Laporan Praktikum Hari, Tanggal : Jum’at, 20 & 27 April 2018

Teknik Asam Nukleat PJP : Puspa Julistia P, M.Si

Asisten : Kharina MQ
Giga Genggam GG
Salma Adilah H
Fitria Zahra O

PEMBUATAN SEL KOMPETEN DAN TRANSFORMASI

Kelompok 2

Fatmawati G84150029
Krisdianty G84150032
Felix Martine G84150065
Aulia Ayu Rispriandari G84150012

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018
 PENDAHULUAN

Kloning merupakan pengembangbiakan suatu mahluk hidupyang sama

persis dengan induknya tanpa melalui pembuahan dengan teknik rekayasa
genetika. Kloning DNA merupakan proses penggandaan jumlah DNA
rekombinan melalui pengembangbiakan bakteri. Selain itu, penggandaan DNA ini
juga dapat dilakukan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)
(Riyadi et al. 2011).
Kloning dimanfaatkan sebagai terapeutik, reproduktif, dan replacement.
Kloning gen menghasilkan Salinan gen atau segmen DNA dan sel dewasa atau
punca dapat dimanfaatkan dalam bidang pengobatan. Kloning reproduktif
menghasilkan salinan hewan seutuhnya. Kloning sebagai replacement berfungsi
menggantikan bagian tubuh individu yang mengalami kerusakan atau gagal organ.
Secara umum kloning terbagi menjadi 3 jenis, yaitu kloning molekul, kloning sel,
dan kloning organisme (Wangko dan Kristanto 2010).
Kloning molekul digunakan untuk melakukan kloning fragmen DNA.
Kloning ini dilakukan dengan menggunakan bakteri atau plasmid. Secara umum
tahapan kloning ini ada 5, yaitu isolasi, fragmentasi, ligasi, transfeksi, dan seleksi.
Kloning sel bertujuan menghasilkan populasi dari sel tunggal. Teknik yang
digunakan untuk kloning sel adalah cincin kloning. Kloning organisme disebut
juga dengan kloning reproduksi yang bertujuan menghasilkan organisme
multiselular yang identic secara gentetiknya. Disebut dengan kloning reproduksi
karena kloning ini adalah reproduksi aseksual, tetapi tanpa melalui pembuahan
(Wangko dan Kristanto 2010).
Metode umum yang digunakan untuk melakukan kloning diantaraya
adalah artificial embryo twinning dan Somatic cell nuclear transfer (SCNT)
(Wangko dan Kristanto 2010). Kloning DNA dilakukan melalui beberapa tahap,
yaitu PCR spesiasi, visualisasi produk PCR, ekstraksi produk PCR dari gel
agarose, ligase DNA produk PCR ke TOPO vektor, transformassi plasmid (TOPO
vektor) rekombinan ke sel kompeten, seleksi koloni transforman pada media,
purifikasi plasmid, dan amplifikasi DNA plasmid (Antika et al. 2014).
Dinding sel beberapa jenis bakteri bersifat permiabel dan tidak dapat
dilewati oleh molekul DNA kecil, sehingga dalam melakukan transformasi perlu
membuat sel bakteri mejadi kompeten terlebih dahulu. Hal ini ditujukan agar
memudahkan plasmid masuk ke dalam sel (Noviendri 2007). Umumnya
pembuatan sel kompeten dilakukan pada bakteri Escherichia coli dengan metode
Sambrook et al. (1989) yang menggunakan larutan CaCl 2 (Gunawan 2015).
Pembuatan sel kompeten dilakukan dengan meningkatkan permeabiltas dinding
sel sehingga vektor rekombinan lebih mudah masuk ke dalam sel. Larutan CaCl 2
dalam keadaan dingin efektif menimbulkan peningkatan permeabilitas dinding sel
bakteri (Agus et al. 2017).
Gen yang diharapkan dimasukan ke dalam vektor berupa plasmid
kemudian ditransformasikan ke dalam sel inang (Gunawan 2015). Transformasi
sel adalah proses pemindahan materi genetik berupa makromolekul DNA yang
masuk ke sel inang dan menimbulkan perubahan genetic serta fenotip dari sel
inang tersebut (Mahendra et al. 2014). Metode yang umum digunakan dalam
transformasi adalah kejut panas atau heat shock yang dilakukan dengan cara
inkubasi sel kompeten pada suhu 42ºC selama 60-90 detik. Perlakuan ini
dilakukan setelah pendinginan sel kompeten pada es selama 30 menit (Sanjaya
2016). Praktikum ini bertujuan membuat sel kompeten dari bakteri E. coli dan
melakukan transformasi.

METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan pada hari Jumat 20 dan 27 April 2018 di

Laboratorium Pendidikan Departemen Biokimia FMIPA IPB lantai 5, gedung
fakultas peternakan, Institut Pertanian Bogor.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah autoklaf, neraca, hot
plate, sentrifus, eppendorf, penangas air, dan seperangkat alat gelas. Bahan yang
digunakan adalah tripton, NaCl, ekstrak yeast, kultur bakteri, MgCl2 100 mM,
media LBA + kanamisin, media LB cair, CaCl 2 75 mM, media LBA, sel
kompeten, dan DNA plasmid.

Prosedur Praktikum

Pembuatan Larutan Sel Kompeten

Larutan MgCl2 100 mM. Sebanyak 0.475 g MgCl2 yang dilarutkan dalam
100 mL akuades. Larutan yang telah homogen disterilkan dalam autoklaf pada
suhu 121 °C selama 15-20 menit.
Larutan CaCl2 75 mM. Sebanyak 1.102625 g CaCl2 yang dilarutkan
dalam 100 mL akuades. Larutan yang telah homogen disterilkan dalam autoklaf
pada suhu 121 °C selama 15-20 menit.

Pembuatan Media
Media LB (Luria Bertani). Sebanyak 1 g tripton, 0.5 g NaCl, dan 0.5 g
ekstrak yeast ditimbang dengan menggunakan neraca analitik, kemudian
dilarutkan 250 mL akuades. Larutan media dipanaskan pada suhu 100 °C hingga
terlarut secara sempurna. Media yang telah terlarut sempurna disterilkan dalam
autoklaf pada suhu 121 °C selama 15-20 menit.
Media LBA (Luria Bertani Agar). Sebanyak 1 g tripton, 0.5 g NaCl, dan
0.5 g ekstrak yeast ditimbang dengan menggunakan neraca analitik, kemudian
dilarutkan 100 mL akuades. Larutan media dipanaskan pada suhu 100 °C hingga
terlarut secara sempurna. Media yang telah terlarut sempurna disterilkan dalam
autoklaf pada suhu 121 °C selama 15-20 menit.

Pembuatan Sel Kompeten

 Kultur bakteri E. coli sebanyak 100 µL dimasukkan ke dalam labu
erlenmeyer yang berisi 1000 µL media LB. Kultur tersebut diinkubasi pada suhu
37 °C selama 90 menit. Kultur masing-masing sebanyak 10 mL dipindahkan ke
dalam 3 tabung sentrifus dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm pada suhu
4 °C selama 2 menit. Pelet hasil sentrifugasi disuspensikan kembali dengan 1.5
mL MgCl2 100 mM. Setelah itu, suspensi disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 8000 rpm pada suhu 4 °C selama 2 menit. Pelet hasil sentrifugasi
disuspensikan kembali dengan 1.5 mL CaCl2 75 mM. Suspensi didiamkan pada
tabung es selama 30 menit. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm
pada suhu 4 °C selama 2 menit. Pelet hasil sentrifugasi disuspensikan kembali
dengan 200 µL CaCl2 75 mM. Sel kompeten yang diperoleh dari ketiga tabung
dicampurkan sehingga didapatkan 100 μl sel kompeten untuk percobaan
transformasi.

Transformasi.
Sebanyak 100 L suspensi hasil pembuatan sel kompeten dipindahkan ke
dalam tabung mikro. Sebanyak 5 L DNA plasmid ditambahkan, kemudian
tabung didinginkan dalam es selama 30 menit. Setelah itu, sampel ditempatkan
dalam penangas air bersuhu 42 °C selama 90 detik. Sebanyak 400 L NB
dimasukkan ke dalam tabung sampel, lalu sampel diinkubasi selama 30 menit.
Sampel selanjutnya dituang dan ditaburkan 100μl produk transforman dalam
medium LBA dan di inkubasi pada suhu 37 °C. Lalu, diinkubasi selama 18 jam
dan diamati keberadaan E. coli yang terbentuk.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pembuatan sel kompeten dilakukan pada bakteri E. coli menggunakan

larutan CaCl2. Penambahan CaCl2 dingin dapat menimbulkan perubahan
permeabilitas dinding sel bakteri berupa peningkatan sehingga vektor rekombinan
dapat masuk ke dalam sel lebih mudah (Agus et al. 2017). Kultur sel ditumbuhkan
pada suhu 37ºC hingga sel memasuki fase pertumbuhan logaritmik. Pada fase ini
sel memiliki kompetensi paling baik karena sedang mengalami pertumbuhan yang
optimal dan aktif membelah sehingga mudah untuk melakukan introduksi DNA
asing. Garam CaCl2 yang ditambahkan pada klutur sel ini akan meningkatkan
permeabiltas dinding sel dan meningkatkan pengikatan DNA pada bagian luar sel
sehingga pada saat melakukan transformasi dengan heat shock, DNA yang
menempel pada dinding sel akan masuk. Metode CaCl2 ini memiliki efisiensi
transformasi optimal sekitar 106 cfu/µg DNA (Noor et al. 2014).
Pembuatan sel kompeten juga dapat menggunakan MgCl2 karena juga
merupakan kation divalen seperti CaCl2 (Isdiyono et al. 2017). Metode lain untuk
membuat sel kompeten adalah menggunakan larutan TSS (Langden et al. 2017).
Kompetensi sel ini termasuk ke dalam faktor yang mempengaruhi keberhasilan
transformasi. Faktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi adalah galur
bakteri, plasmid, media kultur, waktu ko-kultivasi, acetosyringone, pelukaan dan
kompetensi sel inang untuk terinfeksi (Dewanto dan Suhandono 2016).
 Metode transformasi yang digunakan pada praktikum kali ini adalah
metode heat shock. Metode ini dapat menyebabkan pori-pori membran sel terbuka
dalam waktu singkat sehingga siap menerima vektor rekombinan. Metode ini
dilakukan dengan memberi kejut suhu dingin dan panas secara bergantian
sehingga dinding sel bakteri akan mengembang dan mengempis secara cepat. Hal
ini memungkinkan DNA dari luar sel masuk ke dalam sel. Suhu yang digunakan
untuk proses heat shock adalah 42ºC dalam waktu 90 detik (Agus et al. 2017).
Namun, pada praktikum ini proses heat shock dilakukan dalam waktu 45 detik.
Metode heat shock ini merupakan metode yang umum digunakan. Metode
ini mudah dan memiliki tingkat keberhasilan yang cukup tinggi (Gunawan 2015).
Metode lain yang dapat digunakan adalah penggunaan polipleks khitosan yang
memiliki kemampuan melintasi membran sel dan melindungi DNA. Polipleks
yang masuk ke dalam sel dengan cara menembus membran sel akan melepas
DNA plasmid setelah berhasil masuk ke dalam sel (Mahendra et al. 2014). Selain
itu, untuk melakukan transformasi dapat digunakan sel bakteri Agrobacterium
tumafaciens atau teknik AMT (Agrobacterium Mediated Transformation) yang
umumnya digunakan dalam rekayasa genetika pada tanaman (Mulyaningsih et al.
2010).
Metode lain untuk transformasi adalah elektroporasi. Teknik ini
menggunakan aliran listrik bertegangan tinggi sehingga dapat melubangi
membran sel bakteri dan merusak lipid. Aliran listrik ini dialirkan ke suspense sel
dan DNA pada kuvet. Akibatnya, DNA dapat masuk ke dalam sel atau jaringan.
Sel dapat berfungsi dengan normal setelah pori-pori membran tertutup kembali
(Aryani 2011).
Screening dilakukan untuk memisahkan koloni yang membawa gen
sisipan dari koloni yang tidak membawa gen sisipan (Sanjaya 2016). Salah satu
metode untuk mengetahui keberhasilan transformasi adalah dengan
menumbuhkan bakteri pada media yang mengandung antibiotik marka seleksi. Sel
yang membawa DNA rekombinan akan mampu berkembang biak dan membentuk
koloni, sedangkan yang tidak membawa plasmid gen insersi akan mati pada media
yang mengandung antibiotik (Rajamuddin et al. 2016). Kemudian analisis
transforman dapat dideteksi menggunakan teknik koloni PCR untuk mengetahui
adanya klon positif (Gunawan 2015).
Selain itu, bakteri yang telah ditransformasi dapat ditumbuhkan pada
media yang mengandung antibiotik, X-gal yang merupakan suatu analog laktosa,
dan IPTG (isopropiltiogalaktosid). Bakteri yang mengandung Lac Z mengandung
gen pengkode β-galaktosidase yang akan substrat pada media yang mengandung
X-gal dan IPTG sehingga membentuk koloni berwarna biru (Annisa et al. 2011).
Substrat enzim β-galaktosidase ini adalah X-gal. Penyisipan insert DNA target
menyebabkan tidak terbentuknya α-complement yang berfungsi mengaktifkan β-
galaktosedase, sehingga sel transforman akan membentuk koloni berwarna putih
(Antika et al. 2014). Antibiotik berfungsi memilih DNA rekombinan yang
terbentuk, sedangkan senyawa IPTG dan X-gal berfungsi untuk seleksi biru putih.
Koloni yang tumbuh pada media antibiotik dan koloni putih yang terbentuk pada
media yang mengandung X-gal dan IPTG menunjukan keberhasilan transformasi
(Noor et al. 2014).
Praktikum ini menggunakan bakteri Escherichia coli untuk membuat sel
kompeten dan transformasi, tetapi bakteri yang digunakan tidak membawa
plasmid DNA rekombinan.
Merujuk gambar 1 dan 2 diperoleh
hasil pertumbuhan bakteri E. coli
kompeten yang membawa
plasmid DNA. Gambar 1
menunjukkan bahwa bakteri E.
coli kompeten yang membawa
plasmid DNA tidak tumbuh
pada media yang mengandung
antibiotik kanamisin.
Gambar 2 menunjukkan
bahwa bakteri E. coli kompeten
tumbuh pada media tanpa
antibiotik.

