LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

Pembuatan Sel Kompeten

Aula Lidinillah
Departemen Bioteknologi Universitas Muhammdiyah Bandung
Jl. Soekarno Hatta No. 752, Cipadung Kidul, Panyileukan, Bandung
Email : aula.lidinillah@gmail.com

PENDAHULUAN medium Luria-Bertani (LB) (Sezonov

dkk., 2007).
Ekspresi gen adalah tahapan gen
yang ditranskripsi kemudian nanti Sel bakteri yang telah mengalami
ditranslasi menjadi polipeptida atau suatu perlakuan fisik sehingga dapat
protein. Untuk mengekspresikan gen memperoleh kemampuan untuk
secara rekombinan, diperlukan vektor mengambil DNA asing adalah sel
ekspresi. Vektor ekspresi digunakan untuk kompeten (Brown, 2010). Faktor yang
memproduksi protein dari gen yang mempengaruhi dalam pembuatan sel
diklon. Vector ekspresi yang biasa kompeten adalah larutan garam. Larutan
digunakan salah satunya adalah plasmid garam yang dapat digunakan adalah
(Gaffar,2010). larutan CaCl2, BaCl2, MgCl2, MnCl2, dan
SrCl2. Larutan garam ini akan
Plasmid merupakan molekul DNA
meningkatkan kemampuan transformasi
ekstrakromosomal yang memiliki ukuran
sel bakteri. Hasil penelitian oleh Liu dkk.
bervariasi dari kurang dari 1 kb hingga
(2014).
lebih dari 200 kb. Plasmid umumnya
beruntai ganda, molekul sirkuler, dan TUJUAN
tertutup secara kuat dengan ikatan
kovalen. Plasmid dapat diisolasi dari sel Praktikum ini bertujuan untuk
bakteri dalam bentuk superheliks membuat sel kompeten dari sel bakteri E-
(Sambrook dan Russel, 2001). Bakteri coli BL21 (DE3)
yang sering digunakan dalam proses METODE
rekayasa genetika salah satunya adalah
bakteri E.coli. Alat

