Nama : Ardini Sabrina

NIM : 2207501010066

Molekuler diagnostik penyakit infeksi

Penyakit infeksi dapat disebabkan oleh agen mikrobiologi yaitu bakteri. Kemampuan
bakteri dalam menginvasi dan menimbulkan infeksi ini disebut sebagai patogen.[1] Terapi terhadap
infeksi yang disebabkan oleh bakteri umumnya menggunakan antibiotik. Antibiotik berasal dari
dua kata bahasa Yunani yaitu “anti” yaitu lawan dan “bios” yaitu hidup, dan bisa juga diartikan
“melawan sesuatu yang hidup”. Antibiotik merupakan zat kimia yang berasal dari bakteri atau
mikroorganisme lain dengan kemampuan mematikan atau menghambat pertumbuhan pada bakteri.
umumnya antibiotik yang digunakan untuk terapi infeksi bakteri adalah golongan sefalosporin,
antara lain cefadroxil, ceftriaxone, cefuroxim, cefazolin, cefixim, ceftazidime, dan cefotaksim.
Golongan antibiotik ini sering digunakan daripada golongan antibiotik lainya, dan seringnya
penggunaan antibiotik ceftriaxone bisa mempengaruhi penyakit infeksi seperti pada sepsis, dan
juga infeksi penyakit dalam. Dampak negatif yang terjadi akibat penggunaan antibiotik dengan
tidak rasional, terlalu seringnya menggunakan antibiotik yang berlebihan, dan konsumsi dalam
jangka waktu yang tidak ditentukan dapat menimbulkan resistensi bakteri terhadap antibiotik
tersebut. Hal ini dapat menyebabkan terapi yang tidak akurat, dan juga bisa menyebabkan tingkat
biaya kesehatan yang mahal. Upaya peningkatan terapi atau pengobatan pasien terinfeksi bakteri
resistan antibiotik dapat dilakukan dengan pemeriksaan diagnostik dalam laboratorium medis.
Pemeriksaan ini sangat penting dilakukan dalam menegakkan sebuah diagnosa apakah seseorang
terinfeksi agen bakteri patogen atau tidak dan apakah infeksi bakteri tersebut termasuk dalam strain
yang resistan antibiotik atau tidak. Dalam perkembangannya terdapat teknik diagnostic yang dapat
diaplikasikan dalam uji diagnostik dalam laboratorium, yaitu biologi molekuler. Biologi molekuler
merupakan aplikasi teknologi yang dapat mendiagnosis secara cepat dan tepat agen patogen yang
menginfeksi tubuh.[2]

Dalam mikrobiologi dan biologi molekuler, PCR digunakan di laboratorium penelitian

dalam prosedur cloning DNA, southern blotting, sekuensing DNA, teknologi DNA rekombinan.
Di laboratorium mikrobiologi klinis PCR sangat berharga untuk diagnosis infeksi mikroba dan
studi epidemiologi.[1] Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. DNA dapat dihasilkan dalam
jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang
menggunakan DNA. Teknik amplifikasi DNA menggunakan PCR dapat meningkatkan jumlah
urutan DNA menjadi ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106 -107 kali. Setiap
urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus
PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target.[2]

Pada proses PCR diperlukan empat komponen utama, yaitu:[2]

1) DNA cetakan (template) yang merupakan fragmen DNA yang akan dilipatgandakan
2) Oligonukleotida primer spesifik yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25 basa
nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA
3) Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP
4) Enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisi reaksi sintesis rantai DNA yang
thermostabil.

Prinsip dasar PCR adalah proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan
ekstensi/ elongasi oleh enzim DNA polimerase. Semua tahap dan perubahan suhu dilakukan pada
tabung reaksi PCR yang diinkubasi pada alat pemanas terprogram dan otomatis.[2]
1) Denaturasi
Tahap pertama pada sistem amplifikasi PCR adalah denaturasi DNA sampel dengan
menaikkan suhu dalam tabung reaksi sampai 95ºC. Tabung reaksi ini berisi DNA target, dua
primer oligonukleotida dalam jumlah berlebih, Taq DNA polymerase yang tahan panas,
keempat deoksiribonukleotida dan bufer yang mengandung Mg. Selama proses denaturasi yang
berlangsung dalam beberapa menit, untai ganda DNA (dsDNA) mencair dan ikatannya terbuka
sehingga terjadi pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal DNA (ssDNA).[2]
2) Primer Annealing
Tahap kedua pada sistem amplifikasi PCR adalah primer annealing. Primer Annealing
merupakan pengenalan (annealing) suatu primer terhadap DNA target tergantung pada panjang
untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu sendiri. Waktu annealing yang
biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin
 tinggi suhunya. Kisaran suhu penempelan yang digunakan adalah antara 37ºC sampai dengan
60ºC. Pada tahap ini, primer menempel pada sekuen komplementernya pada DNA target.[2]
3) Ekstensi/Elongasi
Tahap ketiga pada sistem amplifikasi PCR adalah DNA Polymerase extension. Pada tahap
extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer yang telah
menempel di urutan basa nukleotida DNA target yang akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung
3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang
diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Adapun temperatur
ekstensi berkisar antara 70-72°C.[2]

