PRAKTIKUM : DETEKSI

GEN HBSAG
Sitti Romlah, M.Si
 PRAKTIKUM PCR
(POLYMERASE CHAIN
REACTION)
Sitti Romlah, M.Si
 PCR

• Metode penggandaan in vitro

• Memungkinkan amplifikasi molekul DNA spesifik melalui sintesis DNA
• Menjadi metode paling populer dalam bidang penelitian biologi.
• Mengapa ?
 KARENA

• 1. Simple
• 2. Kemampuan tinggi dalam hal:
• A. sensitive – sensitivity
• B. specific – specificity
• C. reliable – reliability; fidelity

• 3. Cepat
 PCR
Suatu proses amplifikasi / penggandaan untai DNA yang dilakukan secara in vitro dalam waktu relatif singkat

Prinsip PCR :

Penggandaan / amplifikasi untai DNA dengan melibatkan sepasang primer spesifik yang menempel pada ujung DNA
target dan dibantu oleh enzim Taq Polimerase

Terjadinya PCR melalui tahap :

1. Denaturasi : pemecahan untai tunggal DNA→ untuk memisahkan kedua untai DNA secara sempurna maka kedua
primer dapat menempel, pada siklus selanjutnya, denaturasi dilakukan pada temperatur 90 – 95˚C

2. Annealing : penempelan primer pada kedua ujung DNA target→(37 – 60˚C), tergantung primer yang digunakan)
karena tahap ini menentukan spesifitas PCR dan perhitungan Tm (temperature mellting ) temperatur peleburan

3. Ekstensi / polimerisasi : pemanjangan untai DNA →sebagai tahap pemanjangan yang dilakukan pada temperatur 72˚C
(temperatur optimum untuk Taq polimerasee Ekstensi pada siklus terakhir, dilakukan sampai 10 menit, untuk menjamin
ekstensi sempurna

Siklus Denaturasi-Annealing-Extention pada umumnya dilakukan sebanyak 30-40 kali

 PCR
Denaturasi
100
94 oC

Suhu
50

0
Waktu
3’ 5’

Panas

5’ 3’
 PCR
Denaturasi
100
94 oC

Suhu
Ekstensi
Annealing 72 oC
50 50 oC
4 oC
0
Waktu
3’ 5’
5’

5’
5’ 3’
 Siklus 22
Untai DNA Siklus 4 Dan Siklus
target Siklus 1 Siklus 33 4 seterusnya
 LANGKAH UJI PCR

• Isolasi DNA/RNA
• Reverse Transkriptase (untuk sampel RNA)
• PCR
• Elektroforesis Produk PCR
• Dokumentasi Hasil Elektroforsesis
 KOMPONEN PCR

DNA Polimerase

DNA polimerase bersifat termostabil dari bakteri termofilik thermus aquaticus (Taq polimerase),
stabil sampai temperatur 95 ˚C

Deoksiribonukleosida trifosfat (dntp) : datp, dgtp, dctp, dttp

Buffer 10X dan Magnesium klorida

• - Tris HCl pH 8,3

• - MgCl2, Mg2+ akan menstimulasi aktivitas polimerase, meningkatkan Tm untai ganda DNA dan
berinteraksi dengan cetakan/template
 PCR BUFFER
• Komponen Dasar
• 20 mM Tris-HCL pH 8.4
• 50 mM KCl
• 1.5 mM MgCl2

• Magnesium – Konsentrasi Mg yang rendah akan menghasilkan produk PCR yang

sedikit. Konsentrasi Mg yang tinggi dapat meningkatkan produk PCR non spesifik
dan kemungkinan terbentuk kesalahan pasangan basa.
• Zat tambahan dalam kondisi tertentu:
• Helix Destabilisers - Digunakan ketika konsentrasi G/C tinggi:
• dimethyl sulphoxide (DMSO),
• dimethyl formamide (DMF),
• urea
• formamide
• Long Targets >1kb. Formamide and glycerol
• Low concentration of template: Polyethylene glycol (PEG)
KOMPONEN PCR...
Templat DNA
- Sampel yang akan diperiksa (DNA/RNA hasil
isolasi/ekstraksi dari virus/bakteri/jaringan dll)

Primer
- Oligonukleotida sintetik, umumnya berukuran
antara 15 – 30 pb
- Primer yang berukuran lebih pendek, akan
memberikan spesifitas yang rendah
- Primer dengan ukuran lebih panjang tidak akan
meningkatkan spesifitas dan harganya lebih mahal
- Digunakan sepasang primer forward dan reverse,
mengapa?
 KETENTUAN PEMANJANGAN DNA

• DNA bersifat anti-parallel

• Satu rantai memiliki arah 5’ → 3’
• Rantai pasangannya memiliki arah berlawanan

• DNA polymerase selalu bergerak satu arah(dari 5’ → 3’)

5’ 3’

3’ 5’
• https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
• https://www.youtube.com/watch?v=matsiHSuoOw
 DETEKSI GEN HBSAG MENGGUNAKAN
METODE PCR
• PERSIAPKAN :
1. ISOLAT DNA→ DARI HASIL ISOLASI DNA → metode kit → geneaid
2. REAGEN
3. Tahapan pcr → denaturasi :
annealling :
extention :
4. elektroforesis
REAGEN ( MASTER MIX)
DETEKSI GEN KAT G PADA MTB
TERIMA KASIH