Prosedur Pemeriksaan

rRT-PCR COVID-19
-Real Time RT-PCR-

PELATIHAN PEMERIKSAAN PCR COVID-19

BAGI TEKNOLOGI LABORATORIUM
19 – 29 April 2021
 Sistematika
Metode Pemeriksaan RT-PCR

Prosedur Pemeriksaan rRT-PCR

Prosedur Pemeriksaan rRT-PCR SARS-CoV-2

Analisis Hasil

Permasalahan
Metode Pemeriksaan rRT-PCR
 Singleplex rRT-PCR
• Mendeteksi satu target DNA atau
RNA dalam satu reaksi PCR dengan
menggunakan satu pewarna
fluoresensi.

• Kelebihan: lebih sensitif

• Kekurangan: reagensia yang
diperlukan lebih banyak dan waktu
yang diperlukan lebih lama.
 Multiplex rRT-PCR
Identifikasi dua atau lebih
DNA target dalam 1 reaksi
PCR, dalam hal ini
menggunakan metode
Realtime PCR
 Multiplex rRT-PCR
Kelebihan:
• Mendeteksi dua atau lebih DNA target dalam satu reaksi
pemeriksaan.
• Spesimen yang diperiksa lebih banyak
• Lebih ekonomis.
• Efisien ketika jumlah spesimen terbatas.

Kekurangan:
• Optimisasi dan validasi untuk memastikan efisiensi dari
amplifikasi pada masing-masing target DNA.
• Reagensia Realtime dengan kemampuan high through-put.
• Memerlukan instrumen dengan beberapa detektor
 Jenis Probe vs Detektor
• Deteksi SARS-CoV2 menggunakan realtime RT-PCR
• Jenis probe yang digunakan adalah hidrolisis Taqman Probe
probe/Taqman probe
• Label probe yang digunakan bergantung pada
desain probe yang dibuat atau dari kit yang tersedia 5’ 3’
di pasaran.
• Terdapat berbagai macam label probe yang tersedia

label probe disesuaikan dengan detektor yang terdapat

di dalam mesin Thermal cycler yang dimiliki di laboratorium
Jenis Probe vs Mesin Real Time PCR
Tabel label probe yang cocok
dengan mesin real time PCR
Prosedur rRT-PCR SARS-CoV-2
 Alur rRT-PCR
Persiapan mastermix
(area 1: clean room)

Penambahan RNA
(area 2)
Amplifikasi DNA di
Master mix
dalam Thermal Cycler
(area 3)
Alur rRT-PCR

Pre-PCR

Alur kerja
searah

PCR
 Area Pre-PCR: Clean Room
Penyimpanan dan penanganan reagen rRT-PCR
• disimpan di dalam refrigerator dan freezer di area 1 (clean
room).
• Reagen rRT-PCR harus di alikuot dalam volume kecil, untuk
menghindari kontaminasi.
• Reagen stok harus disimpan pada suhu -20oC
• Reagen kerja (working solution) yang digunakan dengan
frekuensi harian, dapat disimpan pada suhu 2-8oC
(tergantung ketentuan).
• Ruangan harus bersih dari berbagai agen biologis (RNA,
DNA, sampel. Produk PCR, kultur )
 Area Pre-PCR: Clean Room
PCR Master mix preparation →komponen rRT-PCR:

• enzim termostabil Taq DNA

polymerase dan reverse transcriptase rRT-PCR
• deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) Reagensia
• Ion Mg2+
• Buffer
• Primer Forward
• Primer Reverse Spesifik untuk
• Probe SARS-CoV2
 Primer dan Probe
WHO merekomendasikan beberapa Primer dan Probe Set
dengan beberapa target gen sebagai berikut:
 Tahapan Preparasi Master Mix
a) Dilakukan di dalam Laminar Air Flow (LAF) ruang bersih (clean room)
b) Mengeluarkan master mix dari refrigerator/freezer.
c) Memastikan semua reagensia tercampur dengan baik dengan cara vortex
cepat dan spin down
d) Menyiapkan PCR worksheet untuk menghitung jumlah reaksi master mix yang
dibutuhkan
e) Memperhatikan instruksi dari reagen rRT-PCR yang digunakan mengenai
rekomendasi kondisi suhu saat mencampur master (suhu ruang atau dingin 4-8◦
C)
f) Teknik memipet harus dikuasai dengan baik oleh petugas
 Singleplex: Protokol US CDC
Target : N1, N2, RP
Reagensia : Superscript III One Step rRT-PCR with Platinum Taq
Komponen 1 reaksi (µl) 14 reaksi (µl)
Nuclease-free water 5,5 77
2x reaction mix 12,5 175
primer & probe (N1/N2/RP) 1,5 21
Enxyme Mix 0,5 7
Total 20 280

