Deteksi DNA Babi Pada Produk dengan

Metode Real Time PCR

Rudi Nirwantono - Product Specialist

Balai Pengembangan Produk dan Standarisasi Industri

(BPPSI)
Pekanbaru, 25 November 2019
Authorized Agent for:
ASAM NUKLEAT: DNA & RNA
 ASAM NUKLEAT: DNA & RNA

Interaksi antar basa yang membentuk antiparalel double helix DNA

 ASAM NUKLEAT: DNA & RNA

Sedikit perbedaan pada rumus kimia membuat berbedaan nyata pada struktur DNA dan RNA
Asam Nukleat: DNA & RNA
 General Workflow
Metode PCR

Elektroforesis
+ gel doc

PCR
Detruksi Purifikasi Uji konsentrasi &
Jaringan DNA/RNA kemurnian

Preparasi Purifikasi Visualisasi Hasil

Quality Control PCR Setup & PCR
Sampel DNA/RNA
 EKSTRAKSI DNA

• Ekstraksi - suatu proses untuk mendapatkan DNA yang dilakukan secara mekanik atau enzimatis

HOW?
 Metode Destruksi Sampel

Mekanik Kimiawi
• Ultrasonikasi • Lysis buffer
• Nitrogen cair • Enzimatik (Proteinase-K /
• Blender Proteinase)
• Bead
 Purifikasi DNA

• Menggunakan kolom silika:

a. Binding (Ex: Chaotropic agent)
b. Washing (Ex: Guanidine salt + Etanol)
c. Elution (Ex: RNA-free Water; buffer elution)
 Peralatan & Bahan Ekstraksi DNA
• Alat
- Sample disruptor
- Microcentrifuge High Speed
- Thermo shaker
- Micropipette & Tips
- Microcentrifuge tube

• Bahan
- Kit Ekstraksi DNA/RNA
- Ethanol Absolute
- Kloroform
 Sample Disruptor

Model MS-100 MS-100R

Speed Setting Range 2,000 to 5,500rpm/100rpm increment

Disruption Method Microprocessor controlled "3D Rotating High Speed Motion" (patent applying)

Timer Setting Range 1 to 300 seconds or 1 to 100 seconds more then 5,100rpm
Display LCD digital display with backlight
Capacity 2ml x 12tubes

Safety Devices Lid Opening Detector, Motor Overheat Detector and Rotor Malfunction Detector

Refrigerant ――― HFC134

Chamber temperature ――― 2℃ (at room temperature 25℃)

Dimensions 280W x 320D x 305Hmm 280W x 450D x 308Hmm

Approx.17kg Approx.27kg
Net weight
(without external transformer) (without external transformer)

AC120V, 3A, 50/60Hz, 1P AC120V, 8A, 50/60Hz, 1P

Power Input AC220V/230V/240V, 2A, 50/60Hz, 1P AC220V/230V/240V, 4A, 50/60Hz, 1P
(external transformer used) (external transformer used)

φ0.1/φ0.5/φ1.0 Glass Beads and φ2.0 Zirconia Beads,

Accessories Included
approx. 30g each and 2ml x 20 sample tubes
Thermo-shaker
High-Speed Microcentrifuge

Parameters MX-107 MX-207 MX-307

Max speed 15,000 rpm 16,000 rpm 16,000 rpm
Max RCF 20,380G 21,130G 21,130G
Max capacity 2 ml x 24 30 ml x 6 50 ml x 4
Racks 1 2 3
Temperature -9°C to 35°C
Power consumption 650 W 790 W 860 W
 Pipette & tip

• Disarankan menggunakan filter untuk mencegah

kontaminasi
• Teknik pipetting sangat mempengaruhi kualitas hasil
ekstraksi
• Diperlukan latihan pipetting yang benar sebelum
melakukan ekstraksi DNA
• Jika dilakukan dengan benar dapat meningkatkan
performa ekstraksi DNA, meminimalisir kontaminasi, dan
meminimalisir cedera teknisi
DNeasy Mericon Food
DNeasy Mericon Food

