Ringkasan PCR dan Real-Time PCR

What is PCR?

Pcr adalah teknik yang mengambil urutan DNA tertentu dalam jumlah kecil dan
memperkuatnya untuk digunakan untuk pengujian lebih lanjut. Polymerase Chain Reaction
(PCR) merupakan teknik in vitro untuk amplifikasi wilayah DNA tertentu tanpa transfer
sebelumnya ke sel hidup. Teknik tersebut ampuh karena amplifikasi jutaan kali lipat dapat
dicapai hanya dalam beberapa jam. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi
sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.

Biasanya, tujuan PCR adalah membuat cukup banyak wilayah DNA target sehingga dapat
dianalisis atau digunakan dengan cara lain. Misalnya, DNA yang diperkuat oleh PCR dapat
dikirim untuk sekuensing, divisualisasikan dengan elektroforesis gel, atau dikloning menjadi
plasmid untuk percobaan lebih lanjut.
PCR digunakan di banyak bidang biologi dan kedokteran, termasuk penelitian biologi molekuler,
diagnostik medis, dan bahkan beberapa cabang ekologi.

Kelebihan dan kekurangan PCR

Kelebihan :

o Dapat menganalisis DNA yang sangat sedikit

o Spesifik, sederhana
o Dapat menganalisis banyak sampel dengan cepat
o Mampu mendeteksi kelainan

Kekurangan :

o Optimasi perlu waktu, jika tidak optimum menyebabkan terjadinya kesalahan interpretasi
o Karena sangat sensitive menyebabkan problem kontaminasi sangat tinggi kesalahan
o Kebersihan, atau tanpa adanya kontaminasi dituntut sangat tinggi pada saat bekerja

Prinsip Kerja

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus.
Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi,
94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas
tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit)
 untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak
stabil dan siap menjadi templat (“patokan”) bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.

2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang
komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini
bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau
primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.

3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA
polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada
suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi,
beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat
berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan
berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial

Metode PCR

1. COLD PCR
Prinsip : Denaturasi selektif missmatch/heterodu pleks DNA (campuran DNA tipe mutan
dengan tipe wildnya) pada Tc (suhu critikal).
Fungsi : Pengayaan fragmen DNA yang mengandung mutasi pada populasi suatu sel sel
dan deteksi mutasi gen

2. PNAC PCR
Prinsip : Penghambatan secara selektif perbanyakan fragmen DNA tipe wild
menggunakan oligo peptida.
Fungsi : Deteksi mutasi gen.

3. Supression PCR
Prinsip : Ampllifikasi spesifik pada daerah SS loop dari hairpin DNA yang terbentuk dari
ikatan komplimentari yang kuat pada ujung-ujung linker menggunakan primer spesifik
gen.
Fungsi : Deteksi keragaman gen.

4. TETRA ARMS PCR

Prinsip : Amplifikasi fragmen gen spesifik menggunakan sepasang primer pengamit
(flanking primer) dan sepasang primer internal yang berposisi saling berlawanan arah.
Fungsi : Deteksi keragaman gen dan mutasi
Peranan PCR dalam Diagnostik Kesehatan

Aplikasi PCR dalam diagnostik kesehatan telah banyak dilakukan dengan tingkat
sensitifitas dan spesifitas yang cukup tinggi. Oleh sebab itu wajar jika teknologi ini cukup
mumpuni dalam mendeteksi mikroorganisme berbahaya yang titernya cukup kecil sekalipun
dalam beragam sampel, mendeteksi suatu mutasi gen tertentu pada pasien penderita kanker, dan
mendeteksi kelainan gen-gen bawaan.

Aplikasi teknik PCR

Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR
sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

a) Isolasi Gen
 Berkat teknologi rekayasa genetik, kini dapat mengisolasi gen penghasil insulin
dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E.
coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga. Hasilnya insulin yang sama
persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal
diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang
cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi. Untuk mengisolasi
gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki
urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat
dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

b) DNA Sequencing
 Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing,
metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination
method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana
proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu
hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya
tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent
untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa
ditentukan.
c) Forensik
 Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau
korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik
 sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang
tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan
analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut
fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang.
d) Diagnosa Penyakit
 Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah
saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini
memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering
digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam
dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu
DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki
oleh virus atau makhluk lainnya.