Nama Mafiq Aufa Hilmi

NIM 205100501111022
Kelas RE
Kelompok RE7

A. Hasil dan Pembahasan

Pertanyaan
1. Jelaskan 3 fase dalam proses PCR

(Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi
DNA dengan cara in vitro. Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu
terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat yaitu denaturasi, annealing,
dan ekstensi (Yuenleni, 2019). Denaturasi DNA merupakan adalah tahap penguraian
utas ganda DNA menjadi utas tunggal pada suhu tinggi, yaitu 94°C sampai 98°C.
Renaturasi (membentuk DNA untai ganda) akan terbentuk dengan cepat jika proses
denaturasi berjalan tidak sempurna, hal ini akan mengakibatkan gagalnya proses PCR.
Kemudian, dilanjutkan proses annealing, proses annealing merupakan proses
penempelan primer pada DNA template. Suhu annealing tergantung pada jumlah dan
komposisi nukleotida penyusun primer. Sekuens DNA dalam masing-masing primer
sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya
struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR. Setelah tahap
annealing kemudian dilanjutkan dengan tahap ekxtention atau pemaanjangan primer.
Pada tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari
ujung 3’ (Herman dkk, 2018).

2. Apa yang terjadi jika jumlah siklus lebih dari 60 cycle?

Jumlah siklus pada proses PCR umumnya sebanyak 25 hingga 35 siklus dengan siklus
optimal adalah 30 siklus dan jumlah siklus maksimum umumnya 60 siklus. Apabila
dilakukan PCR hingga lebih dari 60 siklus kemungkinan besar justru tidak akan
memberikan peningkatan jumlah amplicon yang berarti, Namun justru akan
memperbesar kemungkinan peningkatan jumlah produk non-target. Selain itu, jumlah
siklus berlebih dapat mengurangi sumber dNTP’s yang dapat merusak DNA hasil
amplifikasi. Umumnya proses PCR akan mencapai amplifikasi yang cukup setelah 20
sampai 40 siklus (Romanini et al, 2011).

3. Jelaskan apa yang terjadi jika suhu annealing diubah menjadi lebih tinggi daripada
extension namun lebih rendah dari suhu denaturasi?

Annealing merupakan salah satu tahapan dalam proses PCR dimana pada tahap
tersebut terjadi penempelan primer pada DNA template. Suhu annealing bergantung
pada panjang ukuran primer dan persentase GC pada primer. Suhu yang digunakan
pada proses annealing umumnya berkisar antara 53-60oC dengan suhu optimum sekitar
55oC. Apabila, suhu annealing terlalu tinggi akan menghasilkan hibridisasi antara
primer-DNA template sehingga mengakibatkan rendahnya produk PCR, sedangkan
annealing yang terlalu rendah akan mengarah pada amplifikasi DNA yang tidak
spesifik yang disebabkan oleh tingginya kemungkinan kesalahan penempelan primer
pada DNA template (Prakoso dkk, 2016).
 Nama Mafiq Aufa Hilmi
NIM 205100501111022
Kelas RE
Kelompok RE7

4. Apakah yang terjadi bila primer terlalu panjang atau terlalu pendek?

Primer merupakan salah satu komponen utama yang digunakan dalam PCR.
Panjang pendeknya primer yang digunakan dalam PCR akan mempengaruhi
sensitivitas dan spesifitas reaksi PCR. Rancangan primer yang kurang baik
menyebabkan reaksi PCR tidak bekerja dengan baik sehingga menyebabkan produk
PCR yang tidak spesifik dan atau terbentuknya primer dimer. Panjang primer yang
digunakan dalam proses PCR adalah sekitar 18-30 basa. Apabila primer yang
digunakan terlalu panjang maka akan tidak akan berpengaruh dengan signifikan.
Sedangkan bila panjang primer lebih pendek maka akan mengurangi spesifitas
primer sehingga dapat menyebabkan terjadinya mis primming. Mis priming
menghasilkan DNA dengan urutan basa yang salah sehingga DNA hasil amplifikasi
tidak sama dengan DNA yang dimaksud (Sasmito et al, 2014).

5. Sebutkan fakotr-faktor penyebab proses PCR tidak berhasil!

Pada teknik PCR terdapat berbagai faktor yang mempengaruhi optimasi PCR
sehingga bisa mempengaruhi ketidakberhasilan proses PCR. Faktor-faktor tersebut
antara lain yaitu, jenis DNA polymerase, suhu, primer, waktu, jumlah siklus, DNA
templat; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida
(MgCl2) (Zedta & Setyadji, 2019).
 Nama Mafiq Aufa Hilmi
NIM 205100501111022
Kelas RE
Kelompok RE7

KESIMPULAN

Pada praktikum kali ini dilakukan Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR merupakan
teknologi yang mampu melipat gandakan secuplik fragmen DNA yang terdapat dalam
komplek makromolekul genom dari berbagai sumber (hewan, tumbuhan, bakteri, dan
virus) menjadi 2 kali lipatnya secara enzimatis. Tujuan dari praktikum Polymerase Chain
Reaction (PCR) adalah supaya praktikan mampu mengidentifikasi peralatan yang
diperlukan untuk analisis dengan PCR, mampu mengoperasikan peralatan yang digunakan
untuk analisis dengan PCR dengan benar, mengetahui prinsip dasar analisis dengan PCR,
serta mengamplifikasi fragmen DNA coloni Lactobacillus plantarum menggunakan
metode PCR. Prinsip dari PCR, yaitu teknik yang melibatkan beberapa tahapa (denaturasi,
annealing, dan ekstensi) yang berulang dan pada setiap siklus terjadi penggandaan jumlah
target DNA untai ganda yang kemudian dipisahkan dengan denaturasi termal dan
didinginkan hingga mencapai suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel
pada daerah dari target DNA. Adapun hasil yang didapatkan dari praktikum PCR kali ini
adalah diketahui bahwa dalam PCR terdapat 3 fase, yaitu denaturasi, annealing, dan
extension. Jumlah siklus dalam PCR yang optimal adalah 25-35 dan jumlah siklus yang
lebi dari itutidak akan memberikan pengaruh yang signifikan dan justru bisa menimbulkan
terbentuknya amplikkon tidak berguna.