• Menggunakan metode CTAB yang dimodifikasi

dengan spin column
• Selesai dalam waktu 2.5 jam (termasuk inkubasi)
• Dapat digunakan untuk mengekstraksi sample
sulit (dificult-to-lyze) dengan hasil rendah inhibitor
• Dapat digunakan untuk berbagai jenis sampel
• Kunci → Food Lysis Buffer
 DNeasy Mericon Food

■ Ketchup
■ Cacao
■ Chocolate
■ Cookies • Fatty foods
■ Cornflakes
■ Corn chips
■ Soy lecithin • Strongly inhibitory
■ Hazelnut flour
■ Potato milk
■ Infant food
• Highly processed
■ Vanilla
■ Nutrition supportive
• Low DNA content
■ Milk
■ Marmalade
■ Bread • High DNA content
■ Olive oil
• Etc.
QC: Konsentrasi dan Kemurnian

▪ Menggunakan Nano-volume UV quantification

▪ Dapat digunakan sebagai kontrol eksternal

▪ Rasio A260/A280: Rekomendasi sekitar 1.8-2.1

< 1.8 terdapat kontaminasi protein,
> 2.1 terdapat kemungkinan adanya kontaminasi garam

▪ Rasio A260/A230: Rekomendasi sekitar 2.0-2.4

< 2.0 : kontaminasi garam, EDTA, karbohidrat, peptida, and
phenol (secara umum aromatic compounds)
> 2.4 : kesalahan dalam blanko karena kotor
 NanoPhotometer® N50

• Model : NanoVolume
• Sample Number :1
• Minimum Sample : 0.3 μl
• Full Spectrum Scan : 200 - 650 nm
• Detection Range : dsDNA: 5 - 7,500 ng/μl
BSA: 0.15 - 217 mg/ml
• Path Lengths : 0.67 mm dan 0.07 mm
• Dillution Factor : 15 & 140
NanoPhotometer® N50
NanoPhotometer® N50
 Komponen PCR

Template
DNA sample (can be gDNA, cDNA,
mDNA, plasmid DNA, or DNA amplicon Tool
from previous PCR)

additional DNA primer

dNTPs KIT
dATP, dGTP, dTTP, dCTP

Taq Polimerase
Heat-susceptible DNA Taq Polimerase
from Thermus aquaticus Reagent
Thermal Cycler
co-factor
Mg2+ (or Mn2+), KCl
 Polymerase Chain Reaction

Polymerase chain reaction (PCR) adalah metode yang

digunakan dalam biologi molekuler untuk membuat
banyak salinan segmen DNA tertentu
- Saiki, 1988

” PCR dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 ketika ia menjadi
karyawan di Cetus Corporation. Kemudian dianugerahi Hadiah Nobel
Kimia pada tahun 1993 untuk pekerjaannya dalam mengembangkan
metode ini.
” – Mulis et all., 1983
 Polymerase Chain Reaction

Merupakan teknik perbanyakan DNA target secara in vitro

➢ Polymerase = Menggunakan enzim DNA polimerase

➢ Chain = Produk reaksi pertama menjadi template DNA untuk reaksi berikutnya
➢ Reaction = menghasilkan produk yang berlipat secara eksponensial
 Mengapa Spesifik?

Tiap makhluk hidup memiliki urutan DNA yang berbeda-beda

Perbedaan tersebut dimanfaatkan dalam PCR melalui desiain primer
 General Steps

▪ Denaturation
• Denaturasi DNA untai ganda (double-stranded DNA) (melting) menjadi untai tunggal
• Temperature di atas 90°C
▪ Annealing
• Temperatur 40-65°C, primer menempel (anneal) pada urutan komplementer pada DNA target
• Suhu optimum tergantung dari urutan primer dan sekitar 5°C di bawah Tm primer
▪ Extension
• Proses pemanjangan untai DNA baru pada ujung 3’ oleh enzim DNA polymerase pada temperatur 70-72°C

Nb: Pada beberapa reaksi dengan ukuran amplicon pendek, tahap annealing dan Extension digabung
pada suhu 60ᵒC
Siklus Reaksi

Siklus PCR
 Siklus PCR

100
Double Stranded DNA
90

80

70

60

50

RT
 Siklus PCR

Denaturation 100

90

80

70

60

50

94ºC
 Siklus PCR

Elongasion
Primer Annealing 100

90

80

70

60

50

55ºC
72ºC
 Siklus PCR

Duplicated DNA
100

90

80

70

60

50

72ºC
General Mechanism
 Visualisasi Hasil

Hasil End-point PCR dapat divisualisasi dan dianalisis menggunakan teknik elektroforesis. Dapat
juga dilanjutkan hingga bloting (Southern & Nortern blotting)

