19/10/2020

Pemeriksaan Genetika Molekuler

Faizah Fulyani, Ph.D

Referensi :
1. Essential Cell Biology, Bruce Alberts 3rd edition
2. Biochemistry, Strayer, 6th edition
3. Video pembelajaran
4. PERHATIAN: slide ini merupakan alat bantu dalam perkuliahan dimana
penjelasan detail anda dapatkan dalam proses perkuliahan. Bacalah
textbook yang disarankan dan catatan yang anda dibuat selama proses
perkuliahan.

Disclaimer: All Materials in this presentation are belong to their

respective owner and used for educational purposes only.

Tujuan
Mengetahui beberapa teknik pemeriksaan pada
bidang Biologi Molekuler dan Genetika :

1. Mengakses data urutan DNA pada data base

2. Mengisolasi DNA
3. Memperbanyak fragmen DNA (PCR)
4. Mengidentifikasi fragmen DNA (Gel electrophoresis of
DNA)
5. Mengidentifikasi urutan DNA (sequencing)

1
 19/10/2020

GENETIKA MOLEKULER
• Definisi :
– Pemeriksaan laboratorium yang dilakukan untuk
mengetahui kelainan genetik pada organisme
tertentu
• Kegunaan :
– Konfirmasi diagnosis klinis pasien dg penyakit
genetik
– Diagnosis presimtomatik pada individu dengan
resiko memiliki kelainan genetik
– Deteksi carier (pembawa)
– Diagnosis prenatal

KONSELING GENETIKA
• Definisi :
– aktifitas komprehensif yang dilakukan untuk
dengan yang menitikberatkan pada edukasi dan
psikoterapi untuk pasien/keluarga dengan
kelainan genetik
• Prinsip : komunikasi pada pasien/keluarga
dengan kelainan genetik meliputi :
– kondisi genetik dari pasien,
– pola penurunan,
– faktor resiko & resiko berulang,
– hal-hal spesifik ttg kelainan genetik tertentu

2
 19/10/2020

KONSELING GENETIKA
 Wawancara / anamnesis (termasuk riwayat
penyakit, pohon keluarga &riwayat penyakit
keluarga)
 Pemeriksaan fisik  mengarah pada kelainan
genetik tertentu?
 Konfirmasi laboratorium dg pemeriksaan
sitogenetika dan atau genetika molekuler
 Penyampaian hasil
 Edukasi
 Rujukan (bila perlu)

Ambiguous genitalia

1. Gangguan perkembangan testis. kelainan genetik

2. Kekurangan enzim 5A-Reduktase. berperan dalam pembentukan hormon
androgen; organ kelamin laki-laki tidak berkembang dengan baik.
3. Sindrom insensitivitas terhadap androgen
4. Kelainan pada testis dan testosteron.

3
 19/10/2020

Pemeriksaan kromosom: Karyotipe

Androgen Insentivity Syndrome

• Characterised by undermasculinisation (or

feminisation) in individuals with 46,XY karyotype.

• Gene/locus: Androgen Receptor (Xq11-q12).

– Codes for the androgen receptor protein.

– Testes are formed normally since the sry gene on Y
chromosome is present. But masculinization does not
happened due to resistance to androgen.

• Inheritance: X linked inheritance pattern.

– Affected 46,XY individuals are usually infertile.
– A female carrier is at risk of having an affected
offspring (25% chance for each pregnancy).

4
 19/10/2020

MOLECULAR ANALYSIS

DNA analysis: Sequensing on AR gene

Pathogenic mutation 859delG (AR ex 1)

10

5
 19/10/2020

1. Mengakses data urutan DNA pada data base

ORIGIN (EXON 1)
1 ccaaatttcg tgagtgctgg cctccaggaa atctggagcc ctggcgccta aaccttggtt
61 taggaaagca ggagctattc aggaagcagg ggtcctccag ggctagagct agcctctcct
121 gccctcgccc acgctgcgcc agcacttgtt tctccaaagc cactaggcag gcgttagcgc
181 gcggtgaggg gaggggagaa aaggaaaggg gaggggaggg aaaaggaggt gggaaggcaa
241 ggaggccggc ccggtggggg cgggacccga ctcgcaaact gttgcatttg ctctccacct
301 cccagcgccc cctccgagat cccggggagc cagcttgctg ggagagcggg acggtccgga
361 gcaagcccac aggcagagga ggcgacagag ggaaaaaggg ccgagctagc cgctccagtg
421 ctgtacagga gccgaaggga cgcaccacgc cagccccagc ccggctccag cgacagccaa
481 cgcctcttgc agcgcggcgg cttcgaagcc gccgcccgga gctgcccttt cctcttcggt
541 gaagttttta aaagctgcta aagactcgga ggaagcaagg aaagtgcctg gtaggactga
601 cggctgcctt tgtcctcctc ctctccaccc cgcctccccc caccctgcct tccccccctc
661 ccccgtcttc tctcccgcag ctgcctcagt cggctactct cagccaaccc ccctcaccac
721 ccttctcccc acccgccccc ccgcccccgt cggcccagcg ctgccagccc gagtttgcag
781 agaggtaact ccctttggct gcgagcgggc gagctagctg cacattgcaa agaaggctct
841 taggagccag gcgactgggg agcggcttca gcactgcagc cacgacccgc ctggttaggc
901 tgcacgcgga gagaaccctc tgttttcccc cactctctct ccacctcctc ctgccttccc
961 caccccgagt gcggagccag agatcaaaag atgaaaaggc agtcaggtct tcagtagcca
1021 aaaaacaaaa caaacaaaaa caaaaaagcc gaaataaaag aaaaagataa taactcagtt
1081 cttatttgca cctacttcag tggacactga atttggaagg tggaggattt tgtttttttc
1141 ttttaagatc tgggcatctt ttgaatctac ccttcaagta ttaagagaca gactgtgagc
1201 ctagcagggc agatcttgtc caccgtgtgt cttcttctgc acgagacttt gaggctgtca
1261 gagcgctttt tgcgtggttg ctcccgcaag tttccttctc tggagcttcc cgcaggtggg
1321 cagctagctg cagcgactac cgcatcatca cagcctgttg aactcttctg agcaagagaa
1381 ggggaggcgg ggtaagggaa gtaggtggaa gattcagcca agctcaagga tg

