Universitas Gadjah Mada

Fakultas Biologi
Departemen Biologi Tropika / Program Studi Biologi
FORM EVALUASI PRAKTIKUM BIOINFORMATIKA (BIC 30007) T.A. 2020/2021
Nama Praktikan : Jihan Sekar Wijayanti NIM: 18/423344/BI/09978
Nama Asisten : Ultha Rifqy Riswanta
Topik : Primer Design & in silico Molecular Cloning
Checklist
No Sub Capaian Pembelajaran Ket
(✔)

1 Mahasiswa mampu mendesain primer secara manual

Sertakan screenshot bukti!
Jawab pertanyaan berikut:
a. Jelaskan perbedaan cara mendesain primer forward dan reverse pada benchling
Forward primer dibuat sebelum “start codon” sementara reverse primer dibuat
setelah “stop codon”. Cut site yang digunakan untuk desain primer forward
adalah ClaI, sedangkan cut site yang digunakan untuk desain primer reverse
adalah AlwNI

b. Jelaskan secara singkat tahapan pada reaksi PCR

PCR untuk mengamplifikasi suatu fragmen DNA, targetkan suatu lokus tertentu
(spesifik) yang akan diamplifikasi. Amplifikasi DNA yang disimulasikan dengan
benchling sehingga bisa dilihat amplikan yang dihasilkan tanpa harus melakukan
PCR ke lab.
Tahap-tahap dari PCR adalah sebagai berikut:
 Tahap denaturasi berlangsung pada suhu tinggi 94–96°C. Tahapan ini berfungsi
untuk memutus ikatan hydrogen heliks ganda DNA sehingga untaian DNA
terpisah.
 Tahap annealing berlangsung pada suhu antara 45–60°C. Tahap ini bertujuan
untuk penempelan oligonukleotida primer ke urutan target untai tunggal yang
mempengaruhi proses amplifikasi DNA.
 Tahap ekstensi berlangsung sekitar 72-78ºC. Tahap ini berfungsi untuk
perpanjangan primer oligonukleotida komplementer, membentuk untaian baru
dengan bantuan DNA polymerase/Taq polymerase

c. Jelaskan syarat primer PCR yang baik beserta alasannya

 Primer = sekuen nukleotida yang berukuran 18-24 bp untuk reaksi PCR.
 Memilih sekuen/urutan template DNA dari gen tertentu. Urutan primer
dipastikan dan didesain primer forward (berjalan dari 5’ ke 3’) dan reverse
(berjalan dari 3’ ke 5’).
 40-60% G/C content = jika kebanyakan akan membentuk primer dimer.
 Primer dimulai dan diakhiri dengan 1-2 pasang G / C atau disebut penjepit GC
(harus ada di primer forward dan primer reverse).
 Melting temperature (Tm) 50-60°C. Pasangan primer harus memiliki Tm dalam
jarak 5 ° C satu sama lain.
 Pasangan primer tidak boleh memiliki daerah komplementer. Agar tidak
berikatan satu sama lain sehingga tidak mengganggu amplifikasi.
2 Mahasiswa mampu menghasilkan fragmen PCR
Sertakan screenshot bukti!
Jawab pertanyaan berikut:
a. Berapa panjang sekuens DNA (base pair) pada template dan pada produk PCR yang
digunakan pada praktikum kali ini? Berapa selisih nukleotidanya?
Panjang sekuen DNA template adalah 616 bp, sedangkan panjang sekuen [produk
PCR yang digunakan adalah 613 bp. Selisih nukleotidanya adalah 3 bp

b. Informasi primer apa saja yang dapat diperoleh di bagian kiri bawah benchling?
Panjang nukleotida template DNA, GC content, suhu melting, panjang nukleotida
produk PCR, posisi start dan end dari suatu primer.