Gambar 1 Hasil pertumbuhan E. coli pada media LA dengan antibiotik

kanamisin

Gambar 2 Hasil pertumbuhan E. coli pada media LA tanpa antibiotik

kanamisin
 Metode Screening yang dilakukan menggunakan media dengan marka
selektif antibiotik. Hasil praktikum ini tidak sesuai dengan literatur karena bakteri
mengandung DNA plasmid sehingga seharusnya dapat tumbuh pada media
dengan antibiotik (Rajamuddin et al. 2016). Kesalahan ini dapat terjadi karena
adanya kontaminasi pada media kultur dan kompetensi sel bakteri yang belum
optimal. Kedua hal ini mempengaruhi keberhasilan transformasi (Dewanto dan
Suhandono 2016). Selain itu, waktu heat shock yang digunakan pada praktikum
ini hanya 45 detik, sedangkan menurut Sanjaya (2016) waktu untuk melakukan
heat shock berkisar 60-90 detik.
Bakteri E. coli yang bukan transforman tidak dapat tumbuh pada media
selektif, tetapi E. coli hasil transforman yang membawa plasmid rekombinan
dapat tumbuh pada media yang mengandung kanamisin. Hal ini terjadi karena
pada plasmid mengandung gen neomycin phosphotransferase II (NPT II)
penyandi resistensi terhadap kanamisin yang memungkinkan bakteri tumbuh pada
media selektif antibiotik (Rajamuddin et al. 2016). Adanya Open Reading Frame
(ORF) resistensi antibiotik kanamisin pada plasmid rekombinan menyebabkan E.
coli tumbuh pada media selektif antibiotik kanamisin (Antika et al. 2014).

SIMPULAN

Praktikum ini membuat sel kompeten dengan CaCl 2 sehingga sel dapat
ditransformasi. Sel bakteri yang digunakan adalah Escherichia coli yang
membawa DNA plasmid rekombinan sehingga mengandung gen resisten
antibiotik. Hasil praktikum ini menunjukkan bahwa sel kompeten yang dibuat
tidak dapat tumbuh pada media selektif yang mengandung antibiotik kanamisin,
tetapi dapat tumbuh pada media yang tidak mengandung antibiotik. Hal ini tidak
sesuai dengan literatur bahwa sel transforman yang membawa DNA plasmid
dapat tumbuh pada media yang mengandung antibiotik. Kesalahan yang terjadi
pada praktikum ini dapat disebabkan oleh adanya kontaminasi pada media kultur,
kompetensi sel yang tidak optimal, dan waktu heat shock yang digunakan tidak
sesuai literatur.

