TEKNIK MEMPELAJARI

GEN DAN AKTIVITAS GEN

Oleh:
Rani Sasmita
PS Biologi, FMIPA ULM
Email: ranisasmita@ulm.ac.id
Blotting
• Teknik biologi molekuler yang
digunakan untuk mempelajari
ekspresi gen, dengan mendeteksi
DNA, RNA atau protein pada
sampel.
• Pengembangan teknik hibridisasi.
Blotting:
• Dot blot
• Southern blot
• Northern blot
• Western blot
Lanjutan…
Dot Blot:
Sampel dengan volume tertentu
ditempatkan pada membran
nitroselulosa dalam jumlah sedikit,
sehingga hanya berupa suatu titik.
Langkah selanjutnya hibridisasi.
Lanjutan…
Hanya bisa mengkonfirmasi ada
atau tidak adanya biomolekul yang
dapat dideteksi oleh probe DNA
atau antibodi.
Lanjutan…
Lanjutan…
Misalnya: Deteksi bakteri patogen pada
sampel A1-A6, S1-S6.
Lanjutan…

Southern Northern Western

Blot Blot Blot
• Deteksi • Deteksi • Deteksi
DNA RNA Protein
Lanjutan…
• Penemu
Southern Blot:
Prof. Sir Edwin
Southern,
Professor of
Biochemistry
and Fellow of
Trinity (1975).
Lanjutan…
Membuat “Sandwich”
INGAT KEMBALI HIBRIDISASI!
• Proses terbentuknya dsDNA dari
ssDNA yang berperan sebagai probe
dengan target ssDNA (yang akan
dideteksi).
Lanjutan…
Alat dan bahan yang diperlukan:
1. Elektroforesis gel
2. Transfer membran
3. Southern apparatus
4. Filter paper
5. Buffer solution
6. Probe
FIGURE 21: Southern blot: Identifying Specific DNA Fragments
(Edward Southern--the pioneer)
Gel is soaked in
alkali buffer to
denature DNA or gentle vacuum pressure

Drying or exposure to UV light

Probes: Isotope or chemical

 Tahapan Southern blotting:
Gel ditransfer
Running
Sampel + enzim ke membran
elektroforesis
restriksi ex.
gel
nitroselulosa

Membran
Deteksi dengan Running
dipindahkan +
autoradiografi blotting
probe tertentu
Animasi: Southern blot
Northern blotting
Teknik biologi molekuler untuk
mendeteksi molekul RNA pada
sampel.
Penemu: James Alwine & George
Stark dari Univ. Stanford.
Western blot/Immunoblotting:
Teknik biologi molekuler untuk
mendeteksi molekul protein pada
sampel.
Identifikasi protein didasari pada
kemampuan antigen melekat pada
antibodi yang spesifik.
Lanjutan…

Sample
protein/ antibodi
antigen
Struktur antibodi
• If your samples are proteins, what
should you do???????
Ingat:
• Protein ada yang bermuatan negatif,
positif dan netral.
• Sampel protein diinkubasi bersama
detergen yaitu SDS (Sodium Dodecyl
Sulfate).
 SDS membuat
- - protein bermuatan
-
-
negatif
-

-
-

-
Protein Dipanaskan
folded dalam SDS
Protein
unfolded
• Setelah running, gel distaining dengan Coomassie
Blue (blue dye) or Silver Stain (black or purple dye).

Calibration curve for

molecular weight
estimation.
 A. Tank blotting

B. Semi-dry blotting
Semi-dry blotting

sandwich
 Gel 
Preparasi Gel
transfer
sampel elektroforesis
membran

+ Antibodi
sekunder
+ Antibodi
(conjugate + Skim milk
primer
with
enzyme)