Escherichia coli dapat bereplikasi Alat alat yang digunakan pada

sangat cepat, yaitu setiap 20-30 menit
sekali. Selain itu, Escherichia coli juga
dapat tumbuh pada medium sederhana
ataupun medium khusus, sehingga mudah
dikulturkan (Casali dan Preston, 2003).
Escherichia coli dapat diinokulasikan pada
praktikum ini adalah autoclave, incubator,
ice bath, sentrifugator, kuvet, erlenmeyer,
kuvet, microtube, tips, mikropipet, wadah
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada
praktikum ini adalah larutan garam klorida
(CaCl2), akuades steril, gliserol steril, stok
gliserol bakteri E.coli BL21 (DE3), media
cair LB
Langkah Kerja
Pembuatan Reagen : 0,1 M CaCl2 15%
Gliserol
CaCl2 ditimbang sebanyak 2,2 gram,
kemudian dimasukkan ke dalam wadah.
Lalu ditambahkan akuades sebanyak 200
ml dan diaduk rata. Disiapkan wadah baru
dan dimasukkan 1,5 ml 100% gliserol
steril ke dalam wadah, lalu ditambahkan
8,5 ml CaCl2 0,1M (total =10 ml).
Kemudian disterilkan larutan 0,1 M CaCl2
15% gliserol menggunakan autoclave pada
suhu 1210C selama 20 menit. Larutan
dibagi menjadi beberapa aliquot dan
disimpan pada suhu -200C.
Pembuatan Sel Kompeten (SK)
Stok gliserol bakteri E.coli
BL21(DE3) ditumbuhkan pada media
Luria Bertani (LB), kemudian diinkubasi
pada kecepatan 200 rpm (suhu 370C,
selama 16-18 jam). Setelah itu disub kultur
pada 100 ml LB, kemudian diinkubasi lagi
hingga mencapai OD600 0,4. Selanjutnya
diinkubasi kultur sel dalam ice bath 00C
selama 45 menit. Lalu disentrifugasi
selama 10 menit pada kecepatan 4000 rpm
pada suhu 40C. selanjutnya pellet
diresuspensi dengan 0,1 M CaCl2 15%
gliserol, lalu dialiquot masing-masing
sebanyak 1000 μL dan simpan pada suhu
40C.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sel kompeten dibuat dengan cara
merendam sel dalam larutan garam
klorida, seperti CaCl2 untuk meningkatkan
permeabilitas membran sel sehingga
plasmid dapat masuk ke dalam sel
(Brown,2010). Alternative garam yang
dapat digunakan BaCl2, MgCl2, MnCl2,
dan SrCl2 (Liu dkk., 2014).
Escherichia coli yang tumbuh pada
medium memiliki fase log dan fase lag.
Kedua fase ini disebut juga sebagai steady
state, yaitu keadaan sel mendapatkan
sumber nutrisinya paling baik, sehingga
dapat tumbuh dengan optimal. Kondisi
steady ini didapatkan setelah E. coli berada
dalam OD600 0,3 hingga OD600 7. Nilai
OD600 ini berlawanan dengan laju
pertumbuhan E. coli. Laju pertumbuhan E.
coli akan semakin menurun seiring
bertambahnya nilai OD600. Nilai OD600
yang paling baik untuk transformasi
plasmid ke dalam E. coli adalah 0,4
(Sezonov dkk., 2007). Nilai OD600 0,4
dapat dicapai dalam waktu inkubasi 3 jam
(Sekse dkk., 2012) hingga 4 jam (Casali
dan Preston, 2013).
Sel kompeten disimpan pada suhu
0°C gunanya untuk memperlambat
aktivitas dari bakteri, agar fase
pertumbuhan tidak mencapai pada fase
death dan juga agar menjaga kualitas dari
sel kompeten tersebut.
KESIMPULAN
Hasil pembuatan sel kompeten
memiliki OD600 0,4 dimana merupakan
paling baik karena berada fase log
DAFTAR PUSTAKA
Brown, T. A. (2010). Gene cloning and
DNA analysis. Blackwell
Publishing, Oxford. Halaman : 95-
99.
Casali, N. dan Preston, A. (2003). E. coli
Plasmid Vectors: Methods and
Applications. Humana Press, New
Jersey.
Liu, X., Liu, L., Wang, Y., Wang, X, Ma,
Y., dan Li, Y. 2014. The study on
the
factors affecting transformation
efficiency of Escherichia coli
competent cells. Pakistan journal
of pharmacy science : 27 (3),
p.679-684.
Sambrook, J., dan Russel, D. W. 2001.
Molecular cloning, third edition.
Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York.
Sezonov, G., Petit, D.J. dan D’Ari, R.
(2007). “Escherichia coli
Physiology in Luria Bertani
Broth”. Journal of Bacteriology.
189, (23) : 8746-8749.
Gaffa, S. 2010. Bioteknologi molekul,
konsep dan aplikasi. ISBN: 978-
602-8323-46-8. Widia
Padjadjaran.
Lampiran
1. Apa itu sel kompeten?
2. Apa fungsi dari larutan garam
klorida ?
3. Berapa gram CaCl2 untuk
membuat 500 ml larutan
dengan konsentrasi 0,2 M? (Ar
Ca= 40, Cl = 35,5)
4. Berapa volume yang diambil
dari 100% gliserol untuk
membuat 15% gliserol dalam
volume 50 ml ?
5. Tuliskan diagram alir sel
kompeten!
Jawaban :
1. Sel bakteri yang telah diberi
perlakuan khusus sehingga
memiliki kemampuan untuk
mengambil DNA asing.
2. Untuk meningkatkan
permeabilitas membrane
sehingga plasmid dapat masuk
ke dalam sel.
3. n=MxV
= 0,2 x 500
= 100 mmol
n = gram / Mr
gam = n x Mr
= 100 x 111
= 11100 = 1,11 gram
4. M1 x V1 = M2 x V2
100 x V1 = 15 x 50
V1 = (15 x 50)/ 100
V1 = 7,5 ml
5. Stok gliserol bakteri E.coli
BL21 (DE3) ditumbuhkan pada
10 mL media cair Luria Bertani
(LB) > diinkubasi pada
kecepatan 200rpm, suhu 37°C,
selama 16-18 jam > di sub-
kultur pada 100 mL LB >
diikubasi kembali hingga
mencapai OD600 0,4 > diinkubasi
kultur sel didalam ice bath 0°C
selama 45 menit > disentrifugasi
selama 10 menit dengan
kecepatan 4000 rpm, pada suhu
4°C > dibuang supernatan dan
diresuspensi pelet sel dengan 25
mL CaCl2 0,1 M > diinkubasi
kembali sel didalam ice bath
0°C selama 45 menit >
disentrifugasi selama 10 menit,
kecepatan 4000 rpm pada suhu
4°C > diresuspensi pelet sel
dengan 2 mL CaCl2 01 M 15%
gliserol > dialiquote sel
sebanyak 100 µL, dan disimpan
disuhu 4°C.