• Elektroforesis gel adalah suatu metode yang

digunakan untuk memisahkan dan
menganalisis fragmen-fragmen makromolekul
(asam nukleat dan protein)
• Menggunakan gel sebagai “saringan”
 Konvensional vs Real-Time PCR

Jika menggunakan Real-

Time, jumlah DNA yang
sangat sedikit dapat
dideteksi

Hampir Tak Terlihat &

rawan miss-interpletasi
Konvensional vs Real-Time PCR
 General Workflow
Metode PCR

Detruksi Purifikasi Uji konsentrasi & Real-time PCR

Jaringan DNA/RNA kemurnian

Preparasi Purifikasi
Quality Control PCR Setup & PCR
Sampel DNA/RNA
General Workflow
 General Workflow

Pengambilan data
jumlah DNA baru yang disintesis
Prinsip kerja Real-Time PCR

Excellent Solution for Laboratory Supplies

 Reporter Type

Suatu molekul kimia (Fluorophore) yang dapat mengemisikan cahaya (berbendar) ketika
tereksitasi dan digunakan sebagai penanda jumlah DNA hasil PCR (amplikon) yang disintesis

01 Non-Specific Detection

Double-stranded DNA-binding dyes

Specific Detection 02

Probe-based method (Fluorescent-Quencer reporter)

Universal Dye
 Universal Dye
Cahaya Eksitasi

Cahaya Emisi

Cahaya Eksitasi

Cahaya Emisi
Probe
 Real-Time
PCR

Typical Optical Paths

■ Multiple optical paths in block systems are complex,

error prone and need frequent calibration
■ Passive reference dyes such as ROX are required to
compensate for deviations
 Mekanisme Visualisasi
Rotor-Gene Optical Paths

Reaction chamber
Detection
filters

Lens

PMT detector
assembly

LED light
Tubes in rotor
source
spin past optics
assembly

Spindle/motor
assembly
 Mekanisme Visualisasi

Filter set
Rotor spins tubes at 400 rpm (rotates for each
channel)
■ Koleksi data sangat cepat

Sensitive PMT
(photomultiplier) detector

LED light source

(rotates for each channel)
Data Presentation

Baseline
Level fluorensi pada saat inisiasi
rekasi

Threshold
Level fluorensi yang secara statistic
merefleksikan peningkatan level
fluorensi yang signifikan

Threshold Cycle (Ct)

jumah siklus yang dibutuhkan agar
level fluorensi mencapai threshold.
Data Presentation
Data Presentation
mericon Detection kits

Excellent Solution for Laboratory Supplies

 mericon Detection kits

1 Set up sampel dan control reaksi seperti tabel berikut ini :

Excellent Solution for Laboratory Supplies

 mericon Detection kits

2 Buat program PCR seperti tabel berikut:

Excellent Solution for Laboratory Supplies

 mericon Detection kits

3 Result analysis
 mericon Detection kits

3 Result analysis
Performa kit
Publication
Publication
 Referensi

Livak, K.J. and T.D. Schmittgen. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2-∆∆CT Method.
Methods 25: 402–408.
Derveaux, S., J. Vandesompele, J.Hellemans. 2010. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods, 50: 227–
230.
Steege, Deborah A. (2000). "Emerging features of mRNA decay in bacteria". RNA. 6 (8): 1079–90.
Sarkar, Nilima (June 1997). "Polyadenylation of mRNA in Prokaryotes". Annual Review of Biochemistry. 66 (1): 173–197.
von Ahlfen, S. and M. Schlumpberger. Effects of low A260/A230 ratios in RNA preparations on downstream applications. QIAGEN Gene
Expression Newsletter Issue 15/10. Page 7.
Kennedy, S. 2009. Six Important Factors for Successful Reverse Transcription. Tersedia di https://bitesizebio.com/1810/six-important-factors-
for-successful-reverse-transcription/. Diakses pada 14 Maret 2019.
Siklus Reaksi