pada tahun 1987 dan merupakan metode yang ampuh untuk mendeteksi jumlah
minimal RNA yang diberikan. Itu bergantung pada keberhasilan penerapan dua aktivitas
enzimatik yang terpisah:

1. Transkripsi balik RNA

2. Amplifikasi cDNA yang dihasilkan dari langkah 1

Langkah transkripsi terbalik dapat diprioritaskan menggunakan primer spesifik,

heksamer acak atau primer oligo-dT, dan pemilihan primer memerlukan pertimbangan yang
cermat. Penggunaan primer spesifik mRNA spesifik mengurangi priming latar belakang,
sedangkan penggunaan primer acak dan oligo-DT memaksimalkan jumlah molekul mRNA
yang dapat dianalisis dari sampel kecil RNA. Efisiensi transkripsi template yang diberikan
berbeda tidak hanya dengan sumber reverse transcriptase tetapi juga dengan kation divalen
yang digunakan dalam reaksi. Semua transkriptase balik memerlukan kation divalen agar dapat
berfungsi, dan derajat fungsinya dipengaruhi oleh spesies kation (King, N. 2010).

RT-PCR merupakan suatu teknik alternatif dalam menganalisis mRNA guna

pendeteksian ekspresi gen disamping dapat digunakan untuk kloning cDNA, yang sangat
berguna dalam menguraikan mekanisme dasar berbagai penyakit termasuk kanker. Prosedur
RT-PCR merupakan suatu metode yang sangat menghemat waktu, bila tersedia primer dan
pelacak yang sesuai. Ekstraksi RNA, transkripsi RNA menjadi cDNA dan amplifikasi cDNA
merupakan tahap awal metode ini, untuk selanjutnya hasil yang didapat dielektroforesis dan
ditransfer dengan southern transfer yang dapat diselesaikan dalam satu hari. Selanjutnya
hibridisasi dengan pelacak spesifik yang telah dilabel dan akhirnya analisis radioaktifitas dari
produk PCR yang telah terhibridisasi dengan pelacak spesifik tersebut. Banyak sekali
keuntungan penggunaan teknik ini dalam mendeteksi ekspresi gen baik dalam segi sensitifitas,
relaibilitas maupun kecepatannya diban ding cara-cara konvensional (Auerkari, E, I. dkk.).
D. Alat dan Bahan

Alat Bahan
1. Mikropipet ukuran 0,5-10 µl dan 1. Sampel RNA
10-100 µl 2. Tips ukuran 0,5-10 µl dan 10-100 µl
2. Vortex steril
3. Spin down 3. PCR tube steril
4. Mesin PCR (Themalcycler) 4. Kit sintesis cDNA (Sensifast cDNA
5. Ice block synthesis kit, Bioline):
6. Peralatan elektroforesis a. TransAmp Buffer (primer oligo-dT
7. GelDoc/UV Transilluminator dan random hexamer, dNTPs,
buffer)
b. Enzim Reverse Transcriptase
5. Nuclease-free water
6. PCR master mix (MyTaq HS Red mix,
Bioline)
7. Primer mt2-forward
8. Primer mt2-reverse
9. Gel agarose 1,5%
10. Buffer TAE 1x
11. DNA Ladder 100 bp
12. GelRed
13. Loading dye

E. Cara Kerja
N
Tahapan Prosedur Kerja
o
1 Sintesis cDNA a. Hitung konsentrasi rata-rata dari hasil isolasi RNA!
b. Hitung volume RNA yang akan dipipet ke dalam reaksi
sintesis cDNA dengan rumus berikut:
1000 ng
Volume RNA(µl) = ng
Konsentrasi rata−rata RNA ( )
µl

c. Masukkan komponen reaksi sintesis cDNA ke dalam PCR

tube sesuai tabel berikut ini:
Komponen Reaksi Volume (µl)
5x TransAmp Buffer 4
Enzim Reverse Transcriptase 1
Sampel RNA (1000 ng) X
Nuclease-free water 20-(4+1+X)
Volume total 20

d. Vortex sebentar untuk menghomogenkan, lalu spin down

agar semua campuran berada di dasar PCR tube!
e. Atur program inkubasi reaksi sintesis cDNA di mesin PCR
seperti berikut :
Tahap Suhu (oC) Durasi
Annealing primer 25 10 menit
Reverse transcription 42 15 menit
Inaktivasi 85 5 menit
Hold (penyimpanan
4 
sementara)

f. Masukkan PCR tube berisi reaksi sintesis cDNA ke dalam

mesin PCR, lalu “START RUN”!

2 PCR a. Masukkan komponen reaksi PCR ke dalam PCR tube

sesuai tabel berikut:
Gen target:
N
Tahapan Prosedur Kerja
o
Metallothionei Kompone [Awal [Akhir Volum **Jumla Volum
n 2 (mt2) n Reaksi ] ] e h Reksi e Mix
pertube PCR
(µl) (µl)
PCR 2x 1x 5,0 x5 25,0
Master
Mix
Primer 10 µM 0,5 µM 0,5 x5 2,5
mt2-
forward
Primer 10 µM 0,5 µM 0,5 x5 2,5
mt2-
reverse
Nuclease- Mencukupkan 3 x5 15,0
free water volume sampai
10 µl
*DNA 1 x5 15,0
template
 Vortex dan spin
down mix PCR
 Bagi mix PCR
@ 9 µl ke dalam
Volume Total 10 4 tube PCR
 Tambahkan
@DNA
template Vortex
dan spin down

Keterangan :
*DNA template yang digunakan ada 4 :
1) cDNA 1 (yang disintesis dari RNA 1)
N
Tahapan Prosedur Kerja
o
2) cDNA 2 (yang disintesis dari RNA 2)
3) RNA 1
4) RNA 2
**Jumlah reaksi: 4 + (10% x 4) = 4,4 ~ 5

b. Atur program PCR sesuai tabel berikut :

Tahap PCR Suhu (oC) Durasi Siklus
Denaturasi 95 1 menit
Awal
Denaturasi 95 15 detik
lanjut
35 x
Annealing 60 15 detik
Elongasi 72 10 detik
Elongasi 72 5 menit
Akhir

c. Masukkan PCR tube berisi reaksi sintesis cDNA ke dalam

mesin PCR, lalu “START RUN”!

3 Elektroforesis a. Siapkan gel agarose 1,5%!

b. Masukkan ke dalam chamber elektroforesis dan
tambahkan bufer TAE 1x sampai gel agarose terendam!
c. Lakukan loading sampel dengan campuran berikut:
Sumur
1 2 3 4 5
ke-
Mix GelRed GelRed: GelRed: GelRed: GelRed:
: 10 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl
Loading Produk Produk Produk Produk
dye: 1 PCR PCR PCR PCR
µl DNA cDNA 1 cDNA 2 RNA 1 : RNA 2 :
ladder :5µ : 5 µl 5 µl 5 µl
N
Tahapan Prosedur Kerja
o
100 bp:
3 µl

d. Atur voltase 100V dan waktu 20 menit

e. START RUN
f. Amati hasil elektroforesis di GelDoc atau UV
Transilluminator!
F. Hasil Pengamatan
G. Pembahasan

Pada praktikum kali ini, dilakukan secara daring. Tujuan dari praktikum ini
memahami prinsip dogma central biologi serta Praktikan memahami prinsip dan langkah
kerja RT-PCR.

RT-PCR menggunakan enzim reverse transcriptase (RT) dalam kombinasi dengan PCR
dan elektroforesis gel. RT-PCR dapat digunakan untuk membandingkan ekspresi gen antar
sampel—misalnya, dalam tahap embrionik yang berbeda, dalam jaringan yang berbeda, atau
dalam jenis sel yang sama dalam kondisi yang berbeda. RT-PCR dimulai dengan mengubah
sampel mRNA menjadi DNA untai ganda dengan urutan yang sesuai. Pertama, enzim reverse
transcriptase digunakan untuk mensintesis salinan DNA komplementer dari setiap mRNA
dalam sampel, yang disebut reverse transcript. Ingatlah bahwa ujung 3’ dari mRNA memiliki
bentangan nukleotida adenin (A) yang disebut ekor poli-A. Hal ini memungkinkan untai
komplementer pendek nukleotida deoksiribo timin (poli-dT atau oligo-dT) ditambahkan dan
digunakan sebagai primer untuk sintesis untai DNA ini. Setelah degradasi enzimatik dari
mRNA, untai DNA kedua, komplementer dengan yang pertama, disintesis oleh DNA
polimerase. DNA untai ganda yang dihasilkan disebut DNA komplementer (cDNA).
PCR adalah cara cepat membuat banyak salinan dari satu bentangan spesifik DNA
untai ganda, menggunakan primer yang berhibridisasi ke ujung yang berlawanan dari segmen
yang diinginkan. Contohnya seperti pada Gambar 2, ditambahkan primer yang sesuai dengan
segmen suatu gen pada Drosophila, menggunakan cDNA dari setiap tahap embrionik sebagai
templat untuk amplifikasi PCR dalam sampel terpisah.

Seperti yang terlihat pada hasil elektrofogram produk RT-PCR diatas bahwa memiliki
4 sumur yaitu : Pada sumur 1 (cDNA 1) dan sumur 2 (cDNA 2) termati pita DNA yang lebih
jelas, sedangkan pada sumur 3 (RNA 1) dan sumur 4 (RNA 2) pita DNA-nya tidak termati.
Hal ini dikarenakan ketika melakukan PCR, terlebih dahulu harus merubah atau mensintesis
RNA menjadi cDNA. Sehingga diperlukan Reverse Transcription PCR (RT-PCR), yang
mana digunakan untuk mensintesis RNA agar menjadi DNA. Oleh karena itu seharusnya
dilakukan RT-PCR terlebih dahulu kepada template RNA agar pita DNA teramati atau
terbaca
H. Kesimpulan

1. RT-PCR merupakan suatu teknik alternatif dalam menganalisis mRNA guna

pendeteksian ekspresi gen.
2. DNA untai ganda yang dihasilkan disebut DNA komplementer (cDNA)
3. RT-PCR menggunakan enzim reverse transcriptase (RT) dalam kombinasi dengan
PCR dan elektroforesis gel.
4. Seperti yang terlihat pada hasil elektrofogram produk RT-PCR diatas bahwa memiliki
4 sumur.
5. Ada dan tidaknya teramati pita pada sumur ditentukan oleh proses saat PCR yang
terlebih dahulu harus mengubah atau mensintesis RNA menjadi cDNA.
Pertanyaan

1. Jelaskan peran masing-masing komponen dalam reaksi sintesis cDNA!

Jawaban :
a) 5x TransAmp Buffer, berperan untuk menyediakan lingkungan yang cocok untuk aktivitas
optimum dan stabilitas DNA polimerase serta mempertahankan kestabilan pH.
b) Enzim Reverse Transcriptase, berperan untuk sintesis DNA komplementer (CDNA) dari
MRNA. Aplikasi enzim RT ini telah memberikan pemahaman yang luas mengenai sejumlah
mekanisme regulator seluler. Enzim ini berfungsi membuat copy DNA berdasarkan RNA-nya.
enzim reverse transcriptase digunakan untuk mensintesis salinan DNA komplementer dari setiap
mRNA dalam sampel, yang disebut reverse transcript
c) Sampel RNA (1000 ng ) merupakan sampel sebagai komponen yang akan di transkripsi disini.
d) Nuclease-free water berfungsi untuk mencukupkan volume hingga volume total 20 microliter 2.

2. Dari manakah enzim reverse transcriptase diperoleh atau diisolasi?

Jawaban :
Enzim reverse transcriptase berguna mengkatalisis reaksi transkripsi balik RNA utas tunggal
menjadi DNA utas ganda. Enzim transkriptase-balik (reverse-transcriptase) adalah enzim yang
secara alami digunakan oleh retrovirus untuk membuat copy DNA berdasarkan RNA-nya 3. Ada
dua tipe RT-PCR yaitu one step RT-PCR dan two step RT-PCR.

