PRAKTIKUM 1.

METODE PEMERIKSAAN SEROLOGI DAN MOLEKULER

PADA PENYAKIT INFEKSI
Kontributor: dr. Sri Ratna Dewi, M.Sc., Sp.PK dan Ni Luh Putu Eka Kartika Sari, S.Si, M.Biomed

Praktikum mengenai serologi dan molekuler pada Block 2.9 Infectious Disease akan dilaksanakan secara
luring sesuai dengan jadwal yang telah diatur dalam buku blok.

Tujuan Praktikum:
1. Mahasiswa dapat menganalisis prinsip pemeriksaan serologi dan dapat menginterpretasikannya.
2. Mahasiswa dapat menganalisis prinsip penerapan teknik biomolekuler pada bidang kedokteran dan
menganalisis proses deteksi materi genetik pada sampel pasien.

Sasaran Praktikum:
1. Mahasiswa mampu menganalisis prinsip pemeriksaan serologi
2. Mahasiswa mampu menginterpretasikan hasil pemeriksaan serologi
3. Mahasiswa mampu menganalisis prinsip penerapan teknik biomolekuler pada bidang kedokteran
4. Mahasiswa mampu menganalisis proses deteksi materi genetik pada sampel pasien

Lingkup Praktikum:
1. Prinsip penerapan teknik serologi (ikatan antigen dan antibodi) pada rapid diagnostic test serta teknik
biomolekuler (Reverse Transcriptase-PCR) pada penyakit infeksi.

Waktu Praktikum (durasi): 3 jam untuk masing-masing sesi praktikum.

Metode Praktikum:
1. Kuliah pengantar praktikum selama 1 jam
2. Praktikum untuk memahami penerapan teknik pemeriksaan serologi dan biomolekuler pada penyakit
infeksi
3. Diskusi
4. Evaluasi (ujian praktikum)

Instruksi Kerja:
A. Praktikum Serologi NS1 Antigen Dengue
1. Alat dan Bahan
a. Sampel: dapat berupa whole blood, plasma, atau serum
b. Handscoon
c. Rapid Diagnostic Test Dengue NS1 Antigen
d. Pipet tetes atau mikropipet
 2. Cara Kerja
a. Pastikan semua komponen kit dan spesimen mencapai suhu kamar (antara 15 – 30 0C)
sebelum membuka dan menguji.
b. Keluarkan perangkat uji dari kemasan foil, dan tempatkan pada permukaan kering dan rata.
Beri label pada perangkat uji dengan tanda pengenal pasien. lakukan uji segera untuk
menghindari terpaparnya uji terhadap lembab.
c. Dengan alat tetes sekali pakai atau mikropipet, masukkan 3 tetes (sekitar 100 µL) spesimen
ke dalam sumuran spesimen “S”.
d. Lakukan interpretasi hasil uji pada menit ke-15-20.
Perhatian: jangan baca hasil uji setelah 20 menit; pembacaan setelah 20 menit dapat
memberikan hasil yang salah.

3. Interpretasi Hasil:
a. Hasil NS1 antigen dengue negatif: bila hanya muncul garis berwarna di daerah kontrol
(C) saja
b. Hasil NS1 antigen dengue positif: bila muncul dua garis berwarna di daerah test (T) dan
daerah kontrol (C)
c. Hasil invalid: bila tidak muncul strip di daerah kontrol (C)

B. Praktikum Molekuler

Kegiatan Tujuan Praktikum

Mempersiapkan Mampu mengenali dan mempersiapkan alat dan bahan praktikum:
alat dan bahan a. Alat:
• Pipettor satu set
• Biosafety cabinet class 2A
• PCR cabinet / laminar air flow cabinet
• Meja PCR
• Vortex
• Rak tabung PCR
• Rak tabung PCR berpendingin
• Mesin PCR
• Freezer -20ºC dan -40ºC
• Mikrosentrifugasi
• Apparatus elektroforesis dan power supply
• Sistem gel dokumentasi
• Jas lab
b. Bahan:
• RNA isolation kit
• RNAse out ribonuclease inhibitor
• 5x first standard buffer
• DTT
• Etanol absolut
• Sybr safe stain
 • Ultrapure distiled water
• Ultrapure DNAse/RNAse-free
• Buffer Tris Boric EDTA (TBE) 1X
• Carrier RNA
• Superscript III RT
• Taq DNA polymerase
• dNTP
• Buffer
• MgCl2
• Serbuk agarose
• 100 bp DNA ladder
• loading dye
• PCR tube 0.2 µL
• Microtube 1.5 Ml
• White tips
• Yellow tips
• Blue tips
• Falcon tube 15 ml
• Gloves
• Masker
• Tissue
Prosedur Mampu memahami dan mengerjakan proses pemeriksaan PCR dengue:
Kerja
Protokol 1:
Ekstraksi RNA virus dengue dari sampel serum menggunakan QIAamp® Vira
Mini Kit

Ekstraksi RNA dikerjakan dengan langkah-langkah sebagai berikut:

1. Tabung diberi label dan kode sampel kemudian sebanyak 560 µL Buffer AVL
dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL kemudian 5,6 µL Carrier RNA
ditambahkan dan dihomogenkan
2. Sebanyak 140 µL serum dimasukkan kemudian vortex selama 15 detik dan
inkubasi selama 10 menit pada suhu ruang
3. Sentrifugasi beberapa detik, sebanyak 500 µL ethanol (96-100%) ditambahkan
kemudian vortex selama 15 detik, lalu sentrifugasi beberapa detik
4. Sebanyak 630 µL solution masukkan ke dalam QIAamp Mini spin column
kemudian sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit, tabung
collection yang berada di bawah QIAamp Mini spin column terdapat filtrat
dibuang dan ganti dengan tabung collection yang baru
5. Ulangi prosedur di atas sebanyak 630 µL sisa solution kemudian masukkan ke
dalam QIAamp Mini spin column, sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm
selama 1 menit, kemudian pindahkan QIAamp Mini spin column ke dalam
 tabung collection yang baru, sebanyak 500 µL Buffer AW1 masukkan ke dalam
QIAamp Mini spin column
6. Sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit, kemudian QIAamp
Mini spin column ke dalam tabung collection yang baru, sebanyak 500 µL
Buffer AW2 masukkan ke dalam QIAamp Mini spin column
7. Sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit, pindahkan QIAamp
Mini spin column ke dalam tabung mikro 1,5 mL yang baru dan sentrifugasi
pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit
8. Pindahkan QIAamp Mini spin column ke dalam tabung mikro 1,5 mL yang
baru, sebanyak 60 µL AVE dimasukkan ke dalam QIAamp Mini spin column,
dan inkubasi selama 1 menit pada suhu ruang
9. Sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit, buang QIAamp Mini
spin column dan hasil saringan berupa RNA pada tabung mikro 1,5 mL
kemudian disimpan di freezer pada -80ºC.
Protokol 2:
Protokol RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) untuk deteksi dan serotipe DENV

Dalam tabung PCR berisi campuran reaksi RT-PCR yang terdiri dari komponen
berikut:
Komponen Jumlah (µL)
Nuclease-free water 6.5
0.1 M DTT 1
10 mM dNTP Mix 1
D2 Primer (10 pmol) 0.5
RNA 6
-Sentrifugasi sebentar-
-inkubasi pada suhu 65ºC selama 5 menit, letakkan segera ke dalam es lalu
tambahkan-
5x first standard buffer 4
RNAse Out 0.5
Superscript III RT 0.5
TOTAL 20
Thermal cycle setting:
25ºC selama 5 menit
42ºC selama 60 menit
70ºC selama 15 menit
4ºC ∞
- Didapatkan cDNA lalu disimpan di freezer pada -20ºC.
Protokol 3:
Protokol untuk deteksi DENV
Dalam tabung PCR berisi campuran reaksi PCR yang terdiri dari komponen
berikut:
Komponen Jumlah (µL)
Nuclease-free water 17.75
10x Roche buffer 2.5
10 mMdNTP Mix 0.5
50 mM MgCl2 1.5
D1 Primer (10 pmol) 0.3
D2 Primer (10 pmol) 0.3
Roche Taq DNA Polymerase 5 U/µL 0.15
cDNA 2
TOTAL 25
Thermal cycle setting:
95ºC selama 2 menit
95ºC selama 30 detik
60ºC selama 1 menit
72ºC selama 1 menit 30 detik
72ºC selama 10 menit
4ºC ∞
- Didapatkan DNA template lalu disimpan di freezer pada -40ºC.

• Sampel dengan reaksi PCR positif kemudian dianalisis lebih lanjut.

Penentuan serotipe menggunakan metode multiplex-nested PCR. Pada
reaksi ini digunakan primer forward D1 dan empat primer reverse yang
spesifik untuk empat serotipe virus dengue, yaitu DEN-1, DEN-2, DEN-3,
dan DEN-4. Penentuan serotipe virus dengue dilakukan berdasarkan
ukuran pita DNA yang terbentuk setelah visualisasi pada elektroforesis gel
agarose, yaitu 482 bp untuk DEN-1, 119 bp untuk DEN-2, 290 bp untuk
DEN-3, dan 389 bp untuk DEN-4. Pada pelaksanaan reaksi deteksi dan
penentuan serotipe selalu disertakan pembanding positif untuk setiap
serotipe.
Protokol 4:
Protokol untuk gel agarose elektroforesis
1. Sebanyak 1,2 gr agarose ditimbang lalu dimasukkan ke dalam
erlenmeyer. Sebanyak 60 mL TBE dimasukkan dan dihomogenkan.
2. Larutan dipanaskan sampai bening, kemudian didinginkan hingga dirasa
hangat-hangat kuku. Sebanyak 6 µL sybrsafe dimasukkan kemudian
dihomogenkan dan dituang ke dalam cetakan gel. Ditunggu sampai
memadat.
 3. Cetakan sumur dilepas dan masukkan gel ke dalam alat elektroforesis,
kemudian larutan TBE 1x perlahan dituang ke dalam alat sampai gel
tergenang. Sebanyak 4 µL loading gel dicampurkan up-down dengan
produk serotipe, kemudian masukkan ke dalam sumur gel sebanyak 20
µL,
4. Masukkan sebanyak 1 µL DNA ladder 100 bp sebagai marker ke dalam
sumur berikutnya, kemudian melakukan running pada alat elektroforesis
dengan tegangan sebagai berikut:
Tegangan 80 V
Arus 200 mA
Waktu 45 menit

5. Lakukan pencatatan hasil dan foto gel.

Sumber Daya Manusia: Melibatkan 2 orang dosen pendamping praktikum.

Sarana dan Prasarana Penunjang:

1. Ruangan laboratorium

Evaluasi: ujian praktikum

Referensi:
1. Instruksi kerja Rapid Diagnostic Test SGTi-flex Covid-19 IgM/IgG
2. Bintang, M. 2010. Biokimia-Teknik Penelitian. Jakarta: Penerbit Erlangga.
3. Lemmer. K., et al. External quality control assessments in PCR diagnostics of dengue virus
infections. Journal of Clinical Virology. 2004; 30:291–296.
4. Vorndam, V., Kuno, G., Gubler, D.J., Kuno, G. Dengue and dengue hemorrhagic fever. New York:
CAB International; 1997. Laboratory diagnosis of dengue virus infections; pp. 313–333