PCR konvensional adalah PCR di mana tahap perbanyakan materi genetik dan tahap deteksi
produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi dilakukan bila tahap perbanyakan
materi genetik telah selesai. Reaksi PCR konvensional biasanya menggunakan satu pasang primer
oligonukleotida untuk mengamplifikasi bagian tertentu dari genom agen infeksi serta dilakukan
pada suatu tabung. Primer PCR adalah oligodeoksiribonukleotida pendek, atau oligomer yang
dirancang untuk melengkapi urutan akhir sekuen dari amplikon target PCR dan digunakan untuk
mengawali sintesis rantai DNA.

Real Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real
time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR. Teknik
ini dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekaligus menghitung jumlah target molekul DNA
hasil amplifikasi tersebut. Maksud dari kata real time pada metode ini adalah data fluoresensi yang
dihasilkan dari proses amplifikasi dapat diamati secara langsung pada saat proses amplifikasi
masih berjalan dan tanpa harus menunggu seluruh siklus amplifikasi selesai.[3] Real Time PCR
merupakan pengembangan metode PCR yang hasil amplifikasinya dianalisis selama proses
amplifikasi dengan menggunakan pewarna DNA atau pelacak berfluoresensi. Analisis data
dilakukan dalam instrumen yang sama, tanpa pemindahan sampel, tanpa penambahan sampel dan
tanpa pemisahan dengan elektroforesis. Metode ini dapat digunakan untuk analisis secara
kuantitatif jumlah awal sehingga dapat digunakan pengukuran secara kuantitatif.[2]
 Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) merupakan metode yang digunakan untuk
mengamplifikasi cDNA dari mRNA atau Bisa juga langsung dari mikroorganisme yang memiliki
materi genetik RNA (seperti virus (polio, campak, rubella, influenza, dll). RT-PCR digunakan
untuk mendapatkan kembali dan menyalin utas 5’ dan 3’ dari mRNA, menghasilkan kumpulan
cDNA yang banyak dari jumlah mRNA yang sangat sedikit. RT-PCR dapat dengan mudah
digunakan untuk mengidentifikasi mutasi, polimorfisme dan mengukur kekuatan ekspresi gen.[3]
RT-PCR merupakan salah satu jenis uji molekular yang dapat digunakan untuk mendeteksi
infeksi COVID-19. RT- PCR merupakan metode identifikasi dan konfirmasi laboratorium kasus
COVID-19 yang paling disarankan. RT-PCR mendeteksi apakan adanya RNA virus yang muncul
pada sampel pasien. Pemeriksaan ini bekerja dengan menangkap dan memperjelas material genetik
seperti protein S, protein N dan envelope dari virus. Untuk mengukur viral RNA, RNA perlu
dikonversi menjadi DNAdan disalin secara berulang menggunakan siklus temperatur yang terdapat
pada mesin PCR dan kemudian menggunakan marker fluorescent untuk mendeteksi virus.
Jika nilai fluoresen mencapai level tertentu, maka hal ini mengkonfirmasi presensi dari virus.[3]

Keberhasilan PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor, yaitu deoksiribonukleotida

triphosphat (dNTP), oligonukleotida primer, cetakan DNA, komposisi larutan buffer, jumlah siklus
reaksi, enzim yang digunakan dan faktor teknis dan non teknis lainnya, misalnya kontaminasi.
Keunggulan PCR adalah kemampuannya dalam melipatgandakan suatu fragmen DNA sehingga
dapat mencapai 109 kali lipat. Dengan demikian, kontaminasi fragmen DNA dalam jumlah sangat
sedikit sekalipun dapat menyebabkan terjadinya kesalahan yaitu dengan didapatkannya produk
amplifikasi yang tidak diinginkan. Kontaminasi tersebut dapat berasal dari beberapa sumber,
antara lain dari reaksi-reaksi PCR yang dilakukan sebelumnya.[2]