taggagccag gcgactgggg agcggcttca gcactgcagc

6
 19/10/2020

2. Isolasi (Ekstraksi) DNA

• Definisi : proses pemurnian DNA dari sampel
menggunakan metode fisika dan kimia
• Tujuan : mendapatkan DNA genomik untuk
digunakan dalam pemeriksaan molekuler atau
forensik.
• Prinsip :
– Melisiskan sel, Menghilangkan lipid membran
– Menghilangkan protein dan RNA
– Presipitasi DNA

7
 19/10/2020

Isolasi (Ekstraksi) DNA

• Bahan :
– semua sel yang meiliki nukleus
• Kegunaan DNA genomik:
sebagai bahan yang digunakan untuk sbb:
– Identifikasi individu/Paternitas
– Deteksi polimorfisme
– Deteksi mutasi DNA
– Identifikasi mutasi DNA

Isolasi (Ekstraksi) DNA

8
 19/10/2020

Extraction/Precipitation Method

Before After After

Supernatant 70% EtOH

Centrifuge Wash Centrifuge

Pellet

Add alcohol and salt to
precipitate nucleic acids from
the aqueous fraction
Dissolve pellet
• Pellet down nucleic acids. (H2O, TE, etc.)
• Wash pellet with 70% ethanol to remove
residual salts and other contaminants.
• Discard ethanol and allow pellet to dry.

9
 19/10/2020

2. Memperbanyak fragmen DNA-PCR

Reaksi Penggandaan fragmen DNA terpilih, secara mesin, di mana
temperatur dan waktu tahap-tahap reaksinya dapat diatur berulang-
ulang (siklus).
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
Campuran reaksi t.a. :
 DNA utuh sebagai template ;
 Enzim Taq Polymerase ;
 Nukleotida deoksi : dATP, dTTP, dGTP, dCTP
 DNA Primer (2 jenis) ;
 buffer pelarut

AR gene ex 1, 841-880

5’
taggagccag gcgactgggg agcggcttca gcactgcagc 3’

(primer 2) cgtgacgtcg 5’

5’ taggagccag (primer 1)
3’ atcctcggtc ccgctgacccc tcgccgaagt cgtgacgtcg 5’

10
 19/10/2020

PCR tube+buffer

Primer 1 Primer 2 Taq Polimerase

Genomik DNA dNTPs

Mesin PCR

Mesin PCR

11
 19/10/2020

Pengaturan suhu dan waktu

Setiap siklus reaksi PCR terdiri dari

1. Denaturasi DNA pada suhu 95 C (2 mnt)

2. Penempelan DNA primer pada fragmen terpilih (Reannealing)
pada suhu 54 C (1-2 mnt)
3. Pemanjangan rantai DNA (Elongation) pada suhu 72 C (1-2 mnt)
Program untuk 25 -30 siklus reaksi

Amplification of DNA using the PCR technique.

12
 19/10/2020

Amplification of DNA using the PCR technique.

FIRST CYCLE SECOND CYCLE THIRD CYCLE

Producing 2 dsDNA molecules Producing 4 dsDNA molecules Producing 8 ds DNA molecules

Amplification of DNA using the PCR technique.

13
 19/10/2020

3. DNA Separation by Agarose Gel Electrophoresis

• DNA is negatively charged due to phosphates in its backbone and moves to

anode, the positive pole
– Small DNA pieces have little frictional drag so move rapidly
– Large DNAs have more frictional drag so their mobility is slower
– Result distributes DNA according to size
• Largest near the top
• Smallest near the bottom
• DNA is stained with fluorescent dye

3. DNA Separation by Agarose Gel Electrophoresis

14
 19/10/2020

Sanger Sequencing
• developed by Frederick Sanger and
his colleagues in 1977.
• Sanger DNA sequencing method
uses dideoxy nucleotides to
terminate DNA synthesis (ddNTPs)
• From the 80's to the mid-2000's,
Sanger sequencing dominated the
DNA sequencing platform, bringing
successful completion of the
Human Genome Project (HGP) in
2003.
December 10, 1980 British
Sanger first won the prize in 1958 for his biochemist Frederick Sanger (left)
work on the structure of proteins, receives his Nobel Prize for
notably insulin, and shared it with two Chemistry from Swedish King Carl
others in 1980 for pioneering Gustaf in Stockholm
developments in DNA sequencing

DNA elongation cannot occur with ddNTPs

15
 19/10/2020

Sanger Sequencing

https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-technique

DNA sequencing results

taggagccag gcgactgggg agcggcttca gcactgcagc

taggagccag gcgactggg agcggcttca gcactgcagc

16
 19/10/2020

SELAMAT BELAJAR

17