BAB I

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dewasa ini berkembang semakin pesat. Salah satu
perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang sering diterapkan adalah bioteknologi.
Bioteknologi merupakan pemanfaatan berbagai prinsip ilmiah dan rekayasa terhadap organisme, sistem,
atau proses biologis untuk menghasilkan atau meningkatkan potensi organisme maupun menghasilkan
produk dan jasa bagi kepentingan hidup manusia.

Secara umum bioteknologi dikelompokkan menjadi dua, yaitu bioteknologi tradisional dan bioteknologi
modern. Bioteknologi tradisional merupakan bioteknologi yang memanfaatkan mikroba, proses
biokimia, dan proses genetik yang terjadi secara alami. Produk dari bioteknologi tradisional tersebut
antara lain: tempe, oncom, yoghurt, dan keju.

Bioteknologi tradisional ini terus mengalami perkembangan hingga ditemukannya struktur DNA yang
diikuti dengan penemuan lainnya. Dengan ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu
pengetahuan tentang DNA, muncullah istilah bioteknologi modern. Bioteknologi modern merupakan
bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi yang didasarkan pada
manipulasi DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada organisme
yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan. Produk dari bioteknologi modern, misalnya
insulin, kloning domba Dolly, antibodi monoklonal.

Dalam aplikasinya, bioteknologi menerapkan berbagai macam disiplin ilmu. Disiplin ilmu tersebut antara
lain: mikrobiologi (tentang mikroba), biologi sel (tentang sel), genetika (tentang pewarisan sifat makhluk
hidup), dan biokimia (tentang makhluk hidup dilihat dari aspek kimianya). Salah satu pokok bahasan
yang penting untuk di pahami yaitu mengenai Real time Polymerase Chain Reaction atau yang lebih
dikenal dengan istilah RT. PCR.

1.2. RUMUSAN MASALAH

Dari latar belakang tersebut, maka dapat dicari beberapa rumusan masalah yang dapat dibahas, antara
lain:

1. Apa yang dimaksud dengan Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)?
2. Apa saja tahapan-tahapan Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)?

3. Bagaimana metode dan interprestasi hasil Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)?

1.3 TUJUAN PENULISAN

1. mengetahui pengertian dari Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

2. mengetahui tahapan-tahapan dari Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR

4. mengetahui metode dan interprestasi hasil Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Definisi Real-Time PCR (qPCR)

Real Time PCR (qPCR) adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Dalam ilmu
biologi molekular, Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction
(Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction), adalah suatu teknik pengerjaan PCR di
laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target
molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.

Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil
perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal
yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa.

Real Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau PCR kinetik adalah
teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk mengamplifikasi dan secara simultan
mengukur molekul DNA target. Untuk satu atau lebih urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR
memungkinkan deteksi dan kuantifikasi secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah salinan
mutlak atau jumlah relatif ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkan atau gen normalisasi
tambahan.

Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan
keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis.
Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat
reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai
hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda).

Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi
dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa
karsinogenik.

Description: E:\LTL988-price-of-real-time-pcr-machine.jpg

gambar alat Real time polymerase chain reaction ( RT-PCR)

2.2 PRINSIP DAN METODE

Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR; utamanya adalah DNA yang telah
diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus
amplifikasi selesai.

Prinsip kerjanya didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul reporter yang
meningkat sejalan dengan berlangsungnya proses PCR. Hal ini terjadi karena akumulasi produk PCR pada
tiap siklus amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi meliputi pewarna yang berikatan pada
double-stranded DNA (menggunakan SYBR®Green atau EvaGreen®Reagents ) atau menggunakan probe
spesifik sekuens/sequence specific probes (Molecular Beacons or TaqMan® Probes). Terdapat 2 (dua)
metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain :
(1) Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda (dsDNA)
misalnya SyBr Green.

(2) Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar
(flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe FRET (Hybridisasi) dan
probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan
meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya
produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan.

RT-PCR dapat dibedakan menjadi dua metode yaitu one-step RT-PCR dan two-steps RT PCR. One step RT-
PCR merupakan metode yang lebih umum dilakukan karena reaksi RT dan reaksi siklus PCR dilakukan
dalam satu langkah. Akan tetapi pada two-steps RRT-PCR, reaksi RT dan reaksi siklus PCR dilakukan
secara terpisah.

Two-step RRT-PCR juga menggunakan primer yang berbeda pada masing-masing reaksi. Umumnya
primer yang digunakan pada reaksi RT adalah oligo-dT kemudian dilanjutkan menggunakan primer
Urutan Nukleotida Spesifik pada reaksi siklus PCR. Sedangkan One-step RRT-PCR hanya memerlukan satu
primer yang spesifik terhadap kedua reaksi tersebut (Qiagen, 2007).

RT-PCR yang dilakukan dengan metode One step dapat menurunkan resiko terjadinya kontaminasi silang
dan waktu yang dibutuhkan lebih cepat dibandingkan dengan two-steps RRT-PCR. Meskipun demikian
One step RRT-PCR kurang sensitif jika dibandingkan dengan two-step RRT-PCR (Trani, 2005).

2.3 PROSEDUR KERJA DAN INTEPRESTASI

RT-PCR menggunakan sepasang primer, yang berkomplemen dengan sequens yang jelas dari masing-
masing dua untai cDNA. Primer tersebut kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA
polymerase dan akan menghasilkan sebuah untai gandaan pada setiap siklusnya dan seterusnya
mengikuti amplifikasi logaritmik.

RT-PCR meliputi tiga tahap utama. Tahap pertama adalah reverse transcription (RT) atau transkripsi balik
dimana RNA ditranskrip balik menjadi cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase dan primer.
Tahap ini sangat penting dalam kaitannya dengan performa PCR untuk amplifikasi cDNA dengan bantuan
DNA polymerase sebab DNA polymerase hanya dapat bekerja pada templet yang berupa DNA. Tahapan
RT (Reverse Transcripsion) dapat dilakukan dalam tabung yang sama dengan PCR (one-step PCR) atau
pada tabung yang terpisah (two-step PCR) menggunakan suhu berkisar 40°C sampai 50°C, tergantung
pada karakteristik reverse transcriptase yang digunakan.

Tahap berikutnya adalah denaturasi dsDNA at 95°C, pada tahap ini dua untai DNA akan terpisah dan
primer dapat mengikat pada untai tersebut jika temperaturnya diturunkan kemudian yang selanjutnya
akan dimulai rantai reaksi baru. Kemudian suhu diturunkan hingga mencapai suhu anealing yang
bervariasi tergantung primer yang digunakan, konsentrasi, probe dan konsentrasinya jika digunakan, dan
juga konsentrasi kation.
Tahap akhir adalah Amplifikasi PCR yang merupakan proses dimana dilakukannya perpanjangan DNA
menggunakan Primer yang memerlukan Taq DNA polymerase yang termostabil, biasanya pada suhu
72°C, yang merupakan suhu optimal untuk aktivitas enzim polymerase. Lamanya masa inkubasi tiap
temperatur, perubahan suhu dan jumlah siklus dikontrol secara terprogram menggunakan
programmable thermal cycler.

Description: proses real time pcr.jpg

gambar prosedur kerja RT-PCR

interpretasi hasil

contoh interpretasi hasil pada alat rt-PCR

Description: REal Time PCR (2).jpg

a. Limit deteksi untuk Influenza Tipe A (Matrix gene-specific TaqMan assay) :

· Ct < 33 = positif

· Ct 33 – 38 ambiguous, perlu diulang atau diteliti lebih lanjut

· Ct > 38 = negatif

b. Limit deteksi untuk subtipe H5 (Matrix gene-specific TaqMan assay) :

· Ct < 36 = positif

· Ct 36 – 40 ambiguous, perlu diulang atau diteliti lebih lanjut

· Ct > 40 = negatif

BAB III
PENUTUP

3.1 KESIMPULAN

Dari hasil pembahasan kami dapatkan mensimpulkan perbedaan dari PCR dan RT PCR dimana
perbedaannya adalah Reverse Transcription PCR dilakukan untuk menggandakan untaian RNA setelah
diubah menjadi cDNA (dengan Enzim reverse transcriptase) lalu diperbanyak dengan PCR. sedangkan
pada Real Time PCR (qPCR) merupakan kegiatan yang melibatkan RT-PCR yang diteruskan dengan
perhitungan jumlah cDNA yang ada. Singkatnya, perbedaan terletak pada seberapa pentingnya
kuantifikasi DNA.

http://ahamad22.blogspot.com/2016/11/makalah-rt-pcr-ahmad-binhus.html?m=1