ASISTENSI & COACHING

PERTANYAAN
1. Gimana caranya milih strain yg tepat
2. PCR
3. Cara milih enzim restriksi
4. Insersi gen kedalam plasmid
5. Perbanyakan plasmid tanpa melalui transformasi bakteri
6. Apakah screening dilakukan 2x? (Mengecek plasmid masuk ke bakteri
dan mengecek gen masuk kedalam plasmid)
7. Cara kerja PCR colony untuk tahu ekspresi gen
8. Metode transformasi yg tepat berdasar apa
9. Microarray untuk screening dan bedanya single transcript dan multiple
transcript untuk menentukan metode screening yg tepat
 STRATEGI KLONING
PENENTUAN DAERAH PEMOTONGAN PLASMID
ISOLASI GOI PERBANYAKAN PLASMID PENYISIPAN DAN ENZIM DENGAN ENZIM
RESTRIKSI RESTRIKSI

PCR GOI YANG DICEK DENGAN GEL

LIGASI GOI KE PLASMID TRANSFORMASI
DIBERISITUS RESTRIKSI ELEKTROFORESIS

SELEKSI ANTIBIOTIK
1. PEMILIHAN HOST CELL
Dipilih bakteri, karena murah
Laju replikasi cepat dan stabil
Struktur genom sudah diketahui
Tingkat efisiensi transformasi
tinggi
Mampu mengekspresikan gen
dengan baik
Contoh: E.Coli DH5
 2.PEMILIHAN PLASMID/VEKTOR
Recombinant DNA Technology= kloning suatu gen tertentu, untuk
mengklonnya dapat dilakukan dengan memasukkanya ke sel, untuk
kemudian mengcopy
Untuk memasukkan gen ke sel butuh: VECTOR (contoh bacterial plasmid)
Plasmid:
1. Circular (merupakan DNA addition instead of DNA si bakteri itu)
2. Double stranded
3. Replicates independently
4. Contai genes produce toxins, resistance to antibiotics, produce protein
that break down some compound
2.PEMILIHAN PLASMID/VEKTOR
Pertimbangan Komponen yang ada
1. Insert Size didalamnya:
2. Copy Number 1. ORI
3. Cloning Sites 2. Multiple Cloning Site
4. Antibiotic 3. Special toxins/resistency to
Resistence/marker buat certain antibiotics
screening
2.PEMILIHAN PLASMID/VEKTOR
3. PEMILIHAN ENZIM DAN SITUS RESTRIKSI
Enzim restriksi awalnya merupakan mekansime pertahanan sel dari
bacteriphages atau[un virus, karena nanti si enzim restriksi akan
memotong viral DNA, jadinya inaktif
ENZIM RESTRIKSI akan cut specific PALINDROMIC SECQUNECES DNA
Bisa sticky ends, bisa blunt ends
Prefer ke sticky, karena lebih kuat tidak gampang putus
3. PEMILIHAN ENZIM DAN SITUS RESTRIKSI
Pertimbangan:
1. Apabila terdapat opsi untuk enzim yang menghasilkan sticky atau
blund, maka pilh yang sticky
2. Situs pengenalan restriksi tidak terdapat di gen
3. Kompatibel dengan plasmid yang dipilih
3. PEMILIHAN ENZIM DAN SITUS RESTRIKSI
 4. PEMBUATAN PRIMER UNTUK PENYISIPAN
GEN KEDALAM VECTOR
Rule of Thumbs: Perhitungan TM
1. Panjang Primer 18-30 nukleotida = 2 + + 4 +
2. Kandungan GC 40-60% 41 + 16,4
= 64,9 +
3. Tm= 55-60 0C
4. Selisih Tm forward dan reverse itu
50C Perhitungan GC content
Syarat lain: +
% = 100%
1. Tidak terdapat hairpin structure
2. Dimerisasi kecil
3. Ujung primer G/C, stronger bond
4. PEMBUATAN PRIMER UNTUK PENYISIPAN
GEN KEDALAM VECTOR

Kodon STOP:
TAG, TAA, TGA

Kodon START:
ATG
 4. PEMBUATAN PRIMER UNTUK PENYISIPAN
GEN KEDALAM VECTOR
Forward Primer

5 Extension Situs Restriksi Enzim Kodon Start GOI 3

Reverse Primer
Komplemen
5 Extension Situs Restriksi Enzim Kodon Stop
GOI 3
5. TEKNIK PCR
Teknik amplifikasi DNA untuk
segmen DNA spesifik, cepat &
efisien
Dapat mengcopy hingga jutaan
kopi dari single segment DNA
Component needed
1. Molekul DNA Target
2. Sepasang primer
3. DNA Polimerase
4. dNTPs
Komponen Tambahan: Buffer & Ion
Logam
Step PCR:
1. Denaturation (Strand Separation)
2. Annealing (Primer Hybridzation)
3. Extension (DNA Synthesis)
Total Copies
2 =
5. TEKNIK PCR
5. TEKNIK PCR
TAQ POLIMERASE PFU POLIMERASE

Error Tinggi Error rendah

Cepat Lambat

Kurang Akurat Akurat

Tidak terlalu tahan panas Tahan panas dalam waktu yang lama

Thermus Autiqus Pyrococcus furiosy

5. TEKNIK PCR-VIDEO
 6. TRANSFORMASI
Teknik Langsung (Tanpa Perantara)
Ex: heat shock, penembakan eksplan gen, microinjection, elekroporasi
Teknik Tidak Langsung (Perantara)
Ex: pakai bakteri (Agrobacterium tumefaciens)

Alami: Konjugasi (kontak fisik); transduksi (infeksi bakteri)

6. TRANSFORMASI
7. SELEKSI
SELEKSI ANTI BIOTIK
BLUE-WHITE SCREENING
REPLICA PLATING
VIDEO KLONING