Departemen Teknik Kimia, Program Studi S1 Teknik Bioproses

Ujian Akhir Semester

Semester Gasal 2020/2021

Mata Kuliah (Kode) : Rekayasa Genetika (ENBE605018)

: - Dr. Muhamad Sahlan S.Si., M.Eng.
Dosen
- Dr. Kenny Lischer, ST., MT..
Hari, Tanggal : Selasa, 12 Januari 2021 Waktu : 13.00 – 15.00 WIB
Kompetensi (CPL) : K10 Sifat Ujian : Open/Close
Nama : Andika Mardianto NPM : 1806207362

Petunjuk Ujian
1. Berdoa sebelum mengerjakan ujian akhir semester ini.
2. Baca dan bubuhkan tanda tangan secara digital pakta integritas mengikuti ujian akhir
semester ini.
3. Jawablah pertanyaan ini dengan ringkas dan tepat.
4. Jawablah soal dibawah soal yang tersedia.
5. Unggah file jawaban (.pdf) di emas.ui.ac.id, paling lambat 12 Januari 2021 jam 15.00
WIB. Yang melebihi waktu unggah dianggap tidak mengikuti ujian.

1
 PAKTA INTEGRITAS
PESERTA UJIAN AKHIR SEMESTER
Mata Kuliah Rekayasa Generika

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Andika Mardianto
NPM : 1806207362
Program Studi : S2 Teknik Kimia/S1 Teknik Kimia/ S1 Teknik Bioproses
Dengan ini menyatakan bahwa saya:
1. Berkomitmen untuk menjaga integritas dalam melaksanakan ujian;
2. Berkomitmen untuk melaksanakan ujian secara mandiri, jujur, dan penuh tanggung
jawab;
3. Bekomitmen untuk tidak membantu, meminta bantuan, dan atau bekerja sama dengan
siapapun dalam melaksanakan ujian ini;
4. Mentaati segala ketentuan yang telah ditetapkan oleh Universitas Indonesia;
5. Mengunggah jawaban soal sesuai dengan waktu yang ditentukan
Demikian pakta integritas ini kami buat dengan sesungguhnya, apabila melanggar pakta
integritas ini, saya bersedia dikenai sanksi sesuai dengan peraturan yang berlaku di lingkungan
Universitas Indonesia.

Kotabumi, 12 Januari 2021

Pembuat pernyataan,

(Andika Mardianto)
Catatan:
Dibuat tanpa materai

2
Soal-soal dan Jawabannya

Apoptin adalah protein yang sudah terbukti secara in vitro maupun in vivo dapat menginduksi
kematian sel kanker baik yang berupa tumor maupun yang sudah bersifat kanker. Selain sebagai
obat, apoptin juga berpotensi sebagai alat atau bahan pendiagnosis keberadaan sel kanker. Untuk
memudahkan memproduksi protein apoptin yang sudah ditambahkan protein yang berfluoresensi
ini maka digunakan tanaman tembakau sebagai sel inangnya (host sel).
Pertanyaan.
1. Tuliskan rancangan kloning apoptin yang sudah ditambahkan protein berfluorensensi
(Green fluorescence Protein (GFP)) pada tanaman Tembakau dengan konsep rekayasa
genetika? (K10, 2.2.5, 20%)
Jawaban:

1. Preparasi
a. Menyiapkan gen apoptin dan GFP
 mengisolasi gen apoptin serta GFP dari sumbernya.
 Membeli dari produsen
b. Mendesain primer untuk kedua gen
2. Modifikasi apoptin dengan GFP di dalam PCR.
GFP disambungkan pada N-terminal Apoptin menggunakan enzim ligase yang sesuai.
3. Duplikasi GOI di dalam E.coli
a. Insersi GOI ke dalam vektor plasmid.
b. Transformasi plasmid ke dalam E.coli
c. Isolasi plasmid dari E.coli
Seleksi dengan blue-white screening dan blotting untuk mendapatkan gen yang
diinginkan
4. Transfer GOI ke dalam Agrobacterium tumefaciens
GOI ditransfer ke dalam Agrobacterium menggunakan Vektro biner(Triparental Mating)
dengan bantuan heat shock.
5. Infeksi Agrobacterium ke tanaman tembakau
a. Preparasi Tembakau