Contoh perhitungan reaksi:

Jumlah sampel 11 + 1 reaksi Non template control (NTC) + 1 reaksi Positive template
control (PTC) + 1 reaksi pippeting error = Total reaksi: 14 reaksi
RP gene yang merupakan gen yang terdapat di dalam sel epitel manusia
 Multiplex rRT-PCR : Kit komersial
Target : RdRp, E, RP
Kit : BioSewoomTM (Korea CDC)
Komponen 1 reaksi (µl) n reaksi (µl)

Nucelase-free water 3.5

2x Reaction mixture 12.5
Primer and Probe mix 3.0
PCR Enzyme mix 1.0
Total 20.0

Contoh perhitungan reaksi:

Jumlah spesimen 11 + 1 reaksi Non template control (NTC) + 1 reaksi Positive template control (PTC)
+ 1 reaksi pippeting error . Total reaksi: 14 reaksi
AREA 1 : PCR Master Mix Preparation
Komponen 1 reaksi (µl) 14 reaksi (µl)
Nuclease-free water 5,5 77
2x reaction mix 12,5 175
primer & probe (N1/N2/RP) 1,5 21
Enxyme Mix 0,5 7 N1 N2 RP
Total 20 280 Master mix

Masing-masing master mix dialiquot

@ 20 µl ke dalam 96 PCR well plate
atau realtime PCR strip 8
AREA 1 : PCR Master Mix Preparation
Masing-masing master mix dialiquot @ 20 µl ke
dalam 96 PCR well plate atau realtime PCR
N1 N2 RP Strips
Master mix

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A N1 NTC N2 NTC RP NTC N1 N2 RP
B N1 N2 RP N1 N2 RP
C N1 N2 RP N1 N2 RP PCR plate ditutup
D N1 N2 RP N1 N2 RP menggunakan optical caps
E N1 N2 RP N1 PTC N2 PTC RP NTC
F N1 N2 RP
strip ATAU alumunium foil
G N1 N2 RP selama berpindah ruangan.
H N1 N2 RP

5 µl nuclease-free water
ditambahkan pada well NTC
AREA 1 : PCR Master Mix Preparation

Master mix dialiquot @ 20 µl ke

1 Master mix dalam 96 PCR well plate

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A NTC S8
B S1 S9
C S2 S10
D S3 mock
5 µl nuclease-free water
E S4 PTC ditambahkan pada well NTC
F S5
G S6
H S7

PCR plate ditutup menggunakan optical caps strip ATAU

alumunium foil selama berpindah ruangan.
Alur rRT-PCR

Pre-PCR

Alur kerja
searah

PCR
 AREA 2 : Penambahan RNA
a. Dilakukan di area lab 2, di dalam BSC Kelas II (Tipe A2)
b. Menyimpan master mix PCR di dalam kulkas suhu 2-8oC.
c. Mengenakan APD khusus area 2.
d. Sebelum bekerja, membersihkan BSC menggunaan hipoklorit 1% dan
alkohol 70%.
e. Mengambil master mix dari dalam kulkas dan RNA. Jika memungkinkan
simpan RNA dalam cooler rack (agar tetap dingin) selama proses
penambahan RNA ke dalam master mix.
 AREA 2 : Penambahan RNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Sample 1
A N1 NTC N2 NTC RP NTC N1 N2 RP
B N1 N2 RP N1 N2 RP
Sample 2
C N1 N2 RP N1 N2 RP
D N1 N2 RP N1 N2 RP dst hingga sample ke -11
Sample 3
E N1 N2 RP N1 PTC N2 PTC RP NTC
F N1 N2 RP
G N1 N2 RP
H N1 N2 RP

Tambahkan 5 µl RNA template ke dalam masing-masing

master mix N1, N2, N3, RP
 AREA 2 : Penambahan RNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Sample 1 N1
A NTC S8
Sample 2 B S1 S9
C S2 S10
Sample 3 D S3 S11
E S4
F S5 Tambahkan 5 µl RNA template ke dalam
dst hingga
G S6 masing-masing well
sample ke -10
H S7
Alur rRT-PCR

Pre-PCR

Alur kerja
searah

PCR
 AREA 3 : Penambahan PTC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A N1 NTC N2 NTC RP NTC N1 N2 RP
B N1 N2 RP N1 N2 RP
C N1 N2 RP N1 N2 RP
D N1 N2 RP N1 N2 RP
E N1 N2 RP N1 PTC N2 PTC RP NTC
F N1 N2 RP
G N1 N2 RP Tambahkan 5 µl PTC untuk N1, N2, RP
H N1 N2 RP

well PCR ditutup dengan optical caps strips/optical adhesive film

 AREA 3 : Penambahan PTC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
N1
A NTC S8
B S1 S9
C S2 S10
D S3 S11
E S4 PTC
F S5 Tambahkan 5 µl PTC
G S6
H S7

well PCR ditutup dengan optical caps strips/optical adhesive film

 AREA 3 : Penambahan PTC
a. Menutup PCR 96 well plate dengan optical caps strips dengan rapat. Jika anda
menggunakan optical adhesive film, tunggu hingga PC selesai ditambahkan.
b. Pastikan menyegel rapat optical caps strips/optical adhesive film untuk
menghindari penguapan larutan master mix PCR dan RNA → reaksi PCR gagal.
c. Menambahkan kontrol positif di area 3:
• BSC yang lain (jika ada)
• Meja lab terbuka
d. Tambahkan 5 µl PC. Segera tutup well PC dengan optical caps strips/optical
adhesive film
AREA 3 : Kondisi Suhu rRT-PCR (singleplex)

Pengaturan suhu, waktu dan sistem deteksi dalam pemeriksaan berbeda

untuk setiap protocol rRT-PCR

Step Suhu Waktu Siklus Mode

1. RT 50°C 30 menit 1 - Detector set-up untuk koleksi data:
dipengaruhi oleh penggunaan
2. Hot Start 95°C 15 menit 1 -
reporter dye pada probe
3. Amplifikasi 95°C 15 detik 45 -

55°C 45 detik Koleksi

data
(FAM) 5’ 3
’
* Protokol CDC
 AREA 3 : Kondisi Suhu rRT-PCR (multiplex)

Pengaturan suhu, waktu dan sistem deteksi dalam pemeriksaan berbeda untuk setiap
protocol rRT-PCR

Step Suhu Waktu Siklus Mode

Detector set-up untuk koleksi data:
1. RT 50°C 30 menit 1 - dipengaruhi oleh penggunaan
2. Hot Start 95°C 15 menit 1
reporter dye pada probe
-
3. Amplifikasi 95°C 15 detik 40 -
62°C 45 detik Koleksi
data (FAM,
Hex, Cy5)

* Protokol Biosewoom
AREA 3 : Proses kerja rRT-PCR

Proses rRT-PCR terjadi di dalam Thermal Cycler

Analisis Hasil
 Hasil rRT-PCR
Specimen Thermal Fluorescence Analysis by
Preparation Cycling detection Computer

• Analisis data → berdasarkan petunjuk dari

prosedur reagensia/kit yang digunakan.
• Analisis harus dilakukan secara terpisah
untuk setiap gen target menggunakan
pengaturan garis threshold (ambang
batas) secara manual.
• Garis threshold harus disesuaikan agar
berada di dalam rentang fase
eksponensial pada kurva fluoresensi serta
diatas sinyal background (latar belakang).
 Hasil rRT-PCR
Beberapa hal yang harus diperhatikan di dalam menganalisa hasil rRT-
PCR:
a. Hasil NC harus negatif dan tidak menunjukan kurva amplifikasi. Jika NC
menunjukkan kurva amplifikasi, indikasi adanya kontaminasi → Segera
lakukan pengulangan penyiapan reagensia master mix dengan
memperhatikan ketelitian dan kemananan kontrol kualitas reagensia

b. Hasil PC menunjukkan kurva amplifikasi dengan rentang kisaran nilai Ct

diantara 30-35. Jika PC menunjukkan kurva amplifikasi nilai Ct >35 atau
negatif → segera lakukan pengulangan penyiapan reagensia master mix
dengan memperhatikan ketelitian dan kemananan kontrol kualitas reagensia
 Hasil rRT-PCR

Beberapa hal yang harus diperhatikan di dalam menganalisa hasil rRT-

PCR:
c. Hasil RP menunjukkan kurva amplifikasi dengan nilai Ct <35,
mengindikasikan adanya material genetika RNA dari spesimen manusia.
Nilai RP menunjukkan bahwa proses asam nukleat dan pengambilan
spesimen telah dilakukan dengan benar. Jika nilai RP negatif juga
menunjukkan kemungkinan reagensia mix yang kurang baik

d. Sampel menunjukkan hasil positif ditandai dengan adanya kurva

amplifikasi dengan nilai ct berdasarkan prosedur reagensia atau kit yang
digunakan
Hasil rRT-PCR (Singleplex)
PTC

Positive

NTC negative

NTC tidak menunjukkan

amplifikasi

PTC menunjukkan
amplifikasi dengan nilai
CT dalam kisaran 25-30

Hasil positif bila CT ≤ 40

 I nterpretasi hasil
Contoh Interpretasi hasil berdasarkan protokol US CDC

2019 2019 RP Interpretasi Hasil

nCoV_N1 nCoV_N2
+ + + Positif SARS-CoV2
Hanya salah satu target positif + Inconclusive Dilakukan tes ulang

- - + Negatif SARS-CoV2
- - - Invalid

Cut off value untuk nilai positif berbeda untuk setiap protocol
US CDC protocol, hasil dinyatakan positif bila CT ≤ 40
Hasil RP positif menunjukkan bahwa proses ekstraksi asam nukleat dan proses
pengambilan spesimen telah dilakukan dengan benar
 I nterpretasi hasil
No. Target Reporter Quencher
RP
1. RdRp FAM None
2. E HEX None

E 3. RP Cy5 None

RdRp
Pengaturan threshold dan
pembacaan nilai Ct harus dilakukan
untuk setiap dye fluoresensi sesuai
dengan masing-masing protokol
yang digunakan
I nterpretasi hasil
RdRp gene

E gene

RP gene

Dalam 1 well dapat

diketahui amplifikasi
3 gen
Interpretasi Hasil rRT-PCR (Multiplex)
NTC: tidak
amplifikasi pada
ketiga primer (RdRp,
E dan RP)

PTC: terdapat
ampflifikasi pada
ketiga primer (RdRp,
E dan RP)
 I nterpretasi hasil

RdRp E RP Interpretasi Hasil

+ + + Positif SARS-CoV2

Hanya salah satu target + Inconclusive

positif Dilakukan tes ulang
- - + Negatif SARS-CoV2

- - - Invalid

Cut off value untuk nilai positif berbeda untuk setiap protocol
Protokol Biosewoom, hasil dinyatakan positif bila CT ≤ 38 , RP gene CT ≤ 35
I nterpretasi hasil
Hasil?
RP: positive
E gene: negative
RdRp: negative

Negative SARS-
CoV2

RP gene
RdRp gene
E gene
 I nterpretasi hasil
Hasil Invalid dan inconclusive
• Kurva amplifikasi tidak berbentuk sigmoid walaupun nilai ct terbentuk dan
memotong garis threshold. Kurva amplifikasi normal harus berbentuk sigmoid
yang menunjukkan adanya amplifikasi secara eksponensial. Untuk kasus ini,
sebaiknya threshold diatur di atas kurva ini (Jika memungkinkan).
• Nilai RP negatif atau tidak ada kurva amplifikasi. Hal ini menunjukkan tidak
adanya material genetik, mengindikasikan pengambilan spesimen yang kurang
baik. Hasil tidak valid bisa juga disebabkan reagensia yang rusak baik
reagensia master mix ataupun ekstraksi.
• Nilai salah satu gen target negatif atau tidak ada kurva amplifikasi pada
metoda rRT-PCR Multiplex.
 I nterpretasi hasil
Hasil?
RP: negative

Invalid result
Not Sigmoid Curve

RP gene
RdRp gene
E gene
 I nterpretasi hasil

Hasil?
RP: positive
Not sigmoid curve E gene negative
RdRp negative

Negative
SARS-CoV2

RP gene
RdRp gene
E gene
 Permasalahan
Masalah Kemungkinan penyebab
Komposisi mastermix tidak optimal
Suhu PCR tidak optimal
Tidak ada amplifikasi Ada inhibitor
Template RNA/DNA rusak
Probe terdegradasi
Kontaminasi
Sinyal pada kontrol negatif Probe terdegradasi
Primer Dimer
Konsentrasi template terlalu tinggi
Sinyal terdeteksi terlalu
Probe terdegradasi
awal
Primer Dimer
Terima Kasih