Nested PCR

Dari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas

Belum Diperiksa

Reaksi PCR

Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan
bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk
mengamplifikasi fragmen.[1] Pasangan primer yang pertama akan mengamplifikasifragmen yang cara
kerjanya mirip dengan PCR pada umumnya.[1] Sedangkan, pasangan primer yang kedua biasanya
disebut nested primers (sepasang primer tersebut terletak di dalam fragmen pertama) yang
berikatan di dalam fragmenproduk PCR yang pertama untuk memungkinkan
terjadinya amplifikasi produk PCR yang kedua dimana hasilnya lebih pendek dari yang pertama.
[1]
Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan
bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua sangat rendah. [1][2] Dengan
demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi.[1]
Daftar isi
[sembunyikan]

1Perbedaan Nested PCR dengan PCR biasa

2Mekanisme kerja

3Aplikasi

4Referensi

Perbedaan Nested PCR dengan PCR biasa[sunting | sunting sumber]

Nested PCR merupakan variasi dari reaksi polymerase chain reaction biasa (PCR).[1] Nested PCR
dan PCR biasa keduanya berguna untuk memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah
banyak.[1][2] Pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa hanya

menggunakan 1 pasang primer.[1] Oleh karena itu, hasil fragmen DNA dari nested PCR
lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa. [1] Waktu yang diperlukan dalam reaksi
nested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR
sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR.[1] Selain itu, keuntungan nested PCR adalah
meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer.[1][2]

Mekanisme kerja[sunting | sunting sumber]

Secara umum, PCR adalah suatu proses perbanyakan DNA secara in vitro melalui beberapa tahap,
yaitu denaturasi, penempelan primer, dan pemanjangan.[3] Prinsip kerja nested PCR tidak jauh
berbeda dengan PCR biasa, namun nested PCR akan bekerja menggunakan dua pasang primer
untuk mengamplifikasi fragmen DNA spesifik melalui dua proses PCR secara terpisah.[3] Pertamatama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan, di mana sepasang primer
pertama melekat di kedua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer
tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama.[3] Kemudian produk PCR pertama tersebut
dijalankan pada proses PCR kedua di mana pasangan primer kedua (nested primer) akan
mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan
memulai amplifikasibagian di antara kedua primer tersebut.[3] Hasilnya adalah sekuens DNA yang
lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR pertama.[3]

Aplikasi[sunting | sunting sumber]

Nested PCR memiliki aplikasi yang luas dalam bidang kesehatan dan identifikasi parasit.[4][5] Karena
nested PCR memiliki sensitivitas dan spesifitas yang lebih tinggi dibanding PCR biasa, maka hasil
yang didapat akan lebih akurat.[4] Keakuratan nested PCR karena daerah yang diinginkan akan
diamplifikasi dua kali, dengan dua set primer.[1] Beberapa contoh aplikasinya antara lain adalah
dalam mendiagnosis penyakit Extrapulmonary tuberculosis yang disebabkan oleh Mycobacterium
tuberculosis, deteksi Taenia solium pada penyakit taeniasis [4], dan diagnosis leptospirosis[5]
Diagnosis penyakit Extrapulmonary tuberculosis sebenarnya bisa saja menggunakan PCR biasa,
namun PCR biasa tidak memiliki sensitifitas dan reabilitas setinggi nested PCR untuk mendiagnosis
dengan akurat.[6] Kekurangan PCR ini berhubungan dengan kondisi pengambilan sampel
yang heterogen, adanya faktor yang memengaruhi amplifikasi, dan hilangnya patogen selama
proses.[6] Berhubungan dengan hal tersebut, maka disimpulkan bahwa PCR yang biasa digunakan
tidak memiliki sensitifitas dan reabilitas yang tinggi.[6] Tes ini didasarkan pada amplifikasi fragmen
986.[6]
Keunggulan lain nested PCR adalah proses yang tidak memakan banyak waktu dibandingkan
dengan proses lainnya, seperti teknik kultur biasa. [7] Pada diagnosis penyakitExtrapulmonary
tuberculosis ini, dibandingkan efektivitas antara teknik nested PCR yang menargetkan gen MPB64
dari Mycobacterium tuberculosis dan teknik kultur pada mediaLowenstein Jensen (LJ) medium.
[7]
Percobaan ini melibatkan 400 sampel klinis yang diduga sakit extrapulmonary tuberculosis dan
30 spesimen kontrol non tuberculosis yang kemudian dikultur dan dideteksi dengan nested PCR.
[7]
Pada perbandingan hasil antara teknik kultur pada media LJ dengan nested PCR, hasil dari teknik
kultur pada media LJ dari 400 spesimen klinis hanya 16 spesimen yang menunjukkan hasil positif.
[7]
Pada hasil dari nested PCR, dari 400 spesimen klinis terdapat 141 hasil positif (35.2 %).
[7]
Sedangkan, pada spesimen kontrol hasilnya negatif dengan nested PCR. [7] Pada percobaan ini
dapat dilihat bahwa nested PCR memiliki keakuratan dan sensitivitas yang tinggi, serta tidak
memakan waktu, terlebih dibandingkan dengan metode kultur konvensional.[7]