DAFTAR PUSTAKA

Agus R, Fahruddin, Irfandi. 2017. Ligasi gen

Rv 1980c pengkode protein MPT 64
ke pGEM-T Mycobacterium
tuberculosis sebagai antigen untuk
immunodiagnostic tuberculosis laten.
J. Alam dan Lingkungan. 8(15): 49-
59.
Annisa NA, Purbowatiningrum RS, Agustina LNA. 2011. Pemurnian DNA
plasmid
Puc19 menggunakan kolom silika dengan denaturan urea. JSM. 19(2): 47-
53.
Antika LD, Handayani S, Dewi RM. 2014. Metode perbanyakan kontrol positif
Plasmodium spp. dengan kloning. Bul.Penelit. Kesehat 42(2): 93-100.
Aryani AT. 2011. Transformasi gen Osdep1-Tc (Oryza sativa dense and erect
panicle1-Truncated) ke kalus padi cv. TAIPEI 309 menggunakan
Agrobacterium tumefaciens [skripsi]. Depok (ID): Universitas Indonesia.
Dewanto HA, Suhandono S. 2016. Transformasi menggunakan Agrobacterium
tumefaciens pada tunas daun Kalanchoe mortagei dan kalanchoe
daigremontiana 1 dan 2. Chimica et Natura Acta. 4(2): 97-105.
Gunawan L. 2015. Kloning gen pengkoed endo-β-1,3-1,4 glukanase Bacillus
subtilis subsp. Spizizenii W23 pada plasmid pMMB67EH dalam
Escherichia coli DH5α dan Escherichia coli origami. J. Sain Veteriner.
33(1): 110-122.
Isdiyono BW, Hardianto B, Iva FX. 2017. Produksi rekombinan sefalosporin
asilase sebagai biokatalis untuk produksi asam 7-aminosefalosporanat. J.
Bioteknologi & Biosains Indonesia. 4(1): 28-35.
Langden SSS, Budiharjo A, Wijarnaka, Kushayarto W. 2017. Transformasi dan
kloning plasmid PJ804:77539 pada E. coli TOP’10. J. Biologi. 6(1): 65-
70.
Mahendra IP, Wirajana IN, Sibarani J. 2014. Pemanfaatan polipleks khitosan-
pDNA dalam transformasi sel Escherichia coli. Cakra Kimia. 2(2): 1-8.
Mulyaningsih AS, Aswidinnoor H, Sopandie D, Ouwerkerk PBF, Nugroho S,
Loedin IHS. 2010. Perbandingan tiga metode transformasi Agrobacterium
untuk pencarian gen-gen terkait toleransi kekeringan menggunakan
transposon Ac/Ds pada padi cv. Batutegi. J. Biologi Indonesia. 6(3): 367-
381.
Noor S, Pramono H, Aziz S. 2014. Deteksi keragaman spesies bakteri metanogen
rumen sapi menggunakan kloning gen 16rRNA dan sekuensing. Scripta
Biologica. 1(4): 1-8.
Noviendri D. 2007. Teknologi DNA rekombinan dan aplikasinya dalam
eksplorasi
mikroba laut. Squalen. 2(2): 56-64.
Rajamuddin MAL, Alimuddin, Widyastuti U, Harris E, Suryati E. 2016.
Konstruksi
vektor biner gen kappa(κ)-carragenase dan transformasi ke
Agrobacterium tumefaciens sebagai media untuk pembuatan rumput laut
transgenic. J. Ilmu dan teknologi Kelautan Tropis. 8(1): 335-344.
Riyadi S, Maheswari RRA, Sudarwato M, Fransizka RZ, Ali M. 2011. Kloning
gen
 penyandi antigen HBsAg 100 dalam rangka produksi protein rekombinan
sebagai model immunogen untuk menghasilkan antibodi. J. Peternakan
Indonesia. 13(3): 242-248.
Sanjaya EH. 2016. Insersi gen pncA ke dalam plasmid pGEM-T. J. Kimia Riset.
1(2): 135-144.
Wangko S, Kristanto E. 2010. Kloning: manfaat versus masalah. J. Biomedik.
2(2):
88-94.