Kloning Gen

Teknologi DNA rekombinan =

Kloning gen, Rekayasa
genetika, Kloning molekuler
Prinsip dasar teknologi DNA rekombinan adalah
memasukkan suatu gen dari suatu organisme ke sel
host dengan tujuan memelihara gen tersebut
secara terus menerus dan dipelajari.

Langkah-langkah dalam kloning

DNA

Teknologi DNA rekombinan

Berkembang pada awal tahun 1980.
Berakar dari ilmu biokimia dan genetika.
Terjadi peningkatan pengetahuan yang
signifikan tentang dasar molekuler
penyakit-penyakit genetik pada manusia.
Diterapkan dalam bidang pertanian,
peternakan, kedokteran forensik, penelitian
penelitian dasar.

Enzim restriksi endonuklease

Teknologi DNA rekombinan tidak dapat
berjalan tanpa adanya enzim restriksi
endonuklease.
RE dapat memotong secara simetris ikatan
fosfodiester pada untai DNA yang
berlawanan pada situs spesifiknya.
Contoh: EcoRI
GAATTC
CTTAAG

Beberapa contoh enzim restriksi

Enzim
EcoRI

Sekuens
pengenalan
5-GAATTC-3
3-CTTAAG-5

Jenis ujung

End sequences

Sticky, 5 overhang

5-G AATTC-3
3-CTTAA G-5

BamHI

5-GGATCC-3
3-CCTAGG-5

Sticky, 5 overhang

5-G GATCC-3
3-CCTAG G-5

AluI

5-AGCT-3
3-TCGA-5

Blunt

5-AG
3-TC

PstI

5-CTGCAG-3
3-GACGTC-5

Sticky, 3overhang

5-CTGCA G-3
3-G ACGTC-5

CT-3
GA-5

Enzim
restriksi
endonuklease

Vektor kloning
Suatu wadah yang dipergunakan untuk
memperbanyak fragment DNA yang ingin
dipelajari, untuk transkripsi, invitro
mutagenesis, dan sekuensing DNA insert.
Terdiri dari beberapa macam: plasmid
(elemen bakteri ekstrakromosom yang
dapat bereplikasi sendiri), bakteriophage,
cosmid, YAC, dll.

Vektor

Plasmid pBR322

Syarat vektor kloning

Dapat dipelihara dan direplikasikan di dalam sel
host.
Mengandung banyak situs restriksi endonuklease
tunggal yang menyediakan pilihan situs insersi yang
memungkinkan.
Contoh: Pemotongan DNA sumber dan vektor
dengan enzim RE yang sama, disatukan dalam tube
yang sama, ditambahkan enzim T4 DNA ligase
DNA diinkorporasikan ke situs spesifik.
Membawa gen resisten terhadap antibiotik
tertentu.

PCR
Metoda untuk memperbanyak fragmen
DNA dari gen tertentu secara in
vitro.
Terdiri dari 3 siklus: denaturasi,
annealing, dan elongasi.
Membutuhkan enzim DNA polymerase
khusus yang tahan terhadap
temperatur tinggi (Taq polymerase).

Polymerase chain reaction

PCR

Aplikasi Teknologi DNA

Rekombinan

Terapi Gen

DNA Fingerprint

Menghasilkan Tanaman Unggul

Basic Research