Nama : Fransiska Natalia Purba

NIM :A3502211004
Resume : Sekuensing DNA dan Kloning Gen

Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan
urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal
sebagai sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar
suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk
pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk
menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara
membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Usaha
untuk membaca urutan basa DNA telah dimulai pada tahun 1965 oleh Robert Holley
di Cornell University. Dia mentranskripsikan DNA menjadi RNA terlebih dahulu
agar terbentuk materi genetik yang terdiri dari 1 utas saja dan digunakan untuk
membaca urutan basa DNA.
Hal ini perlu dilakukan karena pembacaan urutan basa dilakukan dengan
menambahkan basa nitrogen sintesis yang telah diberi probe (penanda). Sehingga
harus menggunakan materi genetik yang tersusun dari 1 utas saja. Teknik ini terus
berkembang hingga akhirnya bisa menggunakan DNA murni tanpa harus
ditranskripsikan menjadi RNA terlebih dahulu. Teknik yang saat ini banyak
digunakan adalah hasil penemuan Frederick Sanger pada tahun 1975 dan dikenal
dengan nama metode Sanger. Metode Sanger ini menggunakan nukleotida 1 utas
yang telah diperbanyak sebagai template atau cetakan, kemudian digunakan
oligonukletida dengan panjang 8-10 basa atau disebut juga primer yang akan
menempel pada template. Primer yang telah menempel akan diperpanjang dengan
basa nitrogen sinstesis dan dibantu enzim DNA Polimerase.
Berikut diagram Sekuensing DNA teknik sanger.
 Gambar 1. Sekuensing DNA Teknik Sanger
Teknologi DNA Sequencing, yang mayoritas menggunakan metode Sanger,
saat itu belum memungkinkan peneliti untuk membaca genom manusia secara
langsung sehingga membuat mereka harus memisahkannya menjadi fragmen-fragmen
yang lebih kecil dan membutuhkan banyak waktu. Dengan mengetahui secara pasti
informasi genom manusia, para peneliti dapat mempelajari evolusi manusia, mutasi
pada gen manusia, hingga forensik. Saat ini, data GenBank HGP dapat diakses oleh
siapa saja melalui database online yang tersedia. Meski pada saat proyek HGP
dilakukan masih membutuhkan waktu lama, saat ini pembacaan DNA telah mampu
dilakukan secara cepat. Saat ini telah dikembangkan teknik yang dinamakan Next
Generation Sequencing (NGS), dimana teknik ini lebih baik dibandingkan metode
Sanger yang menjadi teknik utama saat proyek HGP. Selain itu, biaya yang
dibutuhkan juga lebih murah dibandingkan menggunakan metode Sanger.
NGS membuat penelitian dan aplikasi di bidang biologi molekuler menjadi
lebih bisa dilakukan secara masif. Salah satu keunggulannya adalah membaca genom
total manusia hanya dalam satu hari saja, dimana sebelumnya dibutuhkan lebih dari
10 tahun untuk membaca genom total manusia saat proyek HGP dilakukan. GS
memang metode terbaik jika melakukan analisis untuk gen dalam jumlah banyak,
tetapi jika dilihat dari akurasinya maka metode Sanger tetaplah yang terbaik. Oleh
karena itulah, metode Sanger dijadikan sebagai Gold Standard dalam analisis gen.
Selain itu, DNA Sequencing dapat digunakan untuk mendeteksi dan mendiagnosis
penyakit, khususnya penyakit yang berhubungan dengan genetik kita, seperti risiko
kanker, risiko diabetes keturunan (tipe 1), serta ada tidaknya mutasi abnormal di
genetik kita. Apabila penyakit-penyakit tersebut dapat diketahui lebih dini, maka bisa
segera ditangani dan meningkatkan persentase keberhasilan.
Saat ini, para peneliti juga mulai mencoba mengobati penyakit-penyakit
genetik yang tidak bisa disembuhkan dengan pengobatan tradisional menggunakan
metode gene editing. Pengobatan ini bertujuan untuk mengubah susunan basa
nukleotida pada seseorang secara langsung agar menjadi normal kembali. Metode ini
diharapkan dapat mengobati penderita autoimun bawaan, autisme, dan penyakit
genetik lainnya. Untuk membaca dan memahami hasil pembacaan urutan basa
nukleotida dibutuhkan ilmu khusus, yaitu bioinformatika. Bioinformatika secara luas
adalah ilmu yang menggabungkan biologi dengan teknologi informasi atau secara
lebih spesifik adalah ilmu yang mempelajari analisis dan aplikasi informasi genetik
yang ada. Ilmu ini dapat digunakan untuk mendeteksi risiko penyakit, mencari gen
potensial, dan lain-lain.
Informasi yang diperoleh dari pembacaan DNA hanyalah berupa simbol
urutan basa nukleotida saja (A,T,G,C) sehingga jika tidak dilakukan analisis maka
data yang diperoleh tidak ada artinya. Dengan ilmu bioinformatika, peneliti dapat
membandingkan data DNA Sequencing yang ada dengan database sehingga dapat
segera mengetahui jika terjadi mutasi (perubahan urutan basa nukleotida) yang
berpotensi menimbulkan penyakit (contoh: kanker). Bioinformatika sendiri tumbuh
dari kesulitan peneliti untuk menganalisis data sekuens DNA yang jumlahnya sangat
banyak. Dengan adanya ilmu ini, peneliti menjadi lebih menghemat waktu dan tenaga
dalam melakukan analisis. Bioinformatika ini juga menjadi kunci dari kesuksesan
proyek HGP yang dilakukan pada tahun 2003 silam.
Teknologi kloning merupakan terobosan baru di bidang rekayasa genetika.
Kloning adalah pengembangbiakan suatu mahluk hidup yang persis sama dengan
induknya tanpa melalui pembuahan, seperti stek pada tanaman, tetapi kloning melalui
rekayasa genetika jauh lebih rumit. Pada prinsipnya kloning DNA adalah proses
penggandaan jumlah DNA rekombinan melalui proses perkembangbiakan sel bakteri
(biasanya E. coli). Proses penggandaan tersebut dilakukan dengan memasukkan DNA
rekombinan ke dalam E.coli, diikuti dengan inkubasi sel E.coli pada suhu optimal