3
 Sel diambil dari daun muda karena kandungan sel meristem yang banyak. Daun
diambil dengan metode leaf disk.

b. Merendam sel tembakau dalam kultur agrobacterium

6. Regenerasi dan konfirmasi
a. Ko-kultivasi, eksplan ditumbuhkan dalam media induksi kalus
b. Eliminasi : penghilangan agrobacterium dari eksplan
c. Kalus kembali ditanam hingga menjadi tunas dengan sub kultur
d. Seleksi awal: tunas ditumbuhkan dalam antibiotic
e. tunas ditumbuhkan menjadi plantet hingga siap dipindahkan ke media

4
2. Tentukan primer-primer yang digunakan untuk mengkloning protein apoptin tersebut ? (K10,
2.2.4, 20%)
Jawaban:
Primer dibuat untuk kedua gen, apoptinn dan GFP

A. Apoptin
Dari sekuens Apoptin
Forward :
Enzim Restriksi
BamHI
AAG CTT ATG AAC CCT CTC CA
5’ Start codon 3’
Panjang primer = 20 bp
GC content = 9/20 x 100% = 45%
Tm = 580C
Reverse:
CAG TCT TAT ACA CCT TCT TG
5’ 3’
Panjang primer = 20 bp
GC content = 8/20 x 100% = 40%
Tm = 560C

B. GFP
Dari sekuens GFP
Forward :
AGA CTG AGT AAA GGA GAA GA
5’ 3’
Panjang primer = 20 bp
GC content = 9/20 x 100% = 40%
Tm = 560C

Reverse

5
Enzim restriksi
HindIII
GGA TCC TCA TCC ATG CCA
5’ stop codon 3’
Panjang primer = 20 bp
GC content = 10/20 x 100% = 50%
Tm = 560C

6
3. Jelaskan metode kloning yang anda gunakan untuk memproduksi apoptin pada
tanaman tembakau! (K10. 2.2.5, 20%)
Jawaban:
Metode kloning : PCR, metode ini dilakukan di dalam sebuah sentrifuge. Dimana Gen Apoptin
yang telah di modifikasi dengan GFP direplikasi melalui reaksi PCR. Setelah jumlah yang
cukup, gen selanjutnya akan diperbanyak melalui insersi ke dalam sel bakteri E.coli. bakteri ini
dipilih karena diketahui mampu untuk mereplikasi plasmid(tergantung strain yang dipilih) yang
tergandung dan waktu pembelahannya yang relatif sangat cepat. Dari sini didapatkan plasmid
yang cukup banyak sehingga dapat ditransfer ke dalam sel tanaman tembakau melalui metode
Agrobacterium tumafaciens

7
4. Bagaimana anda memastikan bahwa rekombinan apoptin tersebut berhasil diekspresikan oleh
sel inangnya? (K10. 2.2.5, 20%)
Jawaban:
Konfirmasi dapat dilakukan dengan banyak cara. Untuk seleksi di dalam sel Tembakau, sample
tumbuhan yang telah melewati seleksi awal diambil.
Seleksi awal berupa screening menggunakan marker GFP.
Screening dengan antibiotik dilakukan saat sample tumbuhan masih berupa kalus, sedangkan
untuk screening GFP, dilakukan pada tumbuhan dewasa. Screening GFP dilakukan dengan
menyinari sel dengan sinar UV. GFP akan terekspresikan jika didapat cahaya fluorescene hijau.
Jika dilakukan menggunakan mikroskop, cahya ini juga menunjukkan letak dari Apoptin(jika
ikut terekspresi)

Untuk konfirmasi secara molekular, dilakukan dengan cara gabungan SDS PAGE dan Western
Blotting.