Deteksi
Larutan “blocking”
• Fungsi: menghalangi perlekatan
protein lain yang tidak diinginkan pada
membran.
• Larutan blocking: 10% (w/v) BSA, or
5% non-fat dried milk dalam Tris or
phosphate buffered saline (PBS).
Penambahan antibodi:
1. Antibodi
primer
2. Antibodi
sekunder
(conjugated
with enzyme)
DETEKSI DENGAN PENAMBAHAN SUBSTRAT
YANG BEREAKSI DENGAN ENZIM
The column marked "NC"
is an HIV-negative test
result and the column
marked "PC" is an HIV-
positive test result.
Columns 3 to 10 show a
series of tests on an
individual person who
became infected with HIV
to illustrate how an HIV
test result can change
during the day.
AMPLIFIKASI DNA
DAN PENERAPANNYA
Oleh:
Rani Sasmita
PS Biologi, FMIPA ULM
Email: ranisasmita@ulm.ac.id
Subtopik:
 Pendahuluan
 Komponen proses PCR
 Prinsip dasar PCR
a. Denaturasi
b. Renaturasi/Annealing
c. Ekstensi/Extension/Elongation
 Tipe-tipe DNA polimerase
 Aplikasi PCR
Pendahuluan
• Reaksi berantai polimerase
(Polymerase Chain Reaction, PCR)
adalah metode enzimatis untuk
melipat gandakan secara
eksponensial suatu sekuen
nukleotida tertentu secara in vitro.
Thermus aquaticus （ Taq DNA polymerase)
 PCR
• Polymerase chain reaction
(PCR) permits the exponential
amplification of a desired
sequence, using primers that
anneal to the sequence of interest.

Tm: annealing temperature for primer/template pair

*Kary Mullis in the 1980s

*Taq polymerase from Thermus aquaticus
*Thermal cycler 95oC 40oC 72oC
20x
Exponential produce
the primer to primer-
defined sequence
 The Nobel Prize in Chemistry 1993
Press Release 13 October 1993
The Royal Swedish Academy of Sciences has decided to award the 1993
Nobel Prize in Chemistry for contributions to the development of methods
within DNA-based chemistry,

with half to
Dr Kary B. Mullis, La Jolla, California, U.S.A.,
for his invention of the polymerase chain
reaction (PCR) method,

and half to
Professor Michael Smith, University of British
Columbia, Vancouver, Canada, for his fundamental
contributions to the establishment of
oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis Kary B. Mullis Michael Smith
and its development for protein studies.

Decisive progress in gene technology through two new methods:

the polymerase chain reaction (PCR) method and site-directed
mutagenesis
www.nobelprize.org
Lanjutan….
• Dikembangkan tahun 1985 oleh
Kary B. Mullis, seorang peneliti dari
CETUS Corporation.
• Fragmen DNA sepanjang 110 bp (5 X
10-19 mol) dapat digandakan menjadi
200.000 kali selama 220 menit
(Mullis & Faloona, 1989).
Komponen proses PCR:
1. DNA cetakan/template, fragmen
DNA yang akan dilipatgandakan.
2. Primer, sekuen nukleotida pendek
(15-25 nukleotida).
3. Deoksiribonukleotida trifosfat
(dNTP), terdiri atas dATP, dCTP,
dGTP dan dTTP.
4. Enzim Taq DNA polimerase
Komponen lain (wajib ada):
• Larutan buffer
Komposisi stok:
100 mM Tris-HCl pH 8.3 Membantu proses
500 mM KCl penempelan primer

15 mM MgCl2: membantu aktivitas Taq polimerase

0.1% (b/v) gelatin/BSA: kestabilan Taq polimerase
Mempertahankan
Prinsip dasar PCR:
1. Denaturasi
2. Renaturasi/Annealing
3. Ekstensi (Extension)

Satu siklus PCR terdiri dari denaturasi,

annealing dan ekstensi.
1. Denaturasi
• Proses pemisahan DNA template
untai ganda (double stranded)
menjadi tunggal (single stranded).
• Dilakukan dengan menggunakan
suhu 95°C selama 1-2 menit.
1. Denaturasi…(lanjutan)
5’ 3’
Target sequence + CGTCAATGGT
ATTCCAGAGC + Target sequence
3’ 5’

DNA diinkubasi pada

suhu 95°C selama 1-2’

5’ 3’
Target sequence + CGTCAATGGT

ATTCCAGAGC + Target sequence

3’ 5’
2. Renaturasi/Annealing
• Suhu diturunkan menjadi 55°C,
primer akan “menempel”
(annealing) pada cetakan yang telah
terpisah menjadi rantai tunggal.
5’ 3’
Target sequence + CGTCAATGGT
3’ GCAGTTACCA 5’
5’ TAAGGTCTCG 3’
ATTCCAGAGC + Target sequence
3’ 5’
3. Ekstensi (Extension)
• Suhu inkubasi dinaikkan 72°C
selama 1,5 menit.
• DNA polimerase melakukan proses
polimerasi/sintesis rantai DNA yang
baru, dimulai dari primer.
3. Ekstensi (Extension)…(lanjutan)
5’ 3’
Target sequence + CGTCAATGGT
Taq 3’ GCAGTTACCA 5’
polymerase 5’ TAAGGTCTCG 3’
ATTCCAGAGC + Target sequence
3’ 5’