sehingga sel berkembangbiak secara eksponensial. Berikut tahapan cloning gen pada
pdc. Gen pdc merupakan penyandi enzim pyruvate decarboxylase yang berperan
dalam proses produksi asetaldehida secara homofermentatif dengan memanfaatkan
metabolisme mikroorganisme seperti Kluyveromyces lactis, Pisum sativum,
Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis dan Zymobacter palmae. Gen pdc
banyak terdapat pada fungi, yeast serta tumbuhan tingkat tinggi. Tahapan gen cloning
yaitu:
a. Amplifikasi Sekuen DNA target dengan metode PCR
Amplifikasi sekuen pdc akan dilakukan dengan metode PCR menggunakan
Taq DNA Polymerase dan pasangan primer yang telah didesain melalui studi
bioinformatika. Campuran reaksi PCR dibuat dalam volume 50 µl dan disesuaikan
dengan rekomendasi dari produsen (Fermentas) untuk tujuan optimasi.
b. Purifikasi Produk PCR
Proses purifikasi akan dilakukan dengan menggunakan PCR Fragment
Extraction Kit dari Geneaid. Produk PCR berupa ekstrak gel agarosa dalam bufer
TAE ditambah dengan 500 µl DF buffer dan dilarutkan dalam waterbath pada suhu
55ºC. Selanjutnya, larutan dimasukkan dalam DF Column + Collection tube. Proses
sentifugasi dilakukan dengan kecepatan 13000 rpm selama 1 menit pada suhu ruang.
Supernatan dipindahkan dari Collection tube dan ditambahkan 600 µl Wash buffer
serta dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 1 menit pada suhu
ruang. Supernatan dipindahkan dari Collection tube dan dilakukan sentrifugasi
dengan kondisi yang sama. DF Column dipindahkan dari Collection tube ke tube
steril dan ditambahkan dengan 30 µl Elution buffer. Larutan di dalam tube diinkubasi
pada suhu ruang selama 2 menit dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000
rpm selama 2 menit pada suhu ruang.
c. Ligasi Sekuen Gen pdc Hasil PCR ke dalam Plasmid pGEM-T easy
Proses ligasi akan dilakukan dengan menggunakan T4 DNA Ligase (Fermentasi).
d. Transformasi Plasmid Rekombinan ke dalam Bakteri Inang E. coli DH5α
Langkah ini dimulai dengan preparasi sel kompeten E. coli DH5α dengan
metode CaCl2. Rekulturisasi dilakukan terhadap 500 µl isolat E. coli DH5α ke dalam
50 ml media LB dan diinkubasi dalam shaker 200 rpm selama ± 4 jam pada suhu
37°C hingga OD mencapai 0,6-1,0. Kultur dipindahkan ke dalam tabung sorvall dan
dilakukan sentrifugasi I berkecepatan 3500 rpm pada suhu 4°C selama 15 menit.
Supernatan dibuang dan ditambahkan Solution B sebanyak 20 ml ke dalam tabung
sorvall. Inkubasi di dalam es selama 30 menit dilakukan setelah pelet dan Solution B
berada dalam keadaan homogen. Sentrifugasi II dilakukan dengan kecepatan 3500
rpm pada suhu 4°C selama 15 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan Solution
B sebanyak 2 ml. Sel kompeten diinkubasi dalam es selama 15 menit dan dapat
digunakan dalam proses transformasi. Transformasi akan dilakukan dengan metode
Heat Shock menurut Sambrook et al (2001). Prosedur kerjanya sebagai berikut:
Ligation mix (baik untuk produk PCR maupun kontrol) sebanyak 10 µl ditambah
dengan sel kompeten E. coli DH5α sebanyak 150 µl dimasukkan dalam tube steril
1500 µl dan dilakukan proses inkubasi selama 30 menit dalam es. Heat Shock
dilakukan pada suhu 42°C dalam waterbath selama 90 detik dan diinkubasi dalam es
selama 2 menit. Media LB (Luria Bertani) sebanyak 840 µl ditambahkan ke dalam
campuran dan dilakukan inkubasi dalam shaker dengan kecepatan 200 rpm selama 1
jam pada suhu 37°C. Transforman dipindah ke dalam media LB (Luria Bertani) padat
yang telah diberi antibiotik ampisilin, IPTG dan X-gal solution. Proses inkubasi akan
dilakukan selama 16 jam pada suhu 37°C.
e. Isolasi Plasmid dari Bakteri Rekombinan E. coli DH5α
Persiapan dilakukan dengan mengisolasi koloni tunggal yang berwarna putih
dari bakteri rekombinan E. coli DH5α pada medium LB + ampisilin menggunakan
metode toothpick. Koloni tunggal diambil dengan menggunakan tusuk gigi dan
dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi medium LB (Luria Bertani) cair
sebanyak 3 ml + ampisilin. Inkubasi akan dilakukan dengan menggunakan shaker
kecepatan 200 rpm selama 16 jam pada suhu 37 oC. Proses isolasi plasmid dimulai
dengan melakukan sentrifugasi kecepatan 12000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit
terhadap kultur bakteri yang telah dipindahkan ke dalam tube 1500 µl steril hingga
didapatkan pelet pada dasar tube. Pelet ditambah dengan Solution I sebanyak 100 µl,
vortex hingga homogen dan diinkubasi dalam es selama 5 menit. Larutan ditambah
dengan Solution II sebanyak 200 µl, inverting hingga larutan jernih dan terbentuk
fase gel. Larutan diinkubasi dalam es selama 5 menit dan ditambah dengan Solution
III sebanyak 150 µl, inverting hingga terbentuk endapan putih dan diinkubasi dalam
es selama 5 menit. Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10
menit pada suhu 4oC. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tube steril 1500 µl
dan ditambah etanol 96% sebanyak 900 µl. Larutan divortex hingga homogen dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan
12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang, pelet dikeringkan
dan ditambah dengan etanol 70% (dingin) sebanyak 1 ml. Larutan divortex hingga
endapan lepas dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit pada
suhu 4oC. Supernatan dibuang, pelet yang diperoleh dikeringkan dengan vacum dry
dan dilarutkan dengan 30 µl larutan RNAse dalam bufer TE serta diinkubasi pada
suhu 37oC selama 1 jam.
f. Digesti Ganda Enzim Restriksi terhadap isolat DNA plasmid pGEM-T easy.
Proses ini dilakukan dengan menggunakan enzim NdeI dan BamHI dari Fermentasi.