Tes Cepat Molekuler (TCM) GeneXpert merupakan pemeriksaan molekuler yang

dilakukan secara otomatis dan terintegrasi semua langkah Polymerase Chain Reaction (PCR)
berdasarkan uji deoxyribonucleic acid (DNA) untuk mendeteksi adanya kuman mikrobakterium
tuberculosis (MTB) dan sekaligus mendeteksi resistensi bakteri tersebut terhadap obat
rifampisin.[4,5] Primer PCR yang digunakan mampu mengamplifikasi sekitar 81 bp daerah inti
gen rpoB MTB kompleks, sedangkan probe dirancang untuk membedakan sekuen wild type dan
mutasi pada daerah inti yang berhubungan dengan resistansi terhadap rifampisin.[6] Sensitivitas
dan spesifitas TCM mendiagnosa TBC paru 88% dan 99%, sedangkan sensitifitas dan spesifitas
untuk mendeteksi rifampisin resisten adalah 95% dan 98%.[5]
Pemeriksaan hanya memerlukan waktu 2 jam dengan disposable catridge dari sampel
dimasukkan kedalam mesin hingga hasil pemeriksaan keluar dan tercetak.[4] Satu-satunya langkah
manual adalah saat mencampur buffer bakterisidal dengan sampel utama untuk ditambahkan ke
catridge (katrid).[7] GeneXpert adalah sistem alat pengetesan molekuler dengan metode RT-PCR
untuk mendeteksi TBC, HIV dan viral hepatitis. Selain untuk TB, TCM dapat digunakan untuk
pasien kasus suspek, konfirmasi, probable dan orang tanpa gejala (OTG) pada kasus COVID 19.
Hasil pemeriksaan yang positif mengindikasi bahwa sedang terjadi infeksi aktif dari virus
SARSCoV-2, sedangkan hasil negatif tidak menutup kemungkinan terjadinya infeksi, sehingga
tetap perlu dilakukan kombinasi dengan melakukan observasi klinis, riwayat pasien dan informasi
epidemiologis. Keunggulan menggunakan TCM ini yaitu tingkat akurasi tinggi, dan alat ini
tersebar di hampir seluruh kab/kota di Indonesia. Kekurangannya adalah dibutuhkan biaya yang
cukup tinggi untuk satu kali pemeriksaan per specimen dan membutuhkan tingkat keamanan
laboratorium minimal BSL-2.[3]
 DAFTAR PUSTAKA

1. Kusnadi J, Arumningtyas EL. Polymerase Chain Reaction (PCR): Teknik dan

Fungsi. Tim UB Press; 2020.
2. Nurhayati B, Darmawati S. Biologi Sel dan Molekuler [Internet]. 2017. Available
from:
https://www.researchgate.net/publication/269107473_What_is_governance/link/54817309
0cf22525dcb61443/download%0Ahttp://www.econ.upf.edu/~reynal/Civil
wars_12December2010.pdf%0Ahttps://think-
asia.org/handle/11540/8282%0Ahttps://www.jstor.org/stable/41857625
3. Yanti B, Ismida FD, Sarah KES. Perbedaan uji diagnostik antigen, antibodi, RT-
PCR dan tes cepat molekuler pada Coronavirus Disease 2019. J Kedokt Syiah Kuala
2020;20(3):172–
7.
4. Novianti N, Simarmata OS, Lolong DB. Pemanfaatan Tes Cepat Molekuler (Tcm)
Genexpert Sebagai Alat Diagnostik Tb Paru Di Rsud Wangaya Kota Denpasar. J Ekol
Kesehat 2020;18(3):135–48.
5. Kristina K, Lolong DB, Sari DP. Pemanfaatan Metode Tes Cepat Molekuler
(XPERT MTB/RIF) Di Kabupaten Sorong Tahun 2014-2018. Bul Penelit Sist Kesehat
2020;23(3):154–60.
6. Marissa N, Wilya V, Febriansyah E, Ramadhan N. Tes Cepat Molekuler sebagai
Alat Diagnosis Tuberkulosis yang Resisten Rifampisin di Provinsi Aceh Molecular Rapid
Test
as A Diagnostic Tool for Rifampicin Resistant Tuberculosis in Aceh. J Biotek Medisiana
Indones [Internet] 2020;9(2):147–59. Available from:
http://ejournal2.litbang.kemkes.go.id/index.php/jbmi/article/view/4419
7. Banada PP, Naidoo U, Deshpande S, Karim F, Flynn JL, O’Malley M, et al. A
novel sample processing method for rapid detection of tuberculosis in the stool of pediatric
patients using the Xpert MTB/RIF assay. PLoS One 2016;11(3):1–13.