5’ 3’
newly made DNA + CGTCAATGGT
ATTCCAGAGC + newly made DNA
3’ 5’
• Animasi: PCR
PCR Thermal Cycler
PCR Thermal Cycler
Jenis enzim yang digunakan dalam PCR:
• Taq DNA Polimerase
• Tth DNA Polimerase
• Pwo DNA Polimerase
• Pfu dan Tli DNA Polimerase
Taq DNA Polimerase
• Diisolasi dari Thermus aquaticus
• BM = < 95 kD
• Kemampuan: Tahan terhadap suhu
tinggi yang diperlukan untuk
denaturasi DNA template.
• Suhu optimum untuk sintesis DNA
75 – 80°C.
Lanjutan…
• Tween 20 (0.5 – 1%), DMSO, gelatin,
gliserol dan amonium sulfat dapat
meningkatkan efesiensi Taq
Polimerase.
• Mampu menambahkan satu
nukleotida pada ujung 3’ dari DNA
baru, sehingga menghasilkan sticky
end.
Lanjutan…
• Aktivitasnya dipengaruhi Mg2+,
maksimal konsentrasi 2.0 mM, jika
konsentrasi dNTPs = 0.7-0.8 mM.
• Konsentrasi Taq polimerase yang
dianjurkan 1 – 2 unit per 50 – 100 µl
reaksi.
Tth DNA Polimerase
• Diisolasi dari eubakteri termofilik
Thermus thermophilus HB8.
• Menunjukkan aktivitas tertinggi
pada pH 9 (25 °C) dan suhu sekitar
75 °C.
• Mempunyai aktivitas transkriptase
balik (reverse transcriptase).
Pwo DNA Polimerase
• Diisolasi dari archaebakteri
hipertermofilik Pyrococcus woesei.
• Waktu paruh 2 jam pada suhu 100
°C.
• Tingkat kesalahan amplifikasi 10 %.
• Hasil amplifikasi = molekul DNA
dengan blunt end.
Pfu dan Tli DNA Polimerase
• Pfu Polimerase diisolasi dari
Pyrococcus furiosis, BM = 92 kD, aktif
pada suhu 74 °C, produk
amplifikasinya = blunt end.
• Tli Polimerase diisolasi dari
Thermococcus litoralis, BM = 90 kD,
sangat stabil terhadap panas sampai
100 °C.
Perkembangan PCR

• Menggunakan lebih dari

satu primer.
• Digunakan untuk Multiplex
• Digunakan untuk studi
mengukur PCR
identifikasi MH.
kuantitas hasil
amplifikasi DNA.
• Menggunakan
fluorescent dyes,
seperti Sybr PC • Untuk
amplifikasi
Green, EvaGreen. 
R cDNA
• Analisis
Real
Time- RT-PCR ekspresi gen
PCR
APLIKASI PCR
Aplikasi PCR:
1. Melipatgandakan DNA genom 
Analisis DNA genom untuk studi
penyakit dsb.
2. Amplifikasi ujung cDNA  kloning
dari sel eukariotik.
RACE (Rapid Amplification of cDNA
Ends)  untuk menghasilkan cDNA
lengkap.
Lanjutan…
• Menghitung jumlah mRNA
• Analisis sidik jari DNA (DNA
Amplification Finger Printing/DAF)
• PCR untuk melakukan mutagenesis
secara terarah (site-directed
mutagenesis).
410 bp
First isolation of Photobacterium damselae ssp. damselae from cultured
redbanded seabream, Pagrus auriga Valenciennes, in Spain (Labella et al.,
2006) – Journal of Fish Diseases, 26: 175-179.

ureC
16S rRNA

Multiplex-PRC assay of redbanded seabream isolates. Lanes: MW

(Sigma); 1. negative control; 2. P. damselae ssp. piscicida ATCC 17911;
3. P. damselae ssp. damselae ATCC 33539; 4-8. redbanded seabream
isolate (Labella et al., 2006).