c. Mengapa pada praktikum kali ini start codon atau stop codon harus dimuat atau
overlapping dengan primer forward atau reverse? (masih bingung hiksss)
Start codon dan stop codon merupakan bagian dari gen yang diinginkan untuk
diamplifikasi. Kodon start dimasukkan ketika gen/lokus tertentu tidak diekspresikan
dengan tag terminal N untuk memulai translasi, begitu pula dengan kodon stop yang
dimasukkan ketika terminal C tidak digunakan untuk meningkatkan efisiensi
penghentiam translasi. Primer forward berfungsi untuk menguatkan untai bawah
DNA yang berjalan dari ujung 3’ ke 5’. Primer reverse menguatkan untai
komplementer atas DNA yang berjalan dari 5’ ke 3’. Primer-primer ini menghasilkan
untai -untai baru DNA. Kodon dilakukan overlapping dengan primer agar membentuk
produk fusi gen dalam panjang yang penuh dari fragmen DNA yang besar dan tunggal
kemudian produk tersebut diamplifikasi, diekstensi dengan DNA polimerase
membentuk molekul rekombinan.
Mahasiswa mampu mengintegrasikan primer, fragmen, dan protokol ke dalam notebook
3 lab
Sertakan screenshot bukti!
Jawab pertanyaan berikut:
a. Primer yang digunakan pada praktikum ini mengacu pada fragmen DNA
Fragmen DNA JfyP

b. Bagaimana cara membuat notebook baru pada benchling?

Klik pojok kiri tanda plus (+), lalu pilih menu Entry. Blank entry diklik kemudian diberi
nama untuk notebook baru. File- file yang sudah dibuat (primer forward, primer
reverse, tempalte gen/lokus tertentu, produk desain primer gen/lokus tertentu)
didrag dan didrop dalam notebook serta diberi label dan deskripsi. Hal ini dilakukan
agar dapat tersimpan dengan rapi.

c. Apa fungsi protokol integrasi primer dalam notebook benchling (dry lab) kaitannya
dengan penelitian laboratorium (wet lab)?
Integrasi primer pada benchling notebook dilakukan agar dapat tersimpan dengan
rapi, menghemat waktu dalam merekam data dan protokol eksperimental. Proses
set-up dan perhitungan untuk experimental PCR mastermix dilakukan untuk
menghitung beberapa jumlah primer mastermix yang dibutuhkan. Perhitungan
dilakukan untuk volume yang diperlukan pada reagen umum (mastermix) PCR yaitu
air suling, buffer, DNA polymerase, dan dNTP yang disatukan untuk memastikan
efisiensi reaksi yang konsisten dan mengurangi langkah pencampuran secara
 keseluruhan.
Mahasiswa mampu merencanakan dan merancang strategi kloning molekuler
4.
Sertakan screenshot bukti!
Jawab pertanyaan berikut:
a. Apa saja syarat plasmid fungsional?

Plasmid berukuran kecil, memiliki jumlah salinan yang tinggi, memiliki multiple
restriction site yang unik (single cleavage site untuk satu atau beberapa enzim
restriksi yang digunakan) sebagai tempat fragmen DNA dapat disisipkan, memiliki
origin of replication sebagai pemastian bahwa vektor direplikasi secara independen
di dalam sel dari kromosom bakteri, memiliki marker yang dapat dipilih untuk
pemilihan atau identifikasi setiap sel yang berisi vektor.

b. Apa insert gene dan vektor plasmid yang kita gunakan pada praktikum kali ini?

Gen JfyP fiksi (insert gene), plasmid = pET 31b dengan penggunaan situs restriksi ClaI
dan AlwNI.

c. Mengapa penyisipan harus dilakukan pada Multiple Cloning Site?

Multiple restriction site yang unik (single cleavage site untuk satu atau beberapa
enzim restriksi yang digunakan) sebagai tempat fragmen DNA dapat disisipkan, dapat
menghindari kerusakan pada gen-gen struktur fungsional.
Mahasiswa mampu mengintegrasikan plasmid maps ke dalam notebook benchling
5.
Sertakan screenshot bukti!
Jawab pertanyaan berikut:
a. Apa fungsi notebook pada benchling?
Benchling's Notebook memiliki sistem user interface yang intuitif untuk
memudahkan dalam perekaman catatan dan hasil. Data notebook disimpan dalam
entri notebook individual. Notebook dapat berfungsi pada pengguna untuk menulis
satu entri per percobaan, dan menyimpan semua entri terkait dalam sebuah proyek
atau folder dengan rapi.
b. Apa yang dimaksud plasmid maps?
Peta plasmid adalah representasi grafis dari plasmid, yang menunjukkan lokasi
landmark utama yang dapat diidentifikasi pada DNA seperti situs enzim restriksi, gen
yang diminati, nama dan panjang plasmid, dll.
Ketera Tanda Tangan
Tanggal Pengesahan Paraf Asisten Praktikum
ngan Mahasiswa
Otorisasi
Lampiran

Nomor 1
Nomor 2

Nomor 3
Nomor 4
Assembly Wizard
Nomor 5

Plasmid Map