Berikut diagram alur gen cloning.

 Gambar 2. Diagram alur gen cloning.
Secara umum ada beberapa langkah dasar dalam Kloning Gen yaitu sebagai
berikut :
1. Suatu frakmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon diinsersikan pada
molekul DNA sirkular yang di sebut sektor untuk menghasilkan chimoera atau
molekul DNA rekombiner.
2. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk kedalam sel tuan
rumah ( host ) yang biasanya berupa bakteri, walaaupun sel-sel jenis lain dapat di
gunakan.
3. Didalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan banyak kopi atau
turunan yang identik, baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya.
4. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinasi diwariskan pada
progeni dan terjadi replikasi vektor selanjutnya.
5. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klonsel
host yang identik Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih
molekul DNA rekombinasi dengan demikian dikatakan bahwa gen yang dibawa
oleh molekul rekombinasi telah diklon.
 DAFTAR PUSTAKA

Aprijani, D.A; M. Abdushshomad Elfaizi. 2004. BIOINFORMATIKA:

Perkembangan, Disiplin Ilmu dan Penerapannya di Indonesia.
http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html. [28 Juni 2007].
Campbell, N.A, Reece, J.B., Mitchell, L.G. (2003). Biologi jilid 2. Jakarta: Penerbit
Erlangga
Mizawarti. 2003. Penerapan Teknik-Teknik Kloning Gen dalam Kehidupan Manusia.
Perpustakaan Digital Universitas Sumatra Utara.

Purkan. 2003. Amplifikasi dan Kloning Gen Protein Disulfida Isomerase Ragi
menggunakan Vektor T. Jurnal Peneliti Med. Eksakta Vol. 4 No. 3: 231- 236.

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik

Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB