Jurusan Biologi FMIPA UNP

Penuntun Praktikum Virtual Genetika II

Semester Juli-Desember 2021
Praktikum 9
Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

9.1 Tujuan
1. Praktikan memahami prinsip dogma central biologi
2. Praktikan memahami prinsip dan langkah kerja RT-PCR

9.2 Prinsip Dasar

RT-PCR menggunakan enzim reverse transcriptase (RT) dalam kombinasi dengan PCR dan
elektroforesis gel. RT-PCR dapat digunakan untuk membandingkan ekspresi gen antar sampel—
misalnya, dalam tahap embrionik yang berbeda, dalam jaringan yang berbeda, atau dalam jenis sel
yang sama dalam kondisi yang berbeda. RT-PCR dimulai dengan mengubah sampel mRNA menjadi
DNA untai ganda dengan urutan yang sesuai. Pertama, enzim reverse transcriptase digunakan untuk
mensintesis salinan DNA komplementer dari setiap mRNA dalam sampel, yang disebut reverse
transcript. Ingatlah bahwa ujung 3’ dari mRNA memiliki bentangan nukleotida adenin
(A) yang disebut ekor poli-A. Hal ini memungkinkan untai komplementer pendek nukleotida
deoksiribo timin (poli-dT atau oligo-dT) ditambahkan dan digunakan sebagai primer untuk sintesis
untai DNA ini. Setelah degradasi enzimatik dari mRNA, untai DNA kedua, komplementer dengan yang
pertama, disintesis oleh DNA polimerase. DNA untai ganda yang dihasilkan disebut DNA
komplementer (cDNA).

Gambar 1 Tahapan sintesis cDNA dari mRNA (reverse transcription)

[Sumber: Campbell Biology 11th edition]

Selanjutnya dalam RT-PCR adalah langkah PCR. Seperti yang akan Anda ingat, PCR adalah cara cepat
membuat banyak salinan dari satu bentangan spesifik DNA untai ganda, menggunakan primer yang
berhibridisasi ke ujung yang berlawanan dari segmen yang diinginkan. Contohnya seperti pada
Gambar 2, ditambahkan primer yang sesuai dengan segmen suatu gen pada Drosophila,
menggunakan cDNA dari setiap tahap embrionik sebagai templat untuk amplifikasi PCR dalam sampel
terpisah.

Tim Praktikum Genetika II Biologi FMIPA UNP 1

 Gambar 2 Analisis ekspresi gen tunggal dengan RT-PCR
[Sumber: Campbell Biology 11th edition]

9.3 Alat dan Bahan

Alat Bahan
1. Mikropipet ukuran 0,5-10 μl dan 10- 1. Sampel RNA
100 μl 2. Tips ukuran 0,5-10 μl dan 10-100 μl steril
2. Vortex 3. PCR tube steril
3. Spin down 4. Kit sintesis cDNA (Sensifast cDNA synthesis
4. Mesin PCR (Themalcycler) kit, Bioline):
5. Ice block a) TransAmp Buffer (primer oligo-dT dan
6. Peralatan elektroforesis random hexamer, dNTPs, buffer)
7. GelDoc/UV Transilluminator b) Enzim Reverse Transcriptase
5. Nuclease-free water
6. PCR master mix (MyTaq HS Red mix, Bioline)
7. Primer mt2-forward
8. Primer mt2-reverse
9. Gel agarose 1,5%
10. Buffer TAE 1x
11. DNA Ladder 100 bp
12. GelRed
13. Loading dye

9.4 Prosedur Kerja

 Dosen/asisten praktikum menjelaskan dan memperagakan prosedur kerja secara umum kepada
praktikan melalui video tutorial yang sudah diunggah ke elearning2.unp.ac.id atau pada link
YouTube berikut: https://youtu.be/JKb3xfia-PE
 Praktikan membaca penuntun praktikum virtual dan menonton video tutorial agar dapat
memahami prosedur kerjanya.
 Saat mengerjakan RT-PCR di laboratorium wajib menggunakan jas lab, sarung tangan, dan
masker.
No. Tahapan Prosedur Kerja
1 Sintesis cDNA a. Hitung konsentrasi rata-rata dari hasil isolasi RNA!
b. Hitung volume RNA yang akan dipipet ke dalam reaksi sintesis
cDNA dengan rumus berikut:
Volume RNA(μl) = 1000 ng
Konsentrasi rata-rata RNA (ng/μl)
c. Masukkan komponen reaksi sintesis cDNA ke dalam PCR tube
sesuai tabel berikut ini:
Komponen Reaksi Volume (μl)
5x TransAmp Buffer 4
Enzim Reverse Transcriptase 1
Sampel RNA (1000 ng) X
Nuclease-free water 20-(4+1+X)
Volume Total 20

d. Vortex sebentar untuk menghomogenkan, lalu spin down agar

semua campuran berada di dasar PCR tube!
e. Atur program inkubasi reaksi sintesis cDNA di mesin PCR seperti
berikut:
Tahap Suhu (oC) Durasi
Annealing primer 25 10 menit
Reverse transcription 42 15 menit
Inaktivasi 85 5 menit
Hold 4 
(penyimpanan sementara)
f. Masukkan PCR tube berisi reaksi sintesis cDNA ke dalam mesin
PCR, lalu “START RUN”!

2 PCR a. Masukkan komponen reaksi PCR ke dalam PCR tube sesuai

tabel berikut:
Gen target: Komponen [Awal] [Akhir] Volume **Jumlah Volume
Metallothionein 2 Reaksi per tube Reaksi Mix PCR
(μl) (μl)
(mt2)
PCR Master 2x 1x 5,0 X5 25,0
Mix
Primer 10 μM 0,5 μM 0,5 X5 2,5
mt2-forward
Primer 10 μM 0,5 μM 0,5 X5 2,5
mt2-reverse
Nuclease-free Mencukupkan volume 3 X5 15,0
water sampai 10 μl
*DNA 1  Vortex dan spin
template down mix PCR
 Bagi mix PCR @ 9
μl ke dalam 4 tube
PCR
Volume Total 10  Tambahkan
@DNA template
 Vortex dan spin
down
Keterangan:
*DNA template yang digunakan ada 4:
1) cDNA 1 (yang disintesis dari RNA 1)
2) cDNA 2 (yang disintesis dari RNA 2)
3) RNA 1
4) RNA 2
**Jumlah reaksi: 4 + (10% x 4) = 4,4 ~ 5
 b. Atur program PCR sesuai tabel berikut:
Tahap PCR Suhu (oC) Durasi Siklus
Denaturasi awal 95 1 menit
Denaturasi lanjut 95 15 detik
Annealing 60 15 detik 35 x
Elongasi 72 10 detik
Elongasi Akhir 72 5 menit
c. Masukkan PCR tube berisi reaksi sintesis cDNA ke dalam mesin
PCR, lalu “START RUN”!
3 Elektroforesis a. Siapkan gel agarose 1,5%!
b. Masukkan ke dalam chamber elektroforesis dan tambahkan
bufer TAE 1x sampai gel agarose terendam!
c. Lakukan loading sampel dengan campuran berikut:
Sumur 1 2 3 4 5
ke-
Mix GelRed: 10 μl GelRed: 5 GelRed: GelRed: GelRed:
Loading dye: 1 μl μl 5 μl 5 μl 5 μl
DNA ladder 100 Produk Produk Produk PCR Produk PCR
bp: 3 μl PCR cDNA PCR RNA 1 : 5 μl RNA 2 : 5 μl
1 : 5 μl cDNA 2 :
5 μl
d. Atur voltase 100V dan waktu 20 menit
e. START RUN
f. Amati hasil elektroforesis di GelDoc atau UV Transilluminator!

9.5 Laporan Praktikum RT-PCR

Hasil Pengamatan: Elektroferogram produk RT-PCR

Pertanyaan
1. Jelaskan peran masing-masing komponen dalam reaksi sintesis cDNA!
2. Dari manakah enzim reverse transcriptase diperoleh atau diisolasi?
3. Ada dua tipe RT-PCR yaitu one-step RT-PCR dan two-step RT-PCR. Jelaskan perbedaan, kelebihan
dan kelemahan masing-masing metode!
4. Bagaimana ekspresi gen mt2 berdasarkan elektroferogram di atas?
5. Mengapa pita DNA produk RT-PCR ada yang tipis dan ada yang lebih tebal?
6. Mengapa pada produk RT-PCR dengan RNA sebagai template tidak teramati pita DNA?
7. Berikan contoh lain aplikasi RT-PCR selain untuk mengetahui ekspresi gen!

Format Laporan Praktikum (diunggah dalam bentuk file pdf):

 Halaman sampul
 Halaman isi:
Judul Praktikum
A. Tujuan Praktikum
B. Waktu dan Tempat Praktikum
C. Teori Dasar
D. Alat dan Bahan
E. Cara Kerja
F. Hasil Pengamatan
G. Pembahasan
H. Kesimpulan
Daftar Pustaka