UTS REKAYASA GENETIKA

Nama : Callista Dara Ninggar Tanggal: 22 Oktober 2019

NPM : 1706044591

1. Buatlah diagram alir untuk mengerjakan tugas ini?

Menentukan ORF Insert dari kodon

start hingga kodon stop

Menghitung panjang bp dan

jumlah asam amino yang terbentuk

Mencari tau jenis protein x

Menentukan restriction site pada

plasmid dan insert

Memilih Restriction Enzyme

Membuat primer (memastikan

syarat GC dan Tm terpenuhi)

Menentukan Tm dan Suhu PCR

lainnya

Memastikan transformasi berhasil

2. Mencari ORF

Gambar 1. Pembandingan ORF

(https://web.expasy.org/translate/)

Yang dipilih adalah ORF 1 karena memiliki length yang paling panjang.

Gambar 2. Open Reading Frame

https://www.addgene.org/browse/sequence/7048/

3. Buatlah desain primer dan tentukan suhu reaksi PCR yang harus dilakukan!
 - Menentukan enzim restriksi

Yang digunakan adalah BamHI dan EcoRI.

Jarak keduanya adalah 1118-951 = 167 bp.

Forward Primer

Enzim : BamHI

Restriction Site : GGA TCC

5’ TC GGA TCC ATG AAA TTC TTG 3’

12
GC Content: 20 𝑥 100% = 60%

𝑇𝑚 = [4(𝑛𝐺 + 𝑛𝐶)] + [2(𝑛𝐴 + 𝑛𝑇)] = [4(8 + 4)] + [2(8)] = 48 + 16 = 64℃

Reverse Primer

Enzim : EcoRI

Restriction Site : GAA TCC

5’ CAA CAG GGT TAA GAA TCC AG 3’

3’ GTT GAC CCA ATT CTT AGG TC 5’
5’ CT GGA TTC TTA ACC CAG TTG 3’
9
GC Content: 20 𝑥 100% = 45%

𝑇𝑚 = [4(𝑛𝐺 + 𝑛𝐶)] + [2(𝑛𝐴 + 𝑛𝑇)] = [4(9)] + [2(11)] = 36 + 22 = 58℃

Suhu PCR

Proses Waktu Suhu

Denaturasi 2 5 menit 92℃
Denaturasi 1 30 detik 92℃
Annealing 30 detik 58 - 5 = 53℃
Elongasi 1 Tergantung pada panjang 72℃
base pair
Elongasi 2 1 menit 72℃
Terminasi Hingga berhenti 4℃
 4. Bagaimana memastikan bahwa proses transformasi vector yang telah dibuat itu berhasil?

Untuk memastikan bahwa proses transformasi vektor yang dibuat berhasil maka
digunakan metode restriction digest. Metode ini merupakan teknik analisa hasil PCR
dengan elektroforesis gel. Hasil dari elektroforesis akan dibandingkan dengan DNA
Marker yang merupakan DNA koloni bakteri yang diketahui mengandung hasil
rekombinan. Kemungkinan kesalahan pada ligasi vektor antara lain:
a. Plasmid bergabung dengan insert
b. Gen of interest menyambung dengan sesamanya
c. Gen of interest menyambung dengan sesama vektor
Bakteri tersebut dapat dikembangkan dalam medium khusus dengan antibiotik, sehingga
bakteri yang hidup dapat dideteksi.

5. Apa protein X tersebut? Berapa panjang gen protein X yang akan berubah menjadi asam
amino? Berapa jumlah asam amino yang terkandung di dalam gen tersebut, bagaimana cara
untuk memastikan bahwa gen tersebut terekspresi di dalam sel E. coli?
a. Protein X tersebut adalah metilin dari Apis cerana
b. Panjang gen protein X yang berubah menjadi asam amino adalah 70 based pair
c. Jumlah asam amino yang terkandung di dalam gel adalah 71
d. Cara memastikan gen terekspresi :
i. Memasukkan promotor melittin dari Apis cerana
ii. Menginduksi dari promotor lain.

DAFTAR PUSTAKA

Addgene. 2019. V622 pGEX-2TK-LP - Acceptor. [online] Available at:

https://www.addgene.org/browse/sequence/7048/ Accessed on: 21st October 2019.

Snapgene. 2019. Plasmid File: pGEX-6P-1. [online] Available at:

https://www.snapgene.com/resources/plasmid-
files/?set=pgex_vectors_(ge_healthcare)&plasmid=pGEX-2TK Accessed on: 21st October 2019.