3. Jelaskan perbedaan, kelebihan dan kekurangan masing masing metode!

Jawaban :
Metode one step qRT-PCR merupakan metode menggunakan sampel RNA dengan sintesis
CDNA langsung dalam mesin qRT-PCR. Metode qRT-PCR memiliki kelebihan sensitivitas dan
spesifisitas yang tinggi high dynamic range, cocok untuk tindakan kuantifikasi dan user and lab
friendly Ada dua jenis qRT-PCR, one step dan two step qRT-PCR. Two step qRT-PCR adalah
metode dimana transkripsi balik RNA dilakukan terlebih dahulu dan terpisah dari proses qPCR.
One step qRT-PCR, merupakan metode dimana Reverse transcriptase dan qPCR berjalan dengan
bersamaan.

4. Bagaimana ekspresi gen mt2 berdasarkan elektroferogram diatas?

Jawaban :
Gen ini adalah anggota dari keluarga gen metallothionein. Protein yang dikodekan oleh keluarga
gen ini memiliki berat molekul rendah, kaya sistein, tidak memiliki residu aromatik, dan
mengikat ion logam berat divalen, mengubah konsentrasi logam berat intraseluler di dalam sel.
5. Mengapa pita DNA produk RT-PCR ada yang tipis dan ada yang lebih tebal?
Jawaban :
Karena terlihat pita yang dihasilkan sangat tebal karena konsentrasi DNA tinggi tetapi masih ada
smear. Dan terlihat pita DNA tipis karena tergantung pada banyaknya konsentrasi DNA yang
terekstraksi. Kualitas DNA yang terekstraksi juga ditunjukan oleh adanya smear pada pita DNA,
semakin sedikit atau tidak adanya smear menunjukkan semakin baik kualitas DNA. Pita DNA
yang tebal dan mengumpul (tidak menyebar) menunjukan konsentrasi yang tinggi dan DNA total
yang diekstrak dalam kondisi utuh. Sedangkan, pita DNA yang terlihat menyebar menunjukan
adanya ikatan antar molekul DNA yang terputus pada saat proses ekstraksi berlangsung, sehingga
genom DNA terpotong menjadi bagian-bagian yang lebih kecil. Terputusnya ikatan antar molekul
tersebut dapat disebabkan oleh adanya gerakan fisik yang berlebihan yang dapat terjadi dalam
proses pemipetan, pada saat dibolak-balik dalam ependorf, disentrifus, atau bahkan karena
temperatur yang terlalu tinggi dan karena aktivitas bahan-bahan kimia tertentu.

6. Mengapa pada produk RT-PCR dengan RNA sebagai template tidak teramati pita DNA?
Jawaban
Dikarenakan pada saat melakukan PCR kita harus merubah atau mensintesis terlebih dahulu ke
CDNA. Karena prinsipnya RNA tidak bisa langsung di tes ke PCR karena itu perlu adanya RT-
PCR.

7. Berikan contoh lain aplikasi RT-PCR selain untuk mengetahui ekspresi gen!
Jawaban :
Teknik RT-PCR ini sangat berguna untuk mendeteksi ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA
sebelum dilakukan cloning dan analisis, maupun untuk diagnosis identifikasi agen infektif
maupun penyakit genetik (PCR kualitatif), sedangkan penggunaan RT-PCR secara kuantitatif
diantaranya untuk menghitung jumlah mRNA dari suatu genom
 Daftar Pustaka

Auerkari, E, I. dkk. RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) : Suatu Cara

Pendeteksi Perubahan-Perubahan Ekspresi Gen Pada Penyakit. Jakarta: Universitas
Indonesia.

Barlett, J, M, S. Stirling. 2010. PCR Protocols Second Edition. Humana Press.’

Eugene V. Koonin.2015. Why the Central Dogma: on the nature of the great biological
exclusion principle. Biol Direct. 2015; 10: 52.

Hewajuli, D, A., Dharmayanti. 2014. Perkembangan Teknologi Reverse Transcription-

Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom Avian Influenza dan
Newcastle Diseases. Bogor: Balai Besar Penelitian Veteriner.

King, N. 2010. RT-PCR Protocols. London: Humana Press.

Widayat, dkk. 2019. Real Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) sebagai Alat Deteksi
DNA Babi dalam Beberapa Produk Non-Pangan. Jurnal Indonesia Journal of Halal 2(1).
Hal 26.

Yanti, A. 2017. Uji Autentifikasi Daging Kambing Terhadap Cemaran Daging Babi
Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction). Jakarta: UIN Syarif
Hidayatullah.