Metode berbasis gel electrophoresis yang memanfaatkan perbedaan berta molekul untuk
mengetahui protein spesifik yang kita inginkan. Untuk dapat melakukan teknik ini, harus
dilakukan ekstraksi terlebih dahulu terhadap mutan E.coli yang kita dapat.

Berikut tahapan dari metode SDS PAGE,

Preparasi sampel:
1. buat larutan 100 μl dari sel tembakau.
2. Masukkan larutan buffer 20 μl.
3. Inkubasi sel pada air mendidih selama 5 menit untuk menghancurkan sel.
4. Sentrifugasi pada 1200 xg selama 30 detik.
5. Memasukkan Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) pada larutan yang akan mengubah protein
globular menjadi linier.

Elektroforesis
1. Memasukkan gel yang kita butuhkan ke dalam kolom elektroforesis.
2. Masukkan buffer 300 mL ke dalam kolom.
3. Masukkan sampel ke dalam kolom.

8
4. Hidupkan sumber tegangan 100 V hingga warna bermigrasi sampai ujung running gel (~15
menit).

5. Tingkatkan tegangan menjadi 200 V hingga warna bermigrasi sampai ujung bottom gel (~45
menit).

Pewarnaan
1. Buang running gel, sekat, dan glass plate dari kolom
2. Menambahkan 20 mL larutan pewarna bilas selama 30 menit
3. Buang larutan pewarna dan simpan noda yang tercipta
4. Tambahkan 5 mL larutan pembersih dan bilas selama 1 menit
5. Buang larutan pembersih dan masukkan lagi 30 mL larutan pembersih
6. Bersihkan perlahan hingga gel terlihat besih( 2jam)
7. Bunag larutan pembersih
8. Cuci dengan 30 mL DDI H20 selama 5 menit.
9. Keringkan gel pada 60 C selama 1 jam dengan Whatman Filter terletak dibawahnya dan
sedikit Seran membungkus gel

9
Hasil dari proses SDS PAGE berupa protein ladder. Misalkan protein yang kita inginkan berada
pada berat molekul 130 kDa, bukan berarti kita dapat memastikan bahwa protein yg kita
inginkan merupakan satu-satunya protein yang memiliki berat molekul 130 kDa. Dan karenanya,
proses SDS PAGE harus dilanjutkan ke tahap Western Blotting untuk benar-benar
mengkonfismasi keberadaan protein spesifik yang kita inginkan.

Contoh protein ladder

Sekarang protein telah terseparasi berdasarkan berat molekulnya di dalam gel. Selanjutnya
adalah melakukan transfer protein ini ke membran melalui proses Blotting. Transfer protein
paling umum menggunakan medan listrik sebagai perantaranya.

Membran merupakan material solid. Biasanya berupa nitroselulosa atau PVDF. Membran
merupakan material solid. Biasanya berupa nitroselulosa atau PVDF. Setelah protein bermigrasi
ke membran proses selanjutnya adalah pencucian serta blocking. Blocking bertujuan untuk
mengindari agar nantinya antibodi akan terikat ke daerah yang tidak spesifik dari membran.
Kemudian inkubasi dengan antibodi spesifik dengan untuk menguji apakah terjadi reaksi imun
dengan protein tertentu yang memiliki berat molekul yang kita inginkan.

10
Jika ditemukan reaksi imun dengan antibodi, maka kita dapat mengkonfirmasi keberadaan
protein dengan berat molekul yang kita inginkan.

11
5. Jelaskan vektor apa yang anda gunakan untuk memasukkan gen apoptin ke dalam sel tanaman
tembakau? (K10, 2.2.5, 20%
Jawaban:
Vektor : pBIN19
Keunggulan :
1. Memiliki repeat border, yaitu border kiri dan kanan dari T-DNA untuk menjadi tempat
penyisipan transgene dan marker untuk tanaman yang tepat dipilih.
2. Memiliki banyak cloning sites.
3. Memiliki gen resistensi terhadap kanamycin, yang akan berperan dalam proses seleksi
4. Memiliki promotor lacZ. Yang cocok digunakan untuk general expression seperti gen
apoption

pBIN19
sumber